生物信息学课程1.4.1单细胞转录组Bioinformatics10xgenomics1000000OPIP-seqSmart-seq3xpressMicrowell-seqo-SPLiT-SeDrop-seg100000sci-RNA-seq6Smart-seq3OJnDropOMARS-SeqO10000OOOG8福-Seq-WellOTang0OYC1000?06CEL-SeqSTRT-Seq100Smart-seq200OSmart-SeqO00O10C1200920102011201220132018201920202021202220142015201620172023技术发表/发布时间联装械展E191S2009年，研究者在NatureMethods杂志首次报道了单细胞转录组测序技术。此后许多更为新颖、灵敏、准确的单细胞转录组测序技术相继被开发和应用，以更快的速RNASG度和更低的成本提供了丰富的生物学信息。n15
15 生物信息学 课程 Bioinformatics 1.4.1 单细胞转录组 2009年，研究者在Nature Methods杂志首次报道了单细胞转录组测序技术。此后 ， 许多更为新颖、灵敏、准确的单细胞转录组测序技术相继被开发和应用，以更快的速 度和 更低的成本提供了丰富的生物学信息。 单细 胞转 录组 学技 术发 展 single-cell RNAsequencing
生物信息学课程1.4.1单细胞转录组Bioinformatics00o0组织解离RNA单细胞分离CDNA包括单细胞悬液制备、单细胞分选、cDNA扩增、文库构聚合酶链式反应建和测序等步骤ICIATAGTACTGCGCTAGAGCGAGCGTTCATOGTCTCIGCTAAGTCTATAGTACTGCGCTAGA测序表达谱细胞类型鉴定cDNA扩增文库构建单细胞转录组测序流程16
16 生物信息学 课程 Bioinformatics 包括单细胞悬液制备、单细 胞分选、cDNA扩增、文库构 建和测序等步骤 单细胞转录组测序流程 1.4.1 单细胞转录组
生物信息学课程1.4.1单细胞转录组BioinformaticsscRNA-seg技术：1oxGenomicsBarcoded8-ChannelMicrofluidicsChipa.CDNAOi00000000x8Cells + Reagents0.000..BreakAmpliftyConstructRTSequenceCDNALibraryBeadsEmusionO000000000+GEMOutlet10xb.C.Barcodes(TVNoopoly(A)LCONAOP0OC9odCollecto.BarcodedPrimerCellsOilSingleCell10x(TVNCDNASampleInsertBarcodesIndoxGel BeadsReagentsGEMS将样本解离成单细胞悬液，在微流控制芯片中通过液压的方式推进。在第一个进样孔进入（反转录的酶），结合凝胶微珠第二个进样孔进入油滴，包裹细胞、酶、凝胶微珠，形成油包水的微体系，在这个微体系中细胞进行裂解、反转录，之后再进行后面的建库分析。17(ChoiJR,etal.Cells,2020)
17 生物信息学 课程 Bioinformatics scRNA-seq技术：10x Genomics 将样本解离成单细胞悬液，在微流控制芯片中通过液压的方式推进。在第一个进样孔进入酶 （反转录的酶），结合凝胶微珠；第二个进样孔进入油滴，包裹细胞、酶、凝胶微珠，形成油 包水的微体系，在这个微体系中细胞进行裂解、反转录，之后再进行后面的建库分析。 (Choi JR, et al. Cells, 2020) 1.4.1 单细胞转录组
生物信息学课程1.4.1单细胞转录组BioinformaticsSMART-seq：全长cDNA测序Cell ysis (Steps.1-8)设计特殊的3端定位引物Poly(A)"RNAAAAAAAAA引物NV末端结构保证cDNA的合成从mRNA的3最NV末端开始；合成的cDNA在下游连上通用PCR引物tdDprimet保证了全长测序Reversetranscriptionandterminal transferase (Steps911)设计特殊的5'端定位引物LNA-contain利用MMLV逆转录酶合成碱基的特点（末端多加AAAAAAAAAAGG+GCCC），设计带通用PCR引物以及GGG的引物，保证mRNA5端的完整性emnlateswitchincby reverse transcriptase (Steps 9-11)ISPCRprimers通用PCR引物的一致性，减少PCR扩增偏好CCCISPCRprimersPCRpreamplificationofcDNA(Steps12-14)PCRcleanup(Steps15-26)18
18 生物信息学 课程 Bioinformatics 保证了全长测 序 NV ✓ 设计特殊的3’端定位引物 引物NV末端结构保证cDNA的合成从mRNA的3’最 末端开始; 合成的cDNA在下游连上通用PCR引物 ✓ 设计特殊的5’端定位引物 利用MMLV逆转录酶合成碱基的特点（末端多加 CCC），设计带通用PCR引物以及GGG的引物， 保证mRNA 5’端的完整性 ✓ 通用PCR引物的一致性，减少PCR扩增偏好 SMART-seq：全长cDNA测序 1.4.1 单细胞转录组
生物信息学课程1.4.1单细胞转录组BioinformaticsSMART-seg2vs.10xGenomicsSMART-seq210xGenomics>Cellsuspension（细胞悬液）andnucleiTechnologyMicrofluidicplateMicrofluidicdropletsuspensions（核悬液）samplescan96/800cellsbe studied.Numberofcells500-10000cellsAlimitednumberofcellspersampleAlargenumberofcellsdepending onC1IFCRecoversupto~65%ofcells;LowNumberofread100-1.000millionreads5000-10.000readsdoubletrate(~0.9%per1,000cells)percellUniformamong cellsDiverse among cellsFull-length(96cells)3'-end>ForthemostcommonapplicationsSequencing50,000ormorereadspercellshouldbe5-25μmCell size<40μmsequenced.Depending on C1IFCSequencingSeparateMixedlibrary>Itispossibletoworkwithcryo-preservedCan resequencing the user's selected cellscells,enablingsafesampleshippingandFor individual cellsFor individual cellsbatchingin detailinapopulation19Med.2020)Kae
生物信息学 课程 Bioinformatics SMART-seq2 vs. 10x Genomics SMART-seq2 10x Genomics ➢ Cell suspension（细胞悬液）and nuclei suspensions（核 悬 液 ）samples can be studied. ➢ Recovers up to ~65% of cells；Low doublet rate (~0.9% per 1,000 cells). ➢ For the most common applications, 50,000 or more reads per cell should be sequenced. ➢ It is possible to work with cryo-preserved cells, enabling safe sample shipping and batching. 19 (Kashima Y, et al. Exp Mol Med, 2020) 1.4.1 单细胞转录组