附录重要的实验方法 、液体化合物的分离与提纯方法 有机合成产生的液体化合物其分离纯化一般采用蒸馏的方法。根据 待分离组分和理化性性质的不同,蒸馏可以分为简单蒸馏和精馏(分 馏);根据装置系统内的压力不同又可分为常压和减压蒸馏。对于沸点 差极小的组分分离或对产物纯度要求极高的分离,则可应用高真空技 术。参见《有机化学实验》。 二、固体化合物的提纯方法 化学合成药物的纯度和质量是关系到人身安危的重大问题。为了获 得高纯度的药品,对最终成品及关键中间体必须进行提纯和精制。固体 物质一般采用结晶(重结晶、分级结晶等)或升华的方法进行纯化。参 见《有机化学实验》。 三、常用色谱方法 色谱(又称层析)是一种物理的分离方法。它的分离原理是使混合 物中各组分在两相间进行分配,其中一相是不动的,称为固定相,另 相是携带混合物流过此固定相的流体,称为流动相。当流动相中所含混 合物经过固定相时,就会与固定相发生作用。由于各组分在性质和结构 上有差异,与固定相发生作用的大小、强弱也有差异,因此在同一推动 力作用下,不同组分在固定相中的滞留时间有长有短,从而按先后不同 的次序从固定相中流出。这种借助在两相间分配差异而使混合物中各组 分分离的技术,称为色谱法 (一)薄层色谱 薄层色谱(∏LC)是一种简单实用的实验技术,属固液层析。 一般薄层色谱的固定相是硅胶或氧化铝,属吸附层析。在层析过程 中,吸附剂对样品中各组分的吸附力不同,当展开剂流过时,各组分被 展开剂从吸附剂上解析下来的难易程度不同,从而造成各组分移动时的
1 附录 重要的实验方法 一、液体化合物的分离与提纯方法 有机合成产生的液体化合物其分离纯化一般采用蒸馏的方法。根据 待分离组分和理化性性质的不同，蒸馏可以分为简单蒸馏和精馏（分 馏）；根据装置系统内的压力不同又可分为常压和减压蒸馏。对于沸点 差极小的组分分离或对产物纯度要求极高的分离，则可应用高真空技 术。参见《有机化学实验》。 二、固体化合物的提纯方法 化学合成药物的纯度和质量是关系到人身安危的重大问题。为了获 得高纯度的药品，对最终成品及关键中间体必须进行提纯和精制。固体 物质一般采用结晶（重结晶、分级结晶等）或升华的方法进行纯化。参 见《有机化学实验》。 三、常用色谱方法 色谱（又称层析）是一种物理的分离方法。它的分离原理是使混合 物中各组分在两相间进行分配，其中一相是不动的，称为固定相，另一 相是携带混合物流过此固定相的流体，称为流动相。当流动相中所含混 合物经过固定相时，就会与固定相发生作用。由于各组分在性质和结构 上有差异，与固定相发生作用的大小、强弱也有差异，因此在同一推动 力作用下，不同组分在固定相中的滞留时间有长有短，从而按先后不同 的次序从固定相中流出。这种借助在两相间分配差异而使混合物中各组 分分离的技术，称为色谱法。 （一）薄层色谱 薄层色谱（TLC）是一种简单实用的实验技术，属固液层析。 一般薄层色谱的固定相是硅胶或氧化铝，属吸附层析。在层析过程 中，吸附剂对样品中各组分的吸附力不同，当展开剂流过时，各组分被 展开剂从吸附剂上解析下来的难易程度不同，从而造成各组分移动时的
速度差别,而达到分离的目的。 薄层色谱可以用来分离混合物、鉴定精制化合物、测量混合物中各 组分的含量、测定样品纯度。其展开时间短,几十分钟就能达到分离目 的,分离效率高,还可用制备板分离几毫克到几百毫克的样品。在药 物合成实验中,还常用来跟踪反应进程和确定反应的终点。薄层色谱特 别适用于挥发性小的化合物以及在高温下化学性质不稳定的化合物的 分析。 (二)柱层析色谱 柱层析色谱是通过层析柱来实现分离的,主要用于大量化合物的分 离。层析柱内装有固体吸附剂,也就是固定相,如氧化铝或硅胶等。液 体样品从柱顶加入,在柱的顶部被吸附剂吸附,然后从柱的顶部加入有 机溶剂也就是展开剂进行洗脱。由于吸附剂对各组分的吸附能力不同, 各组分以不同速度下移,被吸附较弱的组分在流动相里的含量较高,以 较快的速度下移。各组分随溶剂按一定顺序从层析柱下端流处,分段收 集流出液,再用薄层色谱来鉴定各组分。 柱层析的分离条件可以套用该样品的薄层色谱条件,分离效果亦相 同 (三)纸层析色谱 纸层析是以滤纸为载体,用一定的溶剂系统展开而达到分离、分析 目的的层析方法。此法可用于定性,亦可用于分离制备微量样品。纸层 析的原理是分配层析。滤纸是载体,水为固定相,展开剂为流动相。试 样在固定相水与流动相展开剂之间连续抽提,依靠溶质在两相间的分配 系数不同而达到分离的目的。物质在两相之间有固定的分配系数,在纸 层析色谱上也有固定的比移值。 纸层析色谱法的一般操作时,将待试样品溶于适当溶剂,点样于滤 纸一端,另用适当挑选的溶剂系统,从点样的一端通过毛细现象向另 端展开。展开完毕,滤纸取出阴干,以适当显色剂显色,即得纸层析色 谱。样品层析往往用比移值Rr来表示某一化合物在纸层析色谱中的位
2 速度差别，而达到分离的目的。 薄层色谱可以用来分离混合物、鉴定精制化合物、测量混合物中各 组分的含量、测定样品纯度。其展开时间短，几十分钟就能达到分离目 的，分离效率高， 还可用制备板分离几毫克到几百毫克的样品。在药 物合成实验中，还常用来跟踪反应进程和确定反应的终点。薄层色谱特 别适用于挥发性小的化合物以及在高温下化学性质不稳定的化合物的 分析。 （二）柱层析色谱 柱层析色谱是通过层析柱来实现分离的，主要用于大量化合物的分 离。层析柱内装有固体吸附剂，也就是固定相，如氧化铝或硅胶等。液 体样品从柱顶加入，在柱的顶部被吸附剂吸附，然后从柱的顶部加入有 机溶剂也就是展开剂进行洗脱。由于吸附剂对各组分的吸附能力不同， 各组分以不同速度下移，被吸附较弱的组分在流动相里的含量较高，以 较快的速度下移。各组分随溶剂按一定顺序从层析柱下端流处，分段收 集流出液，再用薄层色谱来鉴定各组分。 柱层析的分离条件可以套用该样品的薄层色谱条件，分离效果亦相 同。 （三）纸层析色谱 纸层析是以滤纸为载体，用一定的溶剂系统展开而达到分离、分析 目的的层析方法。此法可用于定性，亦可用于分离制备微量样品。纸层 析的原理是分配层析。滤纸是载体，水为固定相，展开剂为流动相。试 样在固定相水与流动相展开剂之间连续抽提，依靠溶质在两相间的分配 系数不同而达到分离的目的。物质在两相之间有固定的分配系数，在纸 层析色谱上也有固定的比移值。 纸层析色谱法的一般操作时，将待试样品溶于适当溶剂，点样于滤 纸一端，另用适当挑选的溶剂系统，从点样的一端通过毛细现象向另一 端展开。展开完毕，滤纸取出阴干，以适当显色剂显色，即得纸层析色 谱。样品层析往往用比移值 Rf 来表示某一化合物在纸层析色谱中的位
置 (四)高效液相色谱 高效液相色谱(HPLC)是一种具有高灵敏度、高选择性的高效、 快速分离分析技术,广泛应用于医药分析的各个领域。在药品质量控制 如主要成分的定性定量分析、杂质的限量检査和测定、稳定性考察等、 药物合成反应的监测、药物体内过程和代谢动力学研究、中药的成分研 究及人体内源活性物质的测定中,HPLC都是重要的分析手段。 例如,β-肾上腺素受体拮抗剂类药物均为手性分子的外消旋体,其 对映异构体的药效学差异显著。近年来在这些药物的对映体选择性 HPLC分析方法研究上取得了令人瞩目的进展。常见的HPLC手性拆分 方法有手性固定相直接拆分法、手性试剂衍生化法和手性流动相添加 例如,采用柱前衍生化测定普萘洛尔对映体: 1.色谱条件: 色谱柱: Micro Pak sp C&柱(15mm×14mm) 流动相:醋酸钠(0.02mol/L,pH4.0)一乙腈(30.70) 流速:2mL/min 检测:荧光,265nm/345nm 2.样品测定:样品经硼酸磷酸二氢钠缓冲液(0.10mol/L,pH用 氢氧化钠调至8.5)稀释,混合后取样品溶液20μ,加入(+)-1-(9 芴基)-乙基甲酰氯(FLEC)衍生化试剂20u,反应10min后,取10 uL进样。保留时间:(-)-普萘洛尔衍生物为6.549min:(+)-普萘洛 尔衍生物为7070min:FLEC为121min。 四、光学异构药物的拆分 药物的立体结构与生物活性密切相关。含手性中心的药物,其对映 体之间的生物活性往往有很大的差异。研究表明药物立体异构体药效差 异的主要原因是他们与受体结合的差异 近年来人们对光学异构体间的药效有了长足的认识,以单一异构体
3 置。 （四）高效液相色谱 高效液相色谱（HPLC）是一种具有高灵敏度、高选择性的高效、 快速分离分析技术，广泛应用于医药分析的各个领域。在药品质量控制 如主要成分的定性定量分析、杂质的限量检查和测定、稳定性考察等、 药物合成反应的监测、药物体内过程和代谢动力学研究、中药的成分研 究及人体内源活性物质的测定中，HPLC 都是重要的分析手段。 例如，β-肾上腺素受体拮抗剂类药物均为手性分子的外消旋体，其 对映异构体的药效学差异显著。近年来在这些药物的对映体选择性 HPLC 分析方法研究上取得了令人瞩目的进展。常见的 HPLC 手性拆分 方法有手性固定相直接拆分法、手性试剂衍生化法和手性流动相添加 法。 例如，采用柱前衍生化测定普萘洛尔对映体： 1. 色谱条件： 色谱柱：Micro Pak SP C8 柱（15 mm×14 mm） 流动相：醋酸钠（0.02 mol / L，pH 4.0）—乙腈（30:70） 流速：2 mL / min 检测：荧光，265 nm / 345nm。 2. 样品测定：样品经硼酸-磷酸二氢钠缓冲液（0.10 mol / L，pH 用 氢氧化钠调至 8.5）稀释，混合后取样品溶液 20 µL，加入（+）-1-（9- 芴基）-乙基甲酰氯（FLEC）衍生化试剂 20 µL，反应 10 min 后，取 10 µL 进样。保留时间：（-）-普萘洛尔衍生物为 6.549 min；（+）-普萘洛 尔衍生物为 7.070 min；FLEC 为 12.1 min。 四、光学异构药物的拆分 药物的立体结构与生物活性密切相关。含手性中心的药物，其对映 体之间的生物活性往往有很大的差异。研究表明药物立体异构体药效差 异的主要原因是他们与受体结合的差异。 近年来人们对光学异构体间的药效有了长足的认识，以单一异构体
供药用已引起各方面的重视,今后的新药研制将日益朝着单一对应体药 物的方向发展。 对应异构体的药物一般可以通过不对称合成或拆分方法得到。然而 就目前医药工业生产而言,尚未有成熟的不对称合成方法用于药物的大 量生产,因此,拆分仍然是获得手性药物的重要方法。常用的光学异构 药物的拆分方法与拆分原理包括 (一)播种结晶法 在外消旋体的饱和溶液中加入其中一种纯的单一光学异构体(左旋 或右旋)结晶,使溶液对这种异构体成过饱和状态,然后在一定温度下 该过饱和的旋光异构体优先大量析出结晶,迅速过滤得到单一光学异构 体。再往滤液中加入一定量的消旋体,则溶液中另一种异构体达到饱和, 经冷却过滤后得到另一个单一光学异构体,经过如此反复操作,连续拆 分便可以交叉获得左旋体和右旋体。 播种结晶法的优点是不需用光学拆分剂,因此原料消耗少、成本低。 而且该法操作较简单、所需设备少、生产周期短、母液可套用多次、拆 分收率高。但该法仅适用于两种对映体晶体独立存在的外消旋混合物的 拆分,对大部分只含一个手性碳原子的互为对映体的光学异构药物,无 法用播种结晶法进行拆分。另外,播种结晶法拆分的条件控制也较麻烦 制备过饱和溶液的温度和冷却析晶的温度都必须通过实验加以确定,拆 分所得的光学异构体的光学纯度不高。 (二)形成非对映异构盐法 对映异构体一般都具有相同的理化性质,用重结晶、分馏、萃取及 常规色谱法不能分离。而非对映异构体的理化性质有一定差异,因此利 用消旋体的化学性质,使其与某一光学活性化合物(即拆分剂)作用生 成两种非对映异构盐,再利用它们的物理性质(如溶解度)不同,将他 们分离,最后除去拆分剂,便可以得到光学纯的异构体。目前国内外大 部分光学活性药物,均用此法生产
4 供药用已引起各方面的重视，今后的新药研制将日益朝着单一对应体药 物的方向发展。 对应异构体的药物一般可以通过不对称合成或拆分方法得到。然而 就目前医药工业生产而言，尚未有成熟的不对称合成方法用于药物的大 量生产，因此，拆分仍然是获得手性药物的重要方法。常用的光学异构 药物的拆分方法与拆分原理包括： （一）播种结晶法 在外消旋体的饱和溶液中加入其中一种纯的单一光学异构体（左旋 或右旋）结晶，使溶液对这种异构体成过饱和状态，然后在一定温度下 该过饱和的旋光异构体优先大量析出结晶，迅速过滤得到单一光学异构 体。再往滤液中加入一定量的消旋体，则溶液中另一种异构体达到饱和， 经冷却过滤后得到另一个单一光学异构体，经过如此反复操作，连续拆 分便可以交叉获得左旋体和右旋体。 播种结晶法的优点是不需用光学拆分剂，因此原料消耗少、成本低。 而且该法操作较简单、所需设备少、生产周期短、母液可套用多次、拆 分收率高。但该法仅适用于两种对映体晶体独立存在的外消旋混合物的 拆分，对大部分只含一个手性碳原子的互为对映体的光学异构药物，无 法用播种结晶法进行拆分。另外，播种结晶法拆分的条件控制也较麻烦， 制备过饱和溶液的温度和冷却析晶的温度都必须通过实验加以确定，拆 分所得的光学异构体的光学纯度不高。 （二）形成非对映异构盐法 对映异构体一般都具有相同的理化性质，用重结晶、分馏、萃取及 常规色谱法不能分离。而非对映异构体的理化性质有一定差异，因此利 用消旋体的化学性质，使其与某一光学活性化合物（即拆分剂）作用生 成两种非对映异构盐，再利用它们的物理性质（如溶解度）不同，将他 们分离，最后除去拆分剂，便可以得到光学纯的异构体。目前国内外大 部分光学活性药物，均用此法生产
(三)酶拆分法 利用酶对光学活性异构体选择性的酶解作用,使外消旋体中的一个 光学异构体优先酶解,而另一个难酶解,后者被保留而达到分离的目的 (四)色谱拆分法 利用气相和液相色谱可以测定光学异构体纯度,进行实验室少量样 品制备,推断光学异构体的构型和构象等
5 （三）酶拆分法 利用酶对光学活性异构体选择性的酶解作用，使外消旋体中的一个 光学异构体优先酶解，而另一个难酶解，后者被保留而达到分离的目的。 （四）色谱拆分法 利用气相和液相色谱可以测定光学异构体纯度，进行实验室少量样 品制备，推断光学异构体的构型和构象等