第九章DNA序列分析 核酸DNA分子一级结构的测定，是现代分子生物学一 项重要的技术，该技术的产生与PAGE胶的发展分不 开。 >目前测序的方法： 化学降解法 >末端终止法 DNA测序自动化 1/92
1/92 第九章 DNA序列分析 ➢ 核酸DNA分子一级结构的测定，是现代分子生物学一 项重要的技术，该技术的产生与PAGE胶的发展分不 开。 ➢ 目前测序的方法： ➢ 化学降解法 ➢ 末端终止法 ➢ DNA测序自动化
第一节化学降解法 化学裂解法：是Maxam和Gilberts等人1977年创建 的，该方法是用化学试剂特异性修饰不同碱基，并 在相应碱基处特定地裂解DNA片段，产生一簇各种 长度的短链（等差数列n=1),经过PAGE和放射 自显影后，可以直接读出DNA的顺序。 圈 圈 2192
2/92 第一节 化学降解法 化学裂解法：是Maxam和Gilbert等人1977年创建 的，该方法是用化学试剂特异性修饰不同碱基，并 在相应碱基处特定地裂解DNA片段，产生一簇各种 长度的短链（等差数列 n=1），经过PAGE和放射 自显影后，可以直接读出DNA的顺序
一、基本原理 一个末端标记的DNA片段在4组互相独立的化学反应中分 别得到部分降解，其中每一组反应特异的针对某一种或 某一类碱基。因此生成4组放射性标记的分子，从共同起 点（放射性标记末端）延续到发生化学降解的位点。 ■由于每个化学反应体系中，化学试剂对DNA分子上某一 类碱基的降解是随机的，因此，每组混合物中均含有长 短不一的DNA分子，其长度取决于该组反应所针对的碱 基在原DNA全片段上位置。 此后，各组均通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，再通 过放射自显影来检测末端标记的分子。 3/92
3/92 一、基本原理 ▪ 一个末端标记的DNA片段在4组互相独立的化学反应中分 别得到部分降解，其中每一组反应特异的针对某一种或 某一类碱基。因此生成4组放射性标记的分子，从共同起 点（放射性标记末端）延续到发生化学降解的位点。 ▪ 由于每个化学反应体系中，化学试剂对DNA分子上某一 类碱基的降解是随机的，因此，每组混合物中均含有长 短不一的DNA分子，其长度取决于该组反应所针对的碱 基在原DNA全片段上位置。 ▪ 此后，各组均通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，再通 过放射自显影来检测末端标记的分子
化学裂解法测序原理 5'HO-GATCGGACCT 3 单墙放射同位亲标记 〔此例为了一末端标记) 5 PGATOGGACCT 3 下完全修命 锋饰G 修饰G和A 修饰T和C 修饰C 化学裂解 电泳分离 G+A T++C 电 金长核酸 周 "IGATCGGACC 泳 PGATOGGAC C☒ PGATCGGAC 方 POATOGG区四 PGATCG MPGATC G PGAT C] PGA□ PG因 p国 图 口表示被修饰碱基及断裂位世 4/92
4/92 4/95 化学裂解法测序原理
二、基本步骤 1. 限制酶消化待测DNA,得到长度为100-200bp的一组片段，纯化 回收每1个片段作为测序材料。 2. 碱性磷酸酶处理消除5'磷酸。 3. 多核苷酸酶催32 PdNTP:标记(5'-OH)末端。 4. 使标记片段变性为单链。 5. 分成4个反应体系，进行化学处理，严格控制反应条件。（使得平 均每1个DNA分子只有1个位置被断裂，这种断裂是随机的，如G 反应，则在DNA链上任意位置G断裂。这样，每个反应中虽然都 在同一核苷酸处断裂DNA链，但由于碱基位置不同，产生组不同 长度的DNA片段。其长度可由几个核苷酸到接近待测DNA全长。 6. 电泳 7. 放射自显影 8. 4个反应管统一阅读，DNA4个碱基每个位置都有一个相应的片段， 待测DNA全部核苷酸序列就可直接读出。 5/92
5/92 二、基本步骤 1. 限制酶消化待测DNA，得到长度为100-200bp的一组片段，纯化 回收每1个片段作为测序材料。 2. 碱性磷酸酶处理消除5’磷酸。 3. 多核苷酸酶催32PdNTP标记（5’-OH）末端。 4. 使标记片段变性为单链。 5. 分成4个反应体系，进行化学处理，严格控制反应条件。（使得平 均每1个DNA分子只有1个位置被断裂，这种断裂是随机的，如G 反应，则在DNA链上任意位置G断裂。这样，每个反应中虽然都 在同一核苷酸处断裂DNA链，但由于碱基位置不同，产生1组不同 长度的DNA片段。其长度可由几个核苷酸到接近待测DNA全长。 6. 电泳 7. 放射自显影 8. 4个反应管统一阅读，DNA4个碱基每个位置都有一个相应的片段， 待测DNA全部核苷酸序列就可直接读出