腐殖酸十六烷基三甲基溴乙胺阳离子去污剂CTABPVPP聚乙烯聚吡咯烷酮(polyvinylpolypyrrolidone,PVPP)PBS磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline)28
腐殖酸 PVPP CTAB PBS 十六烷基三甲基溴乙胺 阳离子去污剂 聚乙烯聚吡咯烷酮 (polyvinylpolypyrrolidone,PVPP) 磷酸缓冲盐溶液 (phosphate buffer saline) 28
细胞破碎物理法酶解法化学试剂法玻璃珠法溶菌酶超声波法表面活性剂冻融法蛋白酶低渗裂解、强离子剂微波裂解蜗牛酶颗粒破碎等29
表面活性剂 强离子剂 玻璃珠法 超声波法 冻融法 低渗裂解、 微波裂解 颗粒破碎等 溶菌酶 蛋白酶 蜗牛酶 化学试剂法 物理法 酶解法 细胞破碎 29
(二) 提DNA酚抽提法：1、①加RNase，37°C1h,②加蛋白酶K，50°℃，3h；或37°℃12h，不时mix③加等体积酚，充分mix，9000rpm，3min，小心吸取上层粘稠水相。④加等体积酚，充分mix，9000rpm，3min，小心吸取上层粘稠水相。?氯仿-异戊醇(24:1)抽提1次。9000rpm，3min，小心吸取上层粘稠水相。?移到50ml烧杯中，加2.5倍体积冷无水乙醇，用玻棒钩出DNA。?TE溶解。30
1、酚抽提法： ① 加RNase，37℃1 h， ② 加蛋白酶K，50 ℃ ，3 h ； 或 37 ℃ 12 h , 不时mix ③ 加等体积酚，充分mix，9000rpm，3min，小心吸取上层粘稠水相。 ④ 加等体积酚，充分mix，9000rpm， 3min，小心吸取上层粘稠水相。 ⑤ 氯仿-异戊醇(24:1)抽提1次。9000rpm ，3min，小心吸取上层粘稠水 相。 ⑥ 移到50ml烧杯中，加2.5倍体积冷无水乙醇，用玻棒钩出DNA。 ⑦ TE 溶解。 （二）提DNA 30
（二）提DNA2、异丙醇沉淀法：原理：用2倍体积异丙醇沉淀DNA溶液，DNA沉淀是丝状，而RNA溶于异丙醇中，可除去RNA。细胞，PBS洗2次。②3mlTEN（Tris-EDTA-NaCI溶液）重悬，加DNA提取液，蛋白酶K，50C1～4h③加等体积饱和酚，混匀，9000rpm3min，小心吸取上层粘稠水相。④氯仿-异戊醇(24:1)抽提1次，9000rpm3min，小心吸取上层粘稠水相。?加2倍体积的异丙醇，用玻棒钩出DNA。?TE溶解。31
2、异丙醇沉淀法： 原理： 用2倍体积异丙醇沉淀DNA溶液，DNA沉淀是丝状，而RNA溶于异丙醇中，可 除去RNA。 ① 细胞，PBS洗2次。 ② 3 ml TEN (Tris-EDTA-NaCl溶液)重悬，加DNA提取液，蛋白酶K，50℃1～4 h ③ 加等体积饱和酚，混匀，9000rpm 3 min，小心吸取上层粘稠水相。 ④ 氯仿-异戊醇(24:1)抽提1次，9000rpm 3 min，小心吸取上层粘稠水相。 ⑤ 加2倍体积的异丙醇，用玻棒钩出DNA。 ⑥ TE溶解。 （二）提DNA 31
口SDS法-提取DNASDS是一种阴离子去垢剂，在高温（55～65℃）条件下能裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；提高盐（KAc或NHAc）浓度并降低温度（冰浴），使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀；上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。口SDS法DNA提取缓冲液EDTATris-HCI组份NaclSDS(pH8.0)(pH8.0)2%终浓度10 mM20 mM0.4M32
SDS法-提取DNA SDS是一种阴离子去垢剂，在高温（55～65℃）条件下能裂解细 胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸； 提高盐(KAc或NH4Ac)浓度并降低温度（冰浴），使蛋白质及多糖 杂质沉淀，离心后除去沉淀； 上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的 DNA。 组份 Tris-HCl （pH8.0） EDTA （pH 8.0 ） NaCl SDS 终浓度 10 mM 20 mM 0.4M 2% SDS法DNA提取缓冲液 32