生物信息学课程1.3特殊测序建库方法BioinformaticsRNA-Seg作为转录组学常用的研究方法，是研究基因表达和识别新的转录异构体首选方法。除了用于基因表达的一般分析外，已演绎出针对新生RNA、mRNA、环状RNA、非编码RNA、小RNA等不同类型RNA分子的高通量测序技术，还有几种特定应用的RNA-Seq方法，包括链特导性测应靶向测应竿(b)mRNAFraaentatior1ststrandsynthesis.&链特异性测序建库2ndstrandsynthesisduAdapter ligation最常用的方法是在第二链cDNA合成中使Degradation of labeled strand用三磷酸脱氧尿（dUTP）代替dTTP，之后利用酶（如Uracil-DNAGlycosylase，UDG）消化含有U的DNA链，从而保留一条链的信息。PCRamplificationSequencing10(HrdlickovaR.etal.WileyInterdiscipRevRNA,2017)
生物信息学 课程 Bioinformatics 1.3 特殊测序建库方法 RNA-Seq 作为转录组学常用的研究方法，是研究基因表达和识别新的转录异构体首选方法。除了用 于 基因表达的一般分析外，已演绎出针对新生RNA、mRNA、环状RNA、非编码RNA、小RNA等不同 类型 RNA分子的高通量测序技术，还有几种特定应用的 RNA-Seq 方法，包括链特异性测序、靶向测序等。 链特异性测序建库 最常用的方法是在第二链cDNA合成中使 用三磷酸脱氧尿 (dUTP) 代替dTTP，之后利用 酶（如Uracil-DNA Glycosylase, UDG）消化含 有U的DNA链，从而保留一条链的信息。 10 (Hrdlickova R, et al. Wiley Interdiscip Rev RNA, 2017)
生物信息学课程1.3特殊测序建库方法Bioinformatics靶向RNA测序建库0Capture-SeqTardisProbesRNAProbesRNA-Seq library preparationSmalRNAFragmented RNA最常见的是使用专门设计的、与目标RNA互补的探针捕获特定的mRNA或IncRNA，这些探针可以是生物素标记的CaptureCapture使得目标RNA可以通过亲和柱（如磁珠）轻松分离。Washing另一种方法通常在目标区域较短时使Washing用，通过设计特异性的引物直接对这些区Elution域进行PCR扩增，这些引物将特异性地结合到目标cDNA的两端，用于扩增特定Elution的基因或转录本区域。RNA-Seq library preparation两种靶向RNA-Seq。Capture-Seg方法基于通过将RNA-Seg文库与DNA寡核苷酸探针杂交来捕获感兴趣的区域。TARDIS基于将输入RNA与DNA寡核苷酸探针杂交。11(HrdlickovaR,etal.WileyInterdiscipRevRNA,2017)
生物信息学 课程 Bioinformatics ， ） 1.3 特殊测序建库方法 靶向RNA测序建库 最常见的是使用专门设计的、与目标 RNA互补的探针捕获特定 的mRNA或 IncRNA，这些探针可以是生物素标记的 使得目标RNA可以通过亲和柱（如磁珠 轻松分离。 另一种方法通常在目标区域较短时使 用，通过设计特异性的引物直接对这些区 域进行PCR扩增，这些引物将特异性地 结合到目标cDNA的两端，用于扩增特定 的基因或转录本区域。 两种靶向 RNA-Seq。Capture-Seq 方法基于通过将 RNA-Seq 文库与 DNA 寡核苷酸探针杂交来捕获感兴趣的区域。TARDIS 基于将输入 RNA 与 DNA 寡核苷酸探针杂交。 11 (Hrdlickova R, et al. Wiley Interdiscip Rev RNA, 2017)
生物信息学课程1.3特殊测序建库方法BioinformaticsTotalRNA非编码特异性建库测序一IncRNARibosomal RNADepletion由于常规RNA-Seq测序以检测mRNA为主，只关注携带polyA的转录本，会丢失不含polyA的IncRNA；18SRNA28SRNArRNA-depletedRNA为了便于IncRNA的研究，发展了专门的测序技术尽可能完整的检测各类IncRNA，如去除核糖体RNAFragmentationofRNA（Ribo-minus）等提取手段。另外，链特异性的RNASeq能保留RNA的链方向信息，可以更准确的鉴定IncRNA，并且更好的与antisense重叠的编码基因进行Ligationto Adaptor区分。NNNNTHribo-minusRNA-Seq流程图12(CuiP,etal.Genomics,2010)
12 生物信息学 课程 Bioinformatics (Cui P, et al. Genomics, 2010) 非编码特异性建库测序—lncRNA 由于常规RNA-Seq测序以检测mRNA为主，只关注 携带polyA的转录本，会丢失不含polyA的lncRNA； 为了便于lncRNA的研究，发展了专门的测序技术尽 可能完整的 检测各 类 lncRNA，如去除核糖体 RNA （Ribo-minus）等提取手段。另外，链特异性的RNASeq能保留RNA的链方向信息， 可以更准确的鉴定 lncRNA，并且更好的与antisense重叠的编码基因进行 区分。 ribo-minus RNA-Seq流程图 1.3 特殊测序建库方法
生物信息学课程1.3特殊测序建库方法Bioinformatics非编码特异性建库测序一环RNA比如，使用探针结合并去除rRNA、使用RNaseR消化linearRNA。RNaSeR：一种来源于大肠杆菌的核酸外切酶，沿RNA的3'-5'方向切割并降解RNA，能够消化几乎所有的linearRNA分子，但不易消化circRNAn020anns0n0AAWn0020ns0nn02CAMBAAOligo(dT)Oligo(dT)flowthroughenrichmentDirect rRNAdepletionTRNAdepletionRNaseRS00enrichmentO?Short-readShort-readShort-readShort-readLong-readseqseqseqseqseqPoly(A)+RNA-seqRibo-RNA-seqRNaseRRNA-seqNanopore13Poly(A)-RNA-seq(MaXK,etal.TrendsGenet,2010)
生物信息学 课程 Bioinformatics 13 (Ma XK, et al. Trends Genet, 2010) 非编码特异性建库测序—环RNA • 比如，使用探针结合并去除rRNA、使用RNase R消化linear RNA。 • RNase R：一种来源于大肠杆菌的核酸外切酶，沿RNA的3’-5’方向切割并降解RNA，能够消化几乎所有的 linear RNA分子，但不易消化circRNA。 1.3 特殊测序建库方法
生物信息学课程1.3特殊测序建库方法Bioinformatics非编码特异性建库测序一小RNAe8senm)RNARNAIreut(smalltots@S0s0s?小RNA-seq3'Adaptes0O提取RNA后，选择长度在17-25n的RNA进行测序3AdagterLipatiors0-富集piRNA小RNA-seqPoleS0oxidizedsRNA-seq，经NalO4处理后再进行小SAdscterLipationRNA建库测序5'Adepter1Reverss TranscriptonRNAIcDNA eran)RIP-seq(AGO2,Piwi等)oImmunoprecipitateCONARNA Immunoprecipitation (RiP)RNA-protein complexRNase digestionRNAextractionReversetranscriptionRNA-protein complexCLIP-seq（AGO2,Piwi等）14(WuX,etal.MolTherNucleicAcids,2020)
生物信息学 课程 Bioinformatics • RIP-seq(AGO2,Piwi等) • CLIP-seq（AGO2,Piwi等） 非编码特异性建库测序—小RNA • 小RNA-seq 提取RNA后，选择长度在17-25nt的RNA进行测序 • 富集piRNA小RNA-seq oxidized sRNA-seq，经NaIO4处理后再进行小 RNA建库测序 1.3 特殊测序建库方法 14 (Wu X, et al. Mol Ther Nucleic Acids, 2020)