第九章维生素类药物的分析 [教学目的 、掌握维生素A、B、C、D、E的结构、性质和鉴别、检查、含量测定方法。 、熟悉本类药物其它的含量测定方法以及杂质检査方法 了解维生素A三点校正法的推导过程。 [本章分配学时数]2学时 [教学环节与教学内容 [复习引入]2分钟 在上节课,我们进行了杂环类药物的分析,要求同学们通过上一章的学习不 仅要掌握吡啶类、喹啉类、托烷类、吩噻嗪类、苯并二氮杂卓类药物的鉴别和含 量测定的基本原理与方法,熟悉本类药物中典型药物国外药典收载的鉴别和含量 测定方法,还要了解本类药物的体内分析方法。那么,这节课我们就要对维生素 类药物进行分析,经过本章的学习后,要求同学们不仅要掌握维生素A、B1、C、 D、E的结构、性质和鉴别、检査、含量测定方法,熟悉本类药物其它的含量测 定方法以及杂质检查方法,还要了解维生素A三点校正法的推导过程 [教授新课] 维生素( vitamins)是维持人类机体正常代谢功能所必需的一类活性物质, 主要用于机体的能量转移和代谢调节,体内不能自行合成,须从食物中摄取。 从化学结构上看,都是有机物,但并非同属一类化合物,有醇、酯、酸、胺、 酚和醛。按其溶解度可分为脂溶性维生素和水溶性维生素。 第一节维生素A的分析 维生素A包括有维生素A1、去氢维生素A(A2)和去水维生素(A3)。其中A 活性最高,A2是A1的30%~40%,A3是A的0.4%。通常所说的维生素A是指维 生素A。维生素A是一种不饱和脂肪醇,在自然界中主要来自鲛类无毒海鱼肝 脏中提取的脂肪油(鱼肝油),目前主要采用人工合成方法制取。在鱼肝油中维 生素A多以各种酯类混合物的形式存在,其中主要为醋酸酯和棕榈酸酯。 、结构与性质 (一)结构
- 1 - 第九章 维生素类药物的分析 [教学目的] 一、掌握维生素 A、B1、C、D、E 的结构、性质和鉴别、检查、含量测定方法。 二、熟悉本类药物其它的含量测定方法以及杂质检查方法。 三、了解维生素 A 三点校正法的推导过程。 [本章分配学时数] 2 学时 [教学环节与教学内容] [复习引入] 2 分钟 在上节课，我们进行了杂环类药物的分析，要求同学们通过上一章的学习不 仅要掌握吡啶类、喹啉类、托烷类、吩噻嗪类、苯并二氮杂卓类药物的鉴别和含 量测定的基本原理与方法，熟悉本类药物中典型药物国外药典收载的鉴别和含量 测定方法，还要了解本类药物的体内分析方法。那么，这节课我们就要对维生素 类药物进行分析，经过本章的学习后，要求同学们不仅要掌握维生素 A、B1、C、 D、E 的结构、性质和鉴别、检查、含量测定方法，熟悉本类药物其它的含量测 定方法以及杂质检查方法，还要了解维生素 A 三点校正法的推导过程。 [教授新课] 维生素（vitamins）是维持人类机体正常代谢功能所必需的一类活性物质， 主要用于机体的能量转移和代谢调节，体内不能自行合成，须从食物中摄取。 从化学结构上看，都是有机物，但并非同属一类化合物，有醇、酯、酸、胺、 酚和醛。按其溶解度可分为脂溶性维生素和水溶性维生素。 第一节 维生素 A 的分析 维生素 A 包括有维生素 A1、去氢维生素 A（A2）和去水维生素（A3）。其中 A1 活性最高，A2是 A1的 30％～40％，A3是 A1的 0.4%。通常所说的维生素 A 是指维 生素 A1。维生素 A1 是一种不饱和脂肪醇，在自然界中主要来自鲛类无毒海鱼肝 脏中提取的脂肪油（鱼肝油），目前主要采用人工合成方法制取。在鱼肝油中维 生素 A1多以各种酯类混合物的形式存在，其中主要为醋酸酯和棕榈酸酯。 一、 结构与性质 （一） 结构
维生素A的结构为具有一个共轭多烯醇侧链的环已烯,因而具有许多立 体异构体,共轭多烯结构具有紫外吸收,可采用紫外吸收光谱法进行鉴别, 采用紫外分光光度法进行含量测定。天然维生素A主要是全反式维生素A, 尚有多种其它异构体,R不同则可以是维生素A醇或其酯,见表9-1,临床 上多用其醋酸酯和棕榈酸酯。其它异构体具有相似的化学性质,但各具不同 的光谱特性和生物效价,见表9-2。 ∠CHOR CH (二)性质 1.溶解性 与氯仿、乙醚、环已烷或石油醚能任意混合,在乙醇中微溶,在水中不 2.不稳定性 维生素A中有多个不饱和键,性质不稳定,易被空气中氧或氧化剂氧化, 易被紫外光裂解,特别在加热和金属离子存在时,更易氧化变质,生成 无生物活性的环氧化合物维生素A醛或维生素A酸。因此,维生素A及 其制剂除需密封在凉暗处保存外,还需充氮或加入合适的抗氧剂。 3.紫外吸收特性 维生素A分子中具有共轭多烯醇的侧链结构,在325nm~328nm的范围 内有最大吸收,可用于鉴别和含量测定 4.与三氯化锑呈色 维生素A在氯仿中能与三氯化锑试剂作用,产生不稳定的蓝色。可以此 进行鉴别或用比色法测定含量。 鉴别试验 (一)三氯化锑反应(Carr- Price反应) 1.原理 维生素A在饱和无水三氯化锑的无醇氯仿溶液中即显蓝色,渐变成紫红 色。其机制为维生素A和氯化锑(Ⅲ中存在的亲电试剂氯化高锑(V)
- 2 - 维生素 A 的结构为具有一个共轭多烯醇侧链的环已烯，因而具有许多立 体异构体，共轭多烯结构具有紫外吸收，可采用紫外吸收光谱法进行鉴别， 采用紫外分光光度法进行含量测定。天然维生素 A 主要是全反式维生素 A， 尚有多种其它异构体，R 不同则可以是维生素 A 醇或其酯，见表 9-1，临床 上多用其醋酸酯和棕榈酸酯。其它异构体具有相似的化学性质，但各具不同 的光谱特性和生物效价，见表 9-2。 CH2OR CH3 3 CH3 CH CH3 CH3 （二） 性质 1. 溶解性 与氯仿、乙醚、环已烷或石油醚能任意混合，在乙醇中微溶，在水中不 溶。 2. 不稳定性 维生素 A 中有多个不饱和键，性质不稳定，易被空气中氧或氧化剂氧化， 易被紫外光裂解，特别在加热和金属离子存在时，更易氧化变质，生成 无生物活性的环氧化合物维生素 A 醛或维生素 A 酸。因此，维生素 A 及 其制剂除需密封在凉暗处保存外，还需充氮或加入合适的抗氧剂。 3. 紫外吸收特性 维生素 A 分子中具有共轭多烯醇的侧链结构，在 325nm～328nm 的范围 内有最大吸收，可用于鉴别和含量测定。 4. 与三氯化锑呈色 维生素 A 在氯仿中能与三氯化锑试剂作用，产生不稳定的蓝色。可以此 进行鉴别或用比色法测定含量。 二、 鉴别试验 （一） 三氯化锑反应（Carr-Price 反应） 1. 原理 维生素 A 在饱和无水三氯化锑的无醇氯仿溶液中即显蓝色，渐变成紫红 色。其机制为维生素 A 和氯化锑（Ⅲ）中存在的亲电试剂氯化高锑（Ⅴ）
作用形成不稳定的蓝色碳正离 2.注意事项 反应需在无水、无醇条件下进行。因为水可使三氯化锑水解成氯化氧锑, 而乙醇可以和碳正离子作用使其正电荷消失。所以仪器和试剂必须干燥 无水,氯仿中必须无醇。 (二)紫外吸收光谱法 在300n~400nm的波长范围内进行扫描,应仅在326nm的波长处有单 的吸收峰,经水浴加热30s,则应在348、367和389nm的波长处有三 个尖锐的吸收峰 (三)薄层色谱法 比较供试品溶液和对照品溶液所显蓝色斑点位置。 三、含量测定 紫外分光光度法:维生素A法定的含量测定方法 三氯化锑比色法:反应专属性差、呈色极不稳定,但由于操作较为简便、 快速,目前仍为食品或饲料中维生素A含量测定的常用方法 (一)紫外分光光度法(三点校正法) 1.为何要采用三点校正法? 维生素A原料药中常混有杂质,如维生素A2、维生素A3、维生素A的氧 化产物、鲸醇以及维生素A的异构体,这些杂质在维生素A的最大吸收 波长附近有吸收,以致在维生素A的最大吸收波长处测定的吸收度并非 是维生素A所独有的吸收,干扰维生素A的测定。采用三点校正法可以 消除这些杂质的干扰 2.测定原理 本法是在三个波长处测得吸收度,根据校正公式计算吸收度A校正值后, 再计算含量,故本法称为“三点校正法” (1)杂质的无关吸收在310nm~340nm的波长范围内几乎呈一条直线, 且随波长的增大吸收度下降。 (2)物质对光吸收呈加和性的原理。即在某一样品的吸收曲线上,各 波长处的吸收度是维生素A与杂质吸收度的代数和,因而吸收曲
- 3 - 作用形成不稳定的蓝色碳正离子。 2. 注意事项 反应需在无水、无醇条件下进行。因为水可使三氯化锑水解成氯化氧锑， 而乙醇可以和碳正离子作用使其正电荷消失。所以仪器和试剂必须干燥 无水，氯仿中必须无醇。 （二） 紫外吸收光谱法 在 300nm～400nm 的波长范围内进行扫描，应仅在 326nm 的波长处有单 一的吸收峰，经水浴加热 30s，则应在 348、367 和 389nm 的波长处有三 个尖锐的吸收峰。 （三） 薄层色谱法 比较供试品溶液和对照品溶液所显蓝色斑点位置。 三、 含量测定 紫外分光光度法：维生素 A 法定的含量测定方法 三氯化锑比色法：反应专属性差、呈色极不稳定，但由于操作较为简便、 快速，目前仍为食品或饲料中维生素 A 含量测定的常用方法。 （一） 紫外分光光度法（三点校正法） 1. 为何要采用三点校正法？ 维生素 A 原料药中常混有杂质，如维生素 A2、维生素 A3、维生素 A 的氧 化产物、鲸醇以及维生素 A 的异构体，这些杂质在维生素 A 的最大吸收 波长附近有吸收，以致在维生素 A 的最大吸收波长处测定的吸收度并非 是维生素 A 所独有的吸收，干扰维生素 A 的测定。采用三点校正法可以 消除这些杂质的干扰。 2. 测定原理 本法是在三个波长处测得吸收度，根据校正公式计算吸收度 A 校正值后， 再计算含量，故本法称为“三点校正法”。 （1） 杂质的无关吸收在 310nm～340nm 的波长范围内几乎呈一条直线， 且随波长的增大吸收度下降。 （2） 物质对光吸收呈加和性的原理。即在某一样品的吸收曲线上，各 波长处的吸收度是维生素 A 与杂质吸收度的代数和，因而吸收曲
线也是二者吸收的叠加。 .波长选择 点选在维生素A的最大吸收波长处(A1),其它两点选在1的两侧各 选一点(λ2和λ3) (1)第一法(等波长差法):使λ3-λ1=λr-λ2。中国药典规定,测 定维生素A醋酸酯时,λ=328nm,λ2=316nm,λ3=340nm,△A 12nm。 (2)第二法(等吸收比法):使Ax2=Ak3=6/7A。中国药典规定,测定 维生素A醇时,N=325nm、2=310nm、A3=334nm 4.杂质的吸收 (1)维生素A2和维生素A:维生素A2在345nm~350nm波长范围内有 吸收。 (2)维生素A的氧化产物:环氧化物、维生素A醛和维生素A酸 (3)维生素A在光照下产生的无活性的聚合物:鲸醇。 (4)维生素A的异构体等。 以上这些杂质在310n~340nm的波长范围内有吸收,所以干扰维生 素A的测定。因此,在测定维生素A的含量时,必须排除这些杂质的干 扰,三点校正法即可消除这些杂质的影响。 5.测定方法 首先判断用哪个吸收度进行含量计算 第一法:供试液浓度为9~15IU/ml,溶剂为环己烷,在300、316、 328、340、360nm五个波长处测定吸收度 1)如果最大吸收波长在326~329m之间,计算吸收度比值A/A2s,并 与规定值相减,差值不超过±0.02,则用A3s计算含量: E Icn=A/CL IU/g=Ea×1900 A×D×1900×W 标示量%= ×100% W×100×L×标示量 2)如果最大吸收波长在326~329nm之间,5个波长下的差值有一个或
- 4 - 线也是二者吸收的叠加。 3. 波长选择 一点选在维生素 A 的最大吸收波长处（λ1），其它两点选在λ1的两侧各 选一点（λ2和λ3） （1） 第一法（等波长差法）：使λ3-λ1＝λ1-λ2。中国药典规定，测 定维生素 A 醋酸酯时，λ1=328nm，λ2=316nm，λ3=340nm，△λ ＝12nm。 （2） 第二法（等吸收比法）：使 Aλ2=Aλ3=6/7Aλ1。中国药典规定，测定 维生素 A 醇时，λ1=325nm、λ2=310nm、λ3=334nm。 4. 杂质的吸收 （1） 维生素 A2和维生素 A3：维生素 A2在 345nm～350nm 波长范围内有 吸收。 （2） 维生素 A 的氧化产物：环氧化物、维生素 A 醛和维生素 A 酸。 （3） 维生素 A 在光照下产生的无活性的聚合物：鲸醇。 （4） 维生素 A 的异构体等。 以上这些杂质在 310nm～340nm 的波长范围内有吸收，所以干扰维生 素 A 的测定。因此，在测定维生素 A 的含量时，必须排除这些杂质的干 扰，三点校正法即可消除这些杂质的影响。 5. 测定方法 首先判断用哪个吸收度进行含量计算。 第一法：供试液浓度为 9～15IU/ml，溶剂为环己烷，在 300、316、 328、340、360nm 五个波长处测定吸收度。 1）如果最大吸收波长在 326～329nm 之间，计算吸收度比值 Ai /A328，并 与规定值相减，差值不超过±0.02，则用 A328计算含量： E 1cm 1% =A/CL IU/g = E 1cm 1%× 1900 A×D×1900×W 标示量% = ------------------- ×100% W×100×L×标示量 2）如果最大吸收波长在 326～329nm 之间，5 个波长下的差值有一个或
几个超过士0.02,这时先计算A2(校正): A2(校正)=3.52(2Aa8-A16-A3和) Aa(校正)-A3s 再计算 ×100% 若所得的数值在±3%之间,则仍用As计算含量 若所得的数值在-15%~-3%之间,则需用A8(校正)计算含量; 若所得的数值小于-15%或大于+3%,或最大吸收波长不在326~329nm之间, 则应采用第二法(皂化法)测定。 6.讨论 1)维生素A醋酸酯的吸收度校正公式是用直线方程式法(即代数法)推导 而来:维生素A醇的吸收度校正公式是用相似三角形法(几何法或6/7 定位法)推导而来 2)在应用三点校正法时,除其中一点在最大吸收波长处测定外,其余两点 均在最大吸收峰的两侧进行测定。如果仪器波长精度不准确时,会产生 较大误差。因此,在测定前务必要校正波长,并可用全反式维生素A进 行测定,比较测定结果和比值是否与对照品相符合,以进一步核对仪器 波长是否准确。测定的样品应不得少于两份。 3)中国药典(2000年版)收载的维生素A胶丸、维生素AD滴剂、维生素 AD胶丸等均采用三点校正法测定。 (二)三氯化锑比色法 .原理 维生素A与三氯化锑的无水氯仿溶液作用,产生不稳定的蓝色,在 618nm~620nm的波长处有最大吸收,符合Beer定律 2.方法 见教材P214。 3.注意事项 (1)本法产生的蓝色不稳定,要求操作迅速,一般规定加入三氯化锑后 应在5s~10s内测定。 (2)反应介质需无水,否则使三氯化锑水解产生Sb0C1而使溶液混浊
- 5 - 几个超过±0.02，这时先计算 A328（校正）： A328（校正）=3.52（2 A328 - A316 - A340） A328（校正）- A328 再计算 ------------------×100% A328 若所得的数值在±3%之间，则仍用 A328计算含量； 若所得的数值在-15%～-3%之间，则需用 A328（校正）计算含量； 若所得的数值小于-15%或大于+3%，或最大吸收波长不在 326～329nm 之间， 则应采用第二法（皂化法）测定。 6. 讨论 1）维生素 A 醋酸酯的吸收度校正公式是用直线方程式法（即代数法）推导 而来：维生素 A 醇的吸收度校正公式是用相似三角形法（几何法或 6/7 定位法）推导而来。 2）在应用三点校正法时，除其中一点在最大吸收波长处测定外，其余两点 均在最大吸收峰的两侧进行测定。如果仪器波长精度不准确时，会产生 较大误差。因此，在测定前务必要校正波长，并可用全反式维生素 A 进 行测定，比较测定结果和比值是否与对照品相符合，以进一步核对仪器 波长是否准确。测定的样品应不得少于两份。 3）中国药典（2000 年版）收载的维生素 A 胶丸、维生素 AD 滴剂、维生素 AD 胶丸等均采用三点校正法测定。 （二） 三氯化锑比色法 1. 原理 维生素 A 与三氯化锑的无水氯仿溶液作用，产生不稳定的蓝色，在 618nm～620nm 的波长处有最大吸收，符合 Beer 定律。 2. 方法 见教材 P214。 3. 注意事项 （1） 本法产生的蓝色不稳定，要求操作迅速，一般规定加入三氯化锑后 应在 5s～10s 内测定。 （2） 反应介质需无水，否则使三氯化锑水解产生 SbOCl 而使溶液混浊