在一些特殊的能促进细胞贴附的物质如Ⅲ型胶原、血清扩展因子的帮助下,细胞 先吸附到底物上,随后与底物附着并伸展成一定的形状 不同细胞的贴附能力不同,如巨噬细胞、成纤维细胞等的贴附能力较强,能 在数min至数10min内贴附到固相表面;而神经元、羊水细胞等的贴附能力则 较弱,一般需要数h乃至更长的时间才能贴附到固相表面。 (二)接触抑制与密度依赖性 对于相当一部分体外培养的贴附细胞来说,随着细胞不断的生长与分裂, 相邻两个细胞彼此靠近时,其中之一或两个细胞便会停止移动而不至于重叠起 来,转而朝向未生长有细胞的空间生长,这种现象被称为接触抑制( contact inhibition)。而进一步的生长会使细胞密度变得越来越大直至形成一个细胞单层, 在此过程中,细胞与培养基接触的面积也会因此而减少,此时,细胞的分裂便会 停止,但细胞还会存活一段时间,这种现象被称为密度抑制( density inhibition) 或密度依赖性。通常,细胞的这种密度依赖性与培养基中血清的浓度关系密切 与体外培养的正常细胞不同,转化细胞或恶变的肿瘤细胞的接触抑制特性降 低或丧失,导致细胞重叠生长。同时,转化细胞或恶变的肿瘤细胞的密度依赖性 调节也常常降低,对血清的依赖性也降低,可以生长到一个较高的终末细胞密度。 四、体外培养细胞的生长过程 体外生长的培养细胞受营养条件、生长空间等因素的限制,当细胞增殖达到 定密度后,则需要分离出一部分细胞和更新营养液进行扩大培养,此过程称传 代( subculture)。每次传代以后,细胞的生长和增殖过程都会受一定的影响。 加之很多细胞特别是正常细胞,其在体外的生存也不是无限的过程,这就使得细 胞在体外培养时的生长过程与体内有着一系列不同的生存特点 (一)培养细胞的生命期 培养细胞生命期( life span of culture cells)是细胞在培养中持续增殖和生长 的时间。体内组织细胞的生存期与完整机体的死亡衰老基本一致。体外培养细胞 的生命期与细胞的种类、性状和原供体的年龄等情况密切相关。比如,来源自人 胚的二倍体成纤维细胞可在体外连续传代30~50代,约150~300个细胞增殖周 期,相当于一年左右的生存时间。相比之下,那些来自成体或衰老个体的细胞的 生存时间则较短,如体外培养的肝细胞或肾细胞一般仅能传几代或十几代
在一些特殊的能促进细胞贴附的物质如Ⅲ型胶原、血清扩展因子的帮助下，细胞 先吸附到底物上，随后与底物附着并伸展成一定的形状。 不同细胞的贴附能力不同，如巨噬细胞、成纤维细胞等的贴附能力较强，能 在数 min 至数 10min 内贴附到固相表面；而神经元、羊水细胞等的贴附能力则 较弱，一般需要数 h 乃至更长的时间才能贴附到固相表面。 （二）接触抑制与密度依赖性 对于相当一部分体外培养的贴附细胞来说，随着细胞不断的生长与分裂，当 相邻两个细胞彼此靠近时，其中之一或两个细胞便会停止移动而不至于重叠起 来，转而朝向未生长有细胞的空间生长，这种现象被称为接触抑制（contact inhibition）。而进一步的生长会使细胞密度变得越来越大直至形成一个细胞单层， 在此过程中，细胞与培养基接触的面积也会因此而减少，此时，细胞的分裂便会 停止，但细胞还会存活一段时间，这种现象被称为密度抑制（density inhibition） 或密度依赖性。通常，细胞的这种密度依赖性与培养基中血清的浓度关系密切。 与体外培养的正常细胞不同，转化细胞或恶变的肿瘤细胞的接触抑制特性降 低或丧失，导致细胞重叠生长。同时，转化细胞或恶变的肿瘤细胞的密度依赖性 调节也常常降低，对血清的依赖性也降低，可以生长到一个较高的终末细胞密度。 四、体外培养细胞的生长过程 体外生长的培养细胞受营养条件、生长空间等因素的限制，当细胞增殖达到 一定密度后，则需要分离出一部分细胞和更新营养液进行扩大培养，此过程称传 代（subculture）。每次传代以后，细胞的生长和增殖过程都会受一定的影响。 加之很多细胞特别是正常细胞，其在体外的生存也不是无限的过程，这就使得细 胞在体外培养时的生长过程与体内有着一系列不同的生存特点。 （一）培养细胞的生命期 培养细胞生命期（life span of culture cells）是细胞在培养中持续增殖和生长 的时间。体内组织细胞的生存期与完整机体的死亡衰老基本一致。体外培养细胞 的生命期与细胞的种类、性状和原供体的年龄等情况密切相关。比如，来源自人 胚的二倍体成纤维细胞可在体外连续传代 30～50 代，约 150～300 个细胞增殖周 期，相当于一年左右的生存时间。相比之下，那些来自成体或衰老个体的细胞的 生存时间则较短，如体外培养的肝细胞或肾细胞一般仅能传几代或十几代
通常,体外培养细胞的全部生命期大致可被分为三个阶段。 原代培养期原代培养也称初代培养,是从机体中取出细胞接种培养到 第一次传代之前的这一阶段。此期的细胞呈现出活跃移动的特点,可见细胞分裂, 但不旺盛。处于原代培养阶段的细胞与体内原组织在形态结构和功能活动上有很 大的相似性。细胞群具有明显的异质性,细胞间的相互依存性强,在软琼脂培养 基培养时细胞集落形成率很低 2.传代期传代期通常是培养细胞全生命期中持续时间最长的时期,原代 培养的细胞经传代后常被称做细胞系( cell line)。一般情况下,正常体细胞在 传代10-50次左右后,细胞分裂的能力就会逐渐减弱,甚至完全丧失,细胞便进 入衰退期。 3.衰退期处于衰退期的培养细胞,增殖速率已经变得很慢或不再增殖 直至最后衰退死亡 以上主要是针对体外培养的机体正常细胞,对于体外发生转化的细胞和肿瘤 细胞而言,永生性( immortality)或恶型性( malignancy)的获得使得这类细胞 获得持久性的增殖能力,这样的细胞群体常被称为无限细胞系( infinite cell line) 或连续细胞系( continuous cell line) (二)培养细胞的一代生存期 所谓培养细胞的“一代生存期”,是从细胞接种后到再次传代培养之前的这 一段时间,它与细胞世代( generation)或倍增( doubling)时间不同。例如,某 一细胞系为第60代细胞,即指该细胞系已传代了60次。就培养细胞的一代生存 期而言,细胞通常可以倍增3~6次 培养细胞的一代生存期,一般可被分为三个阶段 1.潜伏期以贴壁生长的培养细胞为例,刚刚经历传代接种的细胞,常在 培养基中呈现悬浮状态,此时细胞的细胞质回缩,胞体呈圆球形。紧接着,悬浮 细胞便会贴附于底物表面上,此过程称贴壁。各种细胞贴附速度并不相同,这与 培养细胞的种类、培养基成分和底物的理化性质等密切相关。待细胞贴附于支持 物后,细胞便开始进一步伸展成极性细胞,但这距离细胞进入生长和增殖期还有 一定时间,称为潜伏期( latent phase)。细胞潜伏期的长短与细胞接种密度、细 胞种类以及培养基性质等密切相关。通常,原代培养细胞的潜伏期较长,约需
通常，体外培养细胞的全部生命期大致可被分为三个阶段。 1．原代培养期 原代培养也称初代培养，是从机体中取出细胞接种培养到 第一次传代之前的这一阶段。此期的细胞呈现出活跃移动的特点，可见细胞分裂， 但不旺盛。处于原代培养阶段的细胞与体内原组织在形态结构和功能活动上有很 大的相似性。细胞群具有明显的异质性，细胞间的相互依存性强，在软琼脂培养 基培养时细胞集落形成率很低。 2．传代期 传代期通常是培养细胞全生命期中持续时间最长的时期，原代 培养的细胞经传代后常被称做细胞系（cell line）。一般情况下，正常体细胞在 传代 10-50 次左右后，细胞分裂的能力就会逐渐减弱，甚至完全丧失，细胞便进 入衰退期。 3．衰退期 处于衰退期的培养细胞，增殖速率已经变得很慢或不再增殖， 直至最后衰退死亡。 以上主要是针对体外培养的机体正常细胞，对于体外发生转化的细胞和肿瘤 细胞而言，永生性（immortality）或恶型性（malignancy）的获得使得这类细胞 获得持久性的增殖能力，这样的细胞群体常被称为无限细胞系（infinite cell line） 或连续细胞系（continuous cell line）。 （二）培养细胞的一代生存期 所谓培养细胞的“一代生存期”，是从细胞接种后到再次传代培养之前的这 一段时间，它与细胞世代（generation）或倍增（doubling）时间不同。例如，某 一细胞系为第 60 代细胞，即指该细胞系已传代了 60 次。就培养细胞的一代生存 期而言，细胞通常可以倍增 3～6 次。 培养细胞的一代生存期，一般可被分为三个阶段。 1．潜伏期 以贴壁生长的培养细胞为例，刚刚经历传代接种的细胞，常在 培养基中呈现悬浮状态，此时细胞的细胞质回缩，胞体呈圆球形。紧接着，悬浮 细胞便会贴附于底物表面上，此过程称贴壁。各种细胞贴附速度并不相同，这与 培养细胞的种类、培养基成分和底物的理化性质等密切相关。待细胞贴附于支持 物后，细胞便开始进一步伸展成极性细胞，但这距离细胞进入生长和增殖期还有 一定时间，称为潜伏期（latent phase）。细胞潜伏期的长短与细胞接种密度、细 胞种类以及培养基性质等密切相关。通常，原代培养细胞的潜伏期较长，约需
24~96h或更长时间,而连续细胞系和肿瘤细胞的潜伏期则较短,仅6~24h。另 外,细胞接种密度大时潜伏期常会变短。 2.对数生长期当细胞分裂相开始出现并逐渐增多,便标志着潜伏期的结 束和对数生长期( logarithmic growth phase)的开始。对数生长期是细胞增殖分 裂最旺盛的阶段。对数生长期细胞分裂相数量的多少常作为判定细胞生长旺盛与 否的一个重要标志,一般用分裂指数( mitotic index,M)来表示:分裂相在整 个细胞群中所占的百分比。体外培养细胞的分裂指数受细胞种类、培养液成分 营养条件、pH、培养箱温度等多种因素的影响。一般细胞的分裂指数多介于 0.1%~0.5%之间,原代细胞分裂指数较低,连续细胞和肿瘤细胞分裂指数可高 达3%~5%。对数增生期是细胞一代生存期中活力最好的时期,因此是进行各种 实验最好的和最主要的阶段。 3.停滞期当细胞数量达饱和密度后,细胞遂停止増殖,进入停滞期 ( stagnate phase)。此时细胞数量不再增加,故也称平台期( plateau phase) 处于此期的细胞虽不增殖,但仍有代谢活动,但随着培养液中营养渐趋耗尽,代 谢产物的积累、pH值的降低,此时需要进行及时的传代培养,否则细胞会因营 养匮乏、中毒等原因,发生形态改变,重则从底物脱落死亡。 第三节原代培养与传代培养 原代培养 将动物机体中待培养组织从机体中取出,然后用各种消化性酶(如胰蛋白酶) 消化,或用机械方法处理,将组织分离成单细胞,最后添加适当的培养基培养, 使细胞得以生存、生长和繁殖,这一过程称原代培养。原代培养的细胞由于其和 机体细胞在形态结构、功能等方面非常接近,常被用作药理实验重要的研究材料 (一)所需设备与试剂 超净工作台、细胞培养箱、离心机、离心管、倒置显微镜、普通光学显微镜、 吸管、废液缸、培养瓶、平皿、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、水浴锅 (37℃)、添加有002%EDTA的025%胰蛋白酶消化液、RPM1640细胞培养 基(添加有20%的FBS)、 Hanks液、75%酒精溶液、碘酒等
24～96h 或更长时间，而连续细胞系和肿瘤细胞的潜伏期则较短，仅 6～24h。另 外，细胞接种密度大时潜伏期常会变短。 2．对数生长期 当细胞分裂相开始出现并逐渐增多，便标志着潜伏期的结 束和对数生长期（logarithmic growth phase）的开始。对数生长期是细胞增殖分 裂最旺盛的阶段。对数生长期细胞分裂相数量的多少常作为判定细胞生长旺盛与 否的一个重要标志，一般用分裂指数（mitotic index，MI）来表示：分裂相在整 个细胞群中所占的百分比。体外培养细胞的分裂指数受细胞种类、培养液成分、 营养条件、pH、培养箱温度等多种因素的影响。一般细胞的分裂指数多介于 0.1%～0.5%之间，原代细胞分裂指数较低，连续细胞和肿瘤细胞分裂指数可高 达 3%～5%。对数增生期是细胞一代生存期中活力最好的时期，因此是进行各种 实验最好的和最主要的阶段。 3．停滞期 当细胞数量达饱和密度后，细胞遂停止增殖，进入停滞期 （stagnate phase）。此时细胞数量不再增加，故也称平台期（plateau phase）。 处于此期的细胞虽不增殖，但仍有代谢活动，但随着培养液中营养渐趋耗尽，代 谢产物的积累、pH 值的降低，此时需要进行及时的传代培养，否则细胞会因营 养匮乏、中毒等原因，发生形态改变，重则从底物脱落死亡。 第三节 原代培养与传代培养 一、原代培养 将动物机体中待培养组织从机体中取出，然后用各种消化性酶（如胰蛋白酶） 消化，或用机械方法处理，将组织分离成单细胞，最后添加适当的培养基培养， 使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。原代培养的细胞由于其和 机体细胞在形态结构、功能等方面非常接近，常被用作药理实验重要的研究材料。 （一）所需设备与试剂 超净工作台、细胞培养箱、离心机、离心管、倒置显微镜、普通光学显微镜、 吸管、废液缸、培养瓶、平皿、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、水浴锅 （37℃）、添加有 0.02%EDTA 的 0.25%胰蛋白酶消化液、RPMI 1640 细胞培养 基（添加有 20％的 FBS）、Hanks 液、75%酒精溶液、碘酒等
培养对象:新生小鼠的肝细胞。 (二)操作步骤 1.胰蛋白酶消化法 (1)将新生小鼠拉颈椎致死,置75%酒精泡2-3s,再用碘酒消毒腹部,用 纱布将小鼠包裹后带入超净台内,解剖取肝脏,放入一玻璃平皿中 (2)用 Hanks液洗涤三次,并剔除脂肪,结缔组织,血液等杂物,然后用 手术剪将肝脏剪成1mm3大小的组织块,再用 Hanks液洗三次。 (3)将组织块转移至一小青霉素瓶中,视组织块的多少加入5~6倍体积的 0.25%37℃预温的胰蛋白酶消化液中消化。 (4)待大部分细胞被消化成为单细胞后,加入3~5m培养液及时终止胰酶 的消化作用。 (5)将上述细胞悬液转移至一离心管中,1000pm,离心5min,弃上清液。 (6)加入 Hanks液5ml,重悬细胞,然后重复上一步骤。 (7)加入1~2ml培养基重悬细胞,血球计数板计数细胞密度 (8)在细胞计数的基础之上,利用培养基将细胞密度调整到5×105个ml 左右,然后将细胞悬液转移(分装)至相应大小的细胞培养瓶中,置细胞培养箱 中37℃培养。 2.组织块法 (1)第1、2步与胰酶消化法相同 (2)将用 Hanks洗涤后的组织块直接转移到培养瓶,贴附在培养瓶的底面 (凹面,生长面) (3)将培养瓶翻转,使培养瓶的生长面朝上,然后加入适量培养基至瓶中, 应避免培养液与组织块接触 (4)将培养瓶小心转移至细胞培养箱中,37℃静置2~3h,然后轻轻翻转 培养瓶,使培养瓶的生长面组织浸入培养液中(勿使组织漂起),继续培养。 3.注意事项 (1)自取材开始,保持所有组织细胞处于无菌条件,细胞计数可在有菌环 境中进行。 (2)75%酒精泡消毒的时间不宜过长,以免酒精从口和肛门浸入小鼠体内
培养对象：新生小鼠的肝细胞。 （二）操作步骤 1．胰蛋白酶消化法 （1）将新生小鼠拉颈椎致死，置 75%酒精泡 2-3s，再用碘酒消毒腹部，用 纱布将小鼠包裹后带入超净台内，解剖取肝脏，放入一玻璃平皿中。 （2）用 Hanks 液洗涤三次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物，然后用 手术剪将肝脏剪成 1mm3 大小的组织块，再用 Hanks 液洗三次。 （3）将组织块转移至一小青霉素瓶中，视组织块的多少加入 5～6 倍体积的 0.25% 37℃预温的胰蛋白酶消化液中消化。 （4）待大部分细胞被消化成为单细胞后，加入 3～5ml 培养液及时终止胰酶 的消化作用。 （5）将上述细胞悬液转移至一离心管中，1000rpm，离心 5min，弃上清液。 （6）加入 Hanks 液 5ml，重悬细胞，然后重复上一步骤。 （7）加入 1～2ml 培养基重悬细胞，血球计数板计数细胞密度。 （8）在细胞计数的基础之上，利用培养基将细胞密度调整到 5×105 个/ml 左右，然后将细胞悬液转移（分装）至相应大小的细胞培养瓶中，置细胞培养箱 中 37℃培养。 2．组织块法 （1）第 1、2 步与胰酶消化法相同。 （2）将用 Hanks 洗涤后的组织块直接转移到培养瓶，贴附在培养瓶的底面 （凹面，生长面）。 （3）将培养瓶翻转，使培养瓶的生长面朝上，然后加入适量培养基至瓶中， 应避免培养液与组织块接触。 （4）将培养瓶小心转移至细胞培养箱中，37℃静置 2～3h，然后轻轻翻转 培养瓶，使培养瓶的生长面组织浸入培养液中（勿使组织漂起），继续培养。 3．注意事项 （1）自取材开始，保持所有组织细胞处于无菌条件，细胞计数可在有菌环 境中进行。 （2）75%酒精泡消毒的时间不宜过长，以免酒精从口和肛门浸入小鼠体内
(3)待到组织块周围长出单细胞层后将组织块剔除,便可收获细胞或进行 传代培养。 (4)胰蛋白酶消化的时间长短与组织细胞的幼嫩程度、数量以及酶的活力 等因素密切相关,另外在消化过程中应密切观察,及时吹打,避免消化过度 、细胞传代培养 当细胞在培养瓶长成致密的单层后,通常已经没有足够的生长空间和营养条 件满足细胞进一步生长的需求。为使细胞能继续生长,同时使细胞的数量扩大, 就必须进行传代再培养。同时,传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法,也 是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。通常,悬浮型细胞可通过直接补充培 养基后再分瓶的方法进行传代,方法相对简单,而贴壁细胞则需经消化后才能分 瓶培养。 (一)所需设备与试剂 超净工作台、细胞培养箱、离心机、离心管、倒置显微镜、吸管、废液缸、 培养瓶、移液管、添加有0.02%EDTA的0.25%胰蛋白酶消化液、RPMI1640细 胞培养基(添加有10%FBS)、 Hanks液等。 (二)操作步骤 贴壁细胞的传代培养 1)将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。 (2)加入1~2m1025%胰酶溶液,使所有细胞都能被浸入到溶液中,室温 或37℃消化。 (3)利用倒置显微镜或肉眼观察细胞的消化状况。随着时间的推移,原本 贴壁的细胞会逐渐变圆,并开始脱落。 (4)待到消化充分后,及时加入10 ml Hanks液终止消化。 (5)用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液,转移至一离心管中,1000pm,离 心5min,弃上清液。 (6)用10~15ml新鲜培养基重悬细胞,并将其分装到两至三个培养瓶中, 37℃下继续培养。 (7)过夜观察细胞的贴壁及生长状况
（3）待到组织块周围长出单细胞层后将组织块剔除，便可收获细胞或进行 传代培养。 （4） 胰蛋白酶消化的时间长短与组织细胞的幼嫩程度、数量以及酶的活力 等因素密切相关，另外在消化过程中应密切观察，及时吹打，避免消化过度。 二、细胞传代培养 当细胞在培养瓶长成致密的单层后，通常已经没有足够的生长空间和营养条 件满足细胞进一步生长的需求。为使细胞能继续生长，同时使细胞的数量扩大， 就必须进行传代再培养。同时，传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法，也 是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。通常，悬浮型细胞可通过直接补充培 养基后再分瓶的方法进行传代，方法相对简单，而贴壁细胞则需经消化后才能分 瓶培养。 （一）所需设备与试剂 超净工作台、细胞培养箱、离心机、离心管、倒置显微镜、吸管、废液缸、 培养瓶、移液管、添加有 0.02%EDTA 的 0.25%胰蛋白酶消化液、RPMI 1640 细 胞培养基（添加有 10％FBS）、Hanks 液等。 （二）操作步骤 1．贴壁细胞的传代培养 （1）将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。 （2）加入 1～2ml 0.25％胰酶溶液，使所有细胞都能被浸入到溶液中，室温 或 37℃消化。 （3）利用倒置显微镜或肉眼观察细胞的消化状况。随着时间的推移，原本 贴壁的细胞会逐渐变圆，并开始脱落。 （4）待到消化充分后，及时加入 10ml Hanks 液终止消化。 （5）用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，转移至一离心管中，1000rpm，离 心 5min，弃上清液。 （6）用 10～15ml 新鲜培养基重悬细胞，并将其分装到两至三个培养瓶中， 37℃下继续培养。 （7）过夜观察细胞的贴壁及生长状况