IPTG Induction IPTG Induction E.coli RNA T7 RNA polymerase polymerase T7 gene 1 Target gene T7 RNA polymerase laco laco lac promoter 7promoter INACTIVE DE3 lac lac repressor repressor PET lac I gene lac I gene T7 lysosyme T7 lysozyme gene E.coli genome HOST CELL > 溶菌酶的高水平表达能有效的抑制T7 RNA POlE的活性，减少 未诱导下目的基因表达。 >Iacl的产物抑制RNA pol,启动下游基因的转录。 2/85
2/85 ➢溶菌酶的高水平表达能有效的抑制T7RNA pol的活性，减少 未诱导下目的基因表达。 ➢lacI的产物抑制RNA pol启动下游基因的转录
第六章大分子的分离与分析 第一节：质粒DNA的提取，碱变性法 第二节：RNA的分离，关键是控制Rnase 第三节：分子杂交 第四节：RNA作图 第五节：转化 3/85
3/85 第六章 大分子的分离与分析 第一节：质粒DNA的提取，碱变性法 第二节：RNA的分离，关键是控制Rnase 第三节：分子杂交 第四节：RNA作图 第五节：转化
第一节DNA的分离、检测和纯化 质粒DNA的小量提取 碱变性法； 煮沸法； 刷 刷 4/85
4/85 质粒DNA的小量提取 第一节 DNA的分离、检测和纯化 碱变性法； 煮沸法；
碱变性法提取质粒的基本原理 碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体DNA变性，而 共价闭环质粒DNA变性后因拓扑结构纠缠在一起。 ·将PH调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染色体 DNA之间交联形成不溶性网状结构，大部分DNA和蛋白 质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA复性， 恢复为可溶状态，通过离心可除去大部分细胞碎片、染 色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，再 冠 用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。 5/85
5/85 碱变性法提取质粒的基本原理 ▪ 碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体DNA变性，而 共价闭环质粒DNA变性后因拓扑结构纠缠在一起。 ▪ 将PH调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染色体 DNA之间交联形成不溶性网状结构，大部分DNA和蛋白 质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA复性， 恢复为可溶状态，通过离心可除去大部分细胞碎片、染 色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，再 用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA
NaOH是最佳溶解细胞的试剂。 作用： ■使细胞膜发生了从bilayer（双层膜)结构向micelle (微囊)结构的相变化，破坏细胞释放DNA。 ■当pH>12或pH<3时，就会引起双链之间氢键的解离 而变性。 6/85
6/85 作用: ◼使细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle （微囊）结构的相变化，破坏细胞释放DNA。 ◼当pH＞12或pH＜3时，就会引起双链之间氢键的解离 而变性。 NaOH是最佳溶解细胞的试剂