限制性核酸内切酶 影响限制性核酸内切酶活性的因素 DNA样品的甲基化程度: 大肠杆菌中的dam甲基化酶在5‘GATC3序列中的腺嘌呤N位 引入甲基,受其影响的酶有Bc!l、Mbo等,但BamH、 Bg|lSau3A|不受影响 大肠杆菌中的dcm甲基化酶在5 CCAGG3或5 CCTGG3序 列中的胞嘧啶C5位上引入甲基,受其影响的酶有EcOR等 哺乳动物中的甲基化酶在5‘CG3序列中的C5位上引入甲基
限制性核酸内切酶 影响限制性核酸内切酶活性的因素 DNA样品的甲基化程度： 大肠杆菌中的dam甲基化酶在5‘GATC3’序列中的腺嘌呤N6位 引入甲基，受其影响的酶有Bcl I、MboI等，但BamH I、 Bgl II、Sau3A I不受影响 大肠杆菌中的dcm甲基化酶在5‘CCAGG3’或5‘CCTGG3’序 列 中的胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影响的酶有EcoR II等 哺乳动物中的甲基化酶在5‘CG3’序列中的C5位上引入甲基
限制性核酸内切酶 影响限制性核酸内切酶活性的因素 核酸内切酶的缓冲液性质: 高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值等, 会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性,即 所谓的 Star activity现象 EcoR|在正常条件下识别并切割5 GAATTC3序列,但在 茁浓度超过5%(W/)时,也可切割5 PuPuATPyPy3或 5 AATT3
限制性核酸内切酶 影响限制性核酸内切酶活性的因素 核酸内切酶的缓冲液性质： 高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值等， 会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即 所谓的Star activity现象 EcoR I在正常条件下识别并切割5‘GAATTC3’序列，但在 甘油浓度超过5%（v/v）时，也可切割5‘PuPuATPyPy3’或 者5‘AATT3’
DNA连接酶 DNA连接酶的基本性质 修复双链DNA上缺口处的磷酸二酯键 nick o 5‘G-cTC-TG-C- A G-G-A-. 3….cGA-GA-C- G--C-C-T-C 5 P oH nick DNA连接酶 5 G-C-T-C--G-C-A-G-G-A-G 3.C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C
DNA连接酶 DNA连接酶的基本性质 修复双链DNA上缺口处的磷酸二酯键 DNA连接酶 5‘ … G-C-T-C-T-G-C-AG-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C … 5’ OH P P OH 5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C … 5’ nick nick
DNA连接酶 DNA连接酶的基本性质 修复与RNA链结合的DNA链上缺口处的磷酸二酯键 5G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G 3L.C-GA-GAC-GG-C-C-T-C 5 OH nick T4DNA连接酶 5 G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G 3.C-GAG-A-C-G-G-C-C-T-C 5
DNA连接酶 DNA连接酶的基本性质 修复与RNA链结合的DNA链上缺口处的磷酸二酯键 T4-DNA连接酶 5‘ … G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-G A-C-G-G-C-C-T-C … 5’ P OH nick 5‘ … G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-G-A-C-G-G-C-C-T-C … 5’
DNA连接酶 DNA连接酶的基本性质 连接多个平头双链DNA分子: 5∴. G-C-T-C-A-G-0H P-C-T-G-G-A-G 3.C-GA-G-T-C-P OH-G-A-C-C-T-C.52 T4DNA连接酶 5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G 3.C-GA-G-T-C-G-A-C-C-T-C 5
DNA连接酶 DNA连接酶的基本性质 连接多个平头双链DNA分子： 5‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G… 3’ 3‘ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C … 5’ 5‘ … G-C-T-C-A-G-OH P-C-T-G-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-G-T-C-P OH-G-A-C-C-T-C … 5’ T4-DNA连接酶