Pv山等产生的平头末端 5G-C-T-C-A-G-C-E-G-G-A-G 3. C-GAG-T-C-G-A-C-C-T-C 5 Pvu||37℃ 5‘…GCTC-A-G-0H P-C--G-G-A-G C-G-A-G--C OH-G-A-CCTC∴.53
PvuII等产生的平头末端 5‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C … 5’ PvuII 37 ℃ 5‘ … G-C-T-C-A-G-OH P-C-T-G-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-G-T-C-P OH-G-A-C-C-T-C … 5’
限制性核酸内切酶 Ⅱ型限制性核酸内切酶酶解反应的操作 大部分型核酸内切酶需要相似的反应条件: Tris-HCl 50 mM pH 7.5 Macl 10 mM 0-50mM低盐酶 Nacl 0-150mM 100mM中盐酶 DTT 1 mM 150mM高盐酶 Volume 20-100 pLl T 37C1-1.5hr 1U核酸内切酶的酶活性:在最佳反应条件下反应1小时,完全 水解1μg标准DNA所需的酶量
限制性核酸内切酶 II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作 大部分II 型核酸内切酶需要相似的反应条件： Tris-HCl 50 mM pH 7.5 MgCl2 10 mM NaCl 0 - 150 mM DTT 1 mM 0 - 50 mM 低盐酶 100 mM 中盐酶 150 mM 高盐酶 Volume 20 - 100 ml T T 37 ℃ 1 - 1.5 hr 1 U 核酸内切酶的酶活性：在最佳反应条件下反应 1 小时，完全 水解 1 mg 标准DNA所需的酶量
限制性核酸内切酶 Ⅱ型限制性核酸内切酶酶解反应的操作 型核酸内切酶的多酶联合酶解: 对盐浓度要求相同的酶,原则上可以同时酶切,但应注意: BamHI Smal 5 3 G GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT.3 5… STACATGTAGGGGCALGCGT升 CCaT.3 3 CGATGTACCTAG GGCCCAAGCGTA.5 5∴ GCTACATGGATCCC GGGTTCGCAT3 3.CGATGTACCTAGGG CCCAAGCGTA 5
限制性核酸内切酶 II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作 II 型核酸内切酶的多酶联合酶解： 对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切，但应注意： 5‘ …GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT…3’ 3‘ …CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA…5’ BamHI SmaI 5‘ …GCTACATG GATCCCGGGTTCGCAT…3’ 3‘ …CGATGTACCTAG GGCCCAAGCGTA…5’ 5‘ …GCTACATGGATCCC GGGTTCGCAT…3’ 3‘ …CGATGTACCTAGGG CCCAAGCGTA…5’
限制性核酸内切酶 Ⅱ型限制性核酸内切酶酶解反应的操作 型核酸内切酶的多酶联合酶解: 对盐浓度要求不同的酶,可采取下列方法: 使用较贵的酶的盐浓度,加大便宜酶的用量,同时酶解 ●低盐酶先切,然后补加盐,高盐酶再切 ●一种酶先切,然后更换缓冲液,另一种酶再切 0倍体积的5 M NaAC pH5.4 2.5倍体积的冰冷乙醇 冰浴5分钟、高速冷冻离心10分钟、干燥
限制性核酸内切酶 II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作 II 型核酸内切酶的多酶联合酶解： 对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法： 使用较贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解 低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切 一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切 0.1倍体积的 5 M NaAc pH 5.4 2.5倍体积的冰冷乙醇 冰浴 5 分钟、高速冷冻离心10分钟、干燥
限制性核酸内切酶 影响限制性核酸内切酶活性的因素 DNA样品的纯度: 蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaC等 ●加大酶的用量,1gDNA用10U酶 加大反应总体积 ●延长反应时间
限制性核酸内切酶 影响限制性核酸内切酶活性的因素 DNA样品的纯度： 蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等 加大酶的用量，1 mg DNA 用 10U 酶 加大反应总体积 延长反应时间