器官移植 Vol 8 No 5 Organ Transplantation 述评 肝脏组织工程研究进展 杨扬王励 【摘要】随着科学技术的迅速发展,通过干细胞与组织工程的新技术来再造人类肝脏,为解决供肝短缺提 供了新的思路,是未来科学研究的重点。本文从去细胞化基质支架构建肝脏类器官、生物材料微型模具构建肝脏 类器官、细胞诱导的无支架培养构建肝脏类器官、构建嵌合体制备人工肝脏等方面介绍肝脏组织工程研究的最新 进展 【关键词】肝移植;组织工程;去细胞化基质支架;生物材料微型模具;细胞诱导的无支架培养;干细胞 人工肝脏;类器官;嵌合体 【中图分类号】R617,R3181【文献标志码】A【文章编号】1674-745(2017)05-0001-07 作者简介杨扬,教授、主任医师,博士研究生导师。现任中山大学附属第三医院肝脏外科主任, 器官移植中心副主任。兼任中国医师协会器官移植医师分会常委、中华医学会器官移植学分会青 年委员会副主任委员、中华医学会外科学分会青年委员会副主任委员、中华医学会外科学分会移 植学组委员、广东省医学会外科学分会首届青年委员会主任委员、广东省医学会医事法学分会副 主任委员。兼任《器官移植》杂志常务编委,《 Liver resεarch》杂志編辑部主任,《中华肝脏外 科手术学电子杂志》副总编辑及编辑部主任,《中华医学杂志》、《中华肝胆外科杂志》等杂志 编委。2001年8月获得外科学(器官移植学)博士学位。2005年在美国 Mount sinai医学院移植 中心进修。擅长肝脏、胆道、门静脉高压与胰腺外科疾病的诊断与处理,主持或参与1300余例临 床肝移植。对肝脏外科、肝移植、移植免疫、干细胞在肝脏疾病的应用等方面有深入的硏究,在肝移植术后并发症的预防 和治疗方面有较为丰富的经验。在国内外期刊上发表论文数十篇,副主编专著2部。作为课题负責人获国家自然科学基金5项, 863项目分课題1项,十二五国家科技重大专项分题1项,广东省自然科学基金面上项目、重点项目及重点攻关课题7项 广州市科技重点专项2项。获教育部科技进步一等奖2项、国家科技部科技进步二等奖1项、广东省科技进步一等奖3项 广州市科技进步一等奖1项。 肝移植是终末期肝病唯一有效的治疗措施,目前来源的途径,通过干细胞与组织工程的新技术来人造 肝移植术后5年存活率可达73.6%,但全球等待肝肝脏,如构建肝脏类器官、利用嵌合体制备人工肝脏 移植的患者数量远超过供体数量,供肝短缺成为制约等新的方法不断进入人们的视野,并有望改变供肝短 肝移植发展的重要因素之一。为克服这一困难,一方缺的现状。 面肝移植科医师从临床技术层面增加供肝来源,如活 体部分肝移植、劈离式肝移植及边缘性供肝的合理使 通过去细胞化基质支架构建肝脏类 用等,增加了受益人群;与此同时,随着对肝脏再生 器官 研究的深入及细胞培养技术、干细胞技术、基因工程 人体各种器官均具有能够支撑并维持器官形态 技术的发展,科研工作者正在探索另外一条增加供肝的支架,其主要成分是细胞外基质。肝脏的细胞外基 基金项目:国家自然科学基金(81370575、81570593);广东省自然科学基金研究团队项目(2015A03032013);广州市科技计划项目 健康医疗协同创新重大专项(158100076、201400000013);中山大学临床医学研究5010项目(2014006) 作者单位:510630广州,中山大学附属第三医院肝脏外科暨肝移植中心中山大学器官移植研究所 通讯作者:杨扬, Email: yysysu a163com
第 8 卷 第 5 期 2017 年 9 月 Vol. 8 No. 5 Sep. 2017 器官移植 Organ Transplantation 作者简介：杨扬，教授、主任医师，博士研究生导师。现任中山大学附属第三医院肝脏外科主任， 器官移植中心副主任。兼任中国医师协会器官移植医师分会常委、中华医学会器官移植学分会青 年委员会副主任委员、中华医学会外科学分会青年委员会副主任委员、中华医学会外科学分会移 植学组委员、广东省医学会外科学分会首届青年委员会主任委员、广东省医学会医事法学分会副 主任委员。兼任《器官移植》杂志常务编委，《Liver Research》杂志编辑部主任，《中华肝脏外 科手术学电子杂志》副总编辑及编辑部主任，《中华医学杂志》、《中华肝胆外科杂志》等杂志 编委。2001 年 8 月获得外科学（器官移植学）博士学位。2005 年在美国 Mount Sinai 医学院移植 中心进修。擅长肝脏、胆道、门静脉高压与胰腺外科疾病的诊断与处理，主持或参与 1 300 余例临 床肝移植。对肝脏外科、肝移植、移植免疫、干细胞在肝脏疾病的应用等方面有深入的研究，在肝移植术后并发症的预防 和治疗方面有较为丰富的经验。在国内外期刊上发表论文数十篇，副主编专著2部。作为课题负责人获国家自然科学基金5项， 863 项目分课题 1 项，十二五国家科技重大专项分题 1 项，广东省自然科学基金面上项目、重点项目及重点攻关课题 7 项， 广州市科技重点专项 2 项。获教育部科技进步一等奖 2 项、国家科技部科技进步二等奖 1 项、广东省科技进步一等奖 3 项、 广州市科技进步一等奖 1 项。 【摘要】 随着科学技术的迅速发展，通过干细胞与组织工程的新技术来再造人类肝脏，为解决供肝短缺提 供了新的思路，是未来科学研究的重点。本文从去细胞化基质支架构建肝脏类器官、生物材料微型模具构建肝脏 类器官、细胞诱导的无支架培养构建肝脏类器官、构建嵌合体制备人工肝脏等方面介绍肝脏组织工程研究的最新 进展。 【关键词】 肝移植；组织工程；去细胞化基质支架；生物材料微型模具；细胞诱导的无支架培养；干细胞； 人工肝脏；类器官；嵌合体 【中图分类号】 R617，R318.1 【文献标志码】 A 【文章编号】 1674-7445（2017）05-0001-07 肝脏组织工程研究进展 杨扬 王励 肝移植是终末期肝病唯一有效的治疗措施，目前 肝移植术后 5 年存活率可达 73.6%[1] ，但全球等待肝 移植的患者数量远超过供体数量，供肝短缺成为制约 肝移植发展的重要因素之一。为克服这一困难，一方 面肝移植科医师从临床技术层面增加供肝来源，如活 体部分肝移植、劈离式肝移植及边缘性供肝的合理使 用等，增加了受益人群；与此同时，随着对肝脏再生 研究的深入及细胞培养技术、干细胞技术、基因工程 技术的发展，科研工作者正在探索另外一条增加供肝 来源的途径，通过干细胞与组织工程的新技术来人造 肝脏，如构建肝脏类器官、利用嵌合体制备人工肝脏 等新的方法不断进入人们的视野，并有望改变供肝短 缺的现状。 1 通过去细胞化基质支架构建肝脏类 器官 人体各种器官均具有能够支撑并维持器官形态 的支架，其主要成分是细胞外基质。肝脏的细胞外基 DOI: 10.3969/j.issn.1674-7445.2017.05.001 基金项目：国家自然科学基金（81370575、81570593）；广东省自然科学基金研究团队项目（2015A030312013）；广州市科技计划项目 - 健康医疗协同创新重大专项（158100076、201400000001-3）；中山大学临床医学研究 5010 项目（2014006） 作者单位：510630 广州，中山大学附属第三医院肝脏外科暨肝移植中心 中山大学器官移植研究所 通讯作者：杨扬，Email: yysysu@163.com ·述评·
器官移植 第8卷 质在肝细胞的增殖、分化及肝内血管形成等方面具有官植入体内后,血栓形成是阻碍其长期存活并发挥功 重要作用的。实体器官去细胞技术能够保留肝脏的能的重要并发症。Ko等切尝试用结合血管内皮细胞 细胞外基质支架内的血管及胆道结构,甚至许多肝的抗体覆盖猪肝脏基质支架的血管内壁,从而实现血 脏再生相关生长因子国。基于肝脏基质支架的生物学管内皮化,然后进行再细胞化、灌注培养及植入猪体 结构和功能特点,许多研究者正在尝试利用肝脏基质内,结果发现能够明显延长移植后血栓形成的时间。 支架去构建肝脏类器官0。基于细胞外基质支架构此外,为保证肝脏基质支架适合细胞再植及功能发挥 建肝脏类器官的主要过程包括去细胞化基质支架的制细胞外基质还需包含足量的重要生长因子,包括肝细 备、人工修饰基质支架及基质支架的再细胞化等步骤胞生长因子、成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因 (图1)。 子及胰岛素样生长因子等。一方面,通过优化肝脏去 细胞化方案,可使基质支架保留更多的生长因子 不话合移的健康人肝 另一方面,在去细胞化过程完成后,还可以应用分子 固定技术向细胞外基质添加某些重要的生长因子。 尽管目前已有不少研究报道如何抑制血栓形成及丰富 基质支架内生长因子,但尚无突破性进展,这仍将是 未来研究的热点和难点。 最后,在基质支架再细胞化时,输注细胞的数量 基医架的再组舶化 和密度都会影响细胞功能和定植效率。细胞种植 途径包括门静脉、肝静脉以及胆道,种植方式有 直接注射法、单次连续输注法和多步骤连续输注法。 Soto-Gutierrez等对比上述3种种植方式,发现在 细胞总数相同的情况下,多步骤连续输注法优于其它 两种方法,更有利于肝细胞定植和功能发挥。此外 去统粒化的肝脏基质支架 细胞种类也是影响细胞功能和定植效率的重要因素之 。目前用于再细胞化的细胞包括未成熟肝细胞、胚 胎肝细胞或者与内皮细胞的组合等。肝脏非实质 细胞(内皮细胞、枯否细胞及星状细胞等)对肝细胞 的增殖和生物功能具有重要作用。研究表明肝细胞和 全肝或离肝去图化 图1基于肝脏基质支架的培养方法 内皮细胞组合用于基质支架的再细胞化的效果优于单 独使用肝细胞。然而,尚无研究报道肝细胞与枯否细 igure 1 Culture method based on liver matrix scaffold 胞、星状细胞或其他非实质细胞混合用于基质支架再 首先,肝脏的细胞外基质支架的制备方法是将同细胞化的效果。因此,对这部分内容进行深入研究, 种或异种来源的肝脏进行去细胞化实现的。200年,将有助于构建结构和功能更加完善的肝脏类器官。 Lin等首次报道将猪的肝脏去细胞化,获得了肝 2通过生物材料微型模具构建肝脏类 脏的细胞外基质支架。目前,化学试剂、酶类试剂及 物理操作等可对肝脏进行去细胞化,具体操作器官 术主要包括浸泡法和灌注法。 生物材料微型模具法利用高分子材料预先构制铸 其次,在基质支架被再细胞化之前,往往还需要型为细胞生长提供附着点和微环境支持,以期维持特 对其进行特定的人工修饰,以提高再细胞化的效率及定的三维形态结构或发挥特定生理功能,从而形成临 肝脏类器官功能。Uygm等首次对小鼠肝脏基质床可应用的人工器官。肝细胞在二维环境中培养时, 支架进行了再细胞化,进行灌注培养后,再将其辅助增殖能力有限且容易失去肝细胞特定的生物学功能, 移植于小鼠的肾脏部位,结果发现再细胞化的肝脏能而在三维环境中培养时,则能大大提高肝细胞的增殖 够发挥一定的生物功能。然而,再细胞化的肝脏类器能力和生理功能的。因此,许多研究者依照肝脏特有
·338· 器官移植 第8卷 质在肝细胞的增殖、分化及肝内血管形成等方面具有 重要作用 [2] 。实体器官去细胞技术能够保留肝脏的 细胞外基质支架内的血管及胆道结构，甚至许多肝 脏再生相关生长因子 [3] 。基于肝脏基质支架的生物学 结构和功能特点，许多研究者正在尝试利用肝脏基质 支架去构建肝脏类器官 [4-10] 。基于细胞外基质支架构 建肝脏类器官的主要过程包括去细胞化基质支架的制 备、人工修饰基质支架及基质支架的再细胞化等步骤 （图 1）[4] 。 首先，肝脏的细胞外基质支架的制备方法是将同 种或异种来源的肝脏进行去细胞化实现的。2004 年， Lin 等 [11] 首次报道将猪的肝脏去细胞化，获得了肝 脏的细胞外基质支架。目前，化学试剂、酶类试剂及 物理操作等可对肝脏进行去细胞化 [12] ，具体操作技 术主要包括浸泡法和灌注法 [2] 。 其次，在基质支架被再细胞化之前，往往还需要 对其进行特定的人工修饰，以提高再细胞化的效率及 肝脏类器官功能。Uygun 等 [9] 首次对小鼠肝脏基质 支架进行了再细胞化，进行灌注培养后，再将其辅助 移植于小鼠的肾脏部位，结果发现再细胞化的肝脏能 够发挥一定的生物功能。然而，再细胞化的肝脏类器 官植入体内后，血栓形成是阻碍其长期存活并发挥功 能的重要并发症。Ko 等 [7] 尝试用结合血管内皮细胞 的抗体覆盖猪肝脏基质支架的血管内壁，从而实现血 管内皮化，然后进行再细胞化、灌注培养及植入猪体 内，结果发现能够明显延长移植后血栓形成的时间。 此外，为保证肝脏基质支架适合细胞再植及功能发挥， 细胞外基质还需包含足量的重要生长因子，包括肝细 胞生长因子、成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因 子及胰岛素样生长因子等。一方面，通过优化肝脏去 细胞化方案，可使基质支架保留更多的生长因子 [10] ； 另一方面，在去细胞化过程完成后，还可以应用分子 固定技术向细胞外基质添加某些重要的生长因子[13-14] 。 尽管目前已有不少研究报道如何抑制血栓形成及丰富 基质支架内生长因子，但尚无突破性进展，这仍将是 未来研究的热点和难点。 最后，在基质支架再细胞化时，输注细胞的数量 和密度都会影响细胞功能和定植效率 [15] 。细胞种植 途径包括门静脉、肝静脉以及胆道 [2, 6]，种植方式有 直接注射法、单次连续输注法和多步骤连续输注法。 Soto-Gutierrez 等 [8] 对比上述 3 种种植方式，发现在 细胞总数相同的情况下，多步骤连续输注法优于其它 两种方法，更有利于肝细胞定植和功能发挥。此外， 细胞种类也是影响细胞功能和定植效率的重要因素之 一。目前用于再细胞化的细胞包括未成熟肝细胞、胚 胎肝细胞或者与内皮细胞的组合等 [4-10] 。肝脏非实质 细胞（内皮细胞、枯否细胞及星状细胞等）对肝细胞 的增殖和生物功能具有重要作用。研究表明肝细胞和 内皮细胞组合用于基质支架的再细胞化的效果优于单 独使用肝细胞。然而，尚无研究报道肝细胞与枯否细 胞、星状细胞或其他非实质细胞混合用于基质支架再 细胞化的效果。因此，对这部分内容进行深入研究， 将有助于构建结构和功能更加完善的肝脏类器官。 2 通过生物材料微型模具构建肝脏类 器官 生物材料微型模具法利用高分子材料预先构制铸 型为细胞生长提供附着点和微环境支持，以期维持特 定的三维形态结构或发挥特定生理功能，从而形成临 床可应用的人工器官。肝细胞在二维环境中培养时， 增殖能力有限且容易失去肝细胞特定的生物学功能， 而在三维环境中培养时，则能大大提高肝细胞的增殖 能力和生理功能 [2] 。因此，许多研究者依照肝脏特有 图 1 基于肝脏基质支架的培养方法 [4] Figure 1 Culture method based on liver matrix scaffold
第5期 杨扬等.肝脏组织工程研究进展 ·339· 的肝索超微结构,尝试利用人工生物材料结构可控的种植到小室的下层,置于微流体灌注培养室培养一段 待点,将其塑形成具有三维培养条件的微型模具。 时间后,得到了一种结构和功能更接近正常肝脏的肝 研究表明凝胶材料与天然的细胞外基质类似,能脏类器官。最近, Bhatia教授带领团队在进行早期人 够为细胞立体培养提供合适的微环境。 Yamada等工肝脏的研究基础上,将人原代肝细胞、成纤维 利用一种三明治结构式的凝胶纤维模型,在体外构建细胞及内皮细胞嵌入可降解的生物材料微型模具中 出了肝索样组织。这一模型的中间层是肝细胞层,另形成了一种直径约6mm的新型肝脏“组织种子 外两层是营养细胞层(3T3细胞)。他们利用微流体(图2),通过植入肝损伤模型的小鼠腹腔后,在 输注技术,将与水凝胶混合的肝细胞和3T3细胞分别肝脏再生信号的刺激下,肝实质细胞发生增殖,使得 输入中间和两侧的凝胶管道,培养后得到一种肝索样这一“种子”结构扩大了50倍,出现了血管结构及 组织。与传统的单层单种类细胞培养相比,这种组织胆管前体结构,并具备人类肝脏相关的分泌及代谢功 随着培养时间进一步延长,表达的肝细胞特异性蛋白能。该研究利用人工生物材料微型模具在肝细胞 更多,分泌白蛋白和合成尿素能力也明显提高。然而,再生和接种体系方面进行了创新性探索,为肝脏类器 尽管 Yamada等切利用多层细胞立体共培养的方法构官的构建开拓了全新的视野。 建出了肝索样组织,但是该组织的细胞成分和超微结 近年来兴起的3D打印技术在生物医学领域取得 构与自然的肝索结构之间还是有很大差异。正常的肝显著进展,通过3D打印建立适合细胞存活的精确三 索结构应该包括肝细胞和星状细胞构成的肝板、肝板维支架,将生物相容性细胞与相应的诱导体系凝胶混 之间的微胆管、血管内皮细胞和枯否细胞构成的肝窦合喷涂,并将配套的其他细胞、生长因子、信号分子 内皮层、内皮和肝板之间的窦周间隙,且肝脏的非实等叠加于其涂层之上,模拟细胞与内环境的相互关联, 质细胞对肝细胞的极化和功能维持具有重要作用。 在计算机指令下层层打印,形成有生理功能的活体器 Rennert等设计了一种仿真度更高的肝脏类器官,达到修复或替代的目的。美国 Organovo公司将 官构建方案,同样也是一种三明治结构式的微型模具,叠加约20层的肝实质细胞、星状细胞及添加的血管 该模具小室被位于正中平面的带孔的生物膜分割为上内壁细胞通过3D打印获得肝脏微型模具,该结构能 下两层。利用微流体输注技术,将人类脐静脉内皮细向肝细胞供应养分和氧气,使细胞组织可存活5d以 胞与外周血单核细胞按一定比例混合种植到小室上层,上(2。尽管3D打印在组织器官重建领域尚存在瓶颈 而将 HepaRG细胞和星状细胞按一定比例混合后,再但是3D打印与干细胞相结合的技术将会成为未来研 人肝细胞人成纤维细胞肝细胞聚合体内皮细胞索新型肝脏“组织种子”异位移植 聚合体 内皮细胞索 图2基于微型模具制作新型肝脏“组织种子 igure 2 Fabrication of new liver tissue seed based on micro mold
第5期 杨扬等．肝脏组织工程研究进展 ·339· 的肝索超微结构，尝试利用人工生物材料结构可控的 特点，将其塑形成具有三维培养条件的微型模具。 研究表明凝胶材料与天然的细胞外基质类似，能 够为细胞立体培养提供合适的微环境[16] 。Yamada等[17] 利用一种三明治结构式的凝胶纤维模型，在体外构建 出了肝索样组织。这一模型的中间层是肝细胞层，另 外两层是营养细胞层（3T3 细胞）。他们利用微流体 输注技术，将与水凝胶混合的肝细胞和 3T3 细胞分别 输入中间和两侧的凝胶管道，培养后得到一种肝索样 组织。与传统的单层单种类细胞培养相比，这种组织 随着培养时间进一步延长，表达的肝细胞特异性蛋白 更多，分泌白蛋白和合成尿素能力也明显提高。然而， 尽管 Yamada 等 [17] 利用多层细胞立体共培养的方法构 建出了肝索样组织，但是该组织的细胞成分和超微结 构与自然的肝索结构之间还是有很大差异。正常的肝 索结构应该包括肝细胞和星状细胞构成的肝板、肝板 之间的微胆管、血管内皮细胞和枯否细胞构成的肝窦 内皮层、内皮和肝板之间的窦周间隙，且肝脏的非实 质细胞对肝细胞的极化和功能维持具有重要作用。 Rennert 等 [18] 设计了一种仿真度更高的肝脏类器 官构建方案，同样也是一种三明治结构式的微型模具， 该模具小室被位于正中平面的带孔的生物膜分割为上 下两层。利用微流体输注技术，将人类脐静脉内皮细 胞与外周血单核细胞按一定比例混合种植到小室上层， 而将 HepaRG 细胞和星状细胞按一定比例混合后，再 种植到小室的下层，置于微流体灌注培养室培养一段 时间后，得到了一种结构和功能更接近正常肝脏的肝 脏类器官。最近，Bhatia 教授带领团队在进行早期人 工肝脏的研究基础上 [19] ，将人原代肝细胞、成纤维 细胞及内皮细胞嵌入可降解的生物材料微型模具中， 形成了一种直径约 6 mm 的新型肝脏“组织种子” （图 2）[20] ，通过植入肝损伤模型的小鼠腹腔后，在 肝脏再生信号的刺激下，肝实质细胞发生增殖，使得 这一“种子”结构扩大了 50 倍，出现了血管结构及 胆管前体结构，并具备人类肝脏相关的分泌及代谢功 能 [20] 。该研究利用人工生物材料微型模具在肝细胞 再生和接种体系方面进行了创新性探索，为肝脏类器 官的构建开拓了全新的视野。 近年来兴起的 3D 打印技术在生物医学领域取得 显著进展，通过 3D 打印建立适合细胞存活的精确三 维支架，将生物相容性细胞与相应的诱导体系凝胶混 合喷涂，并将配套的其他细胞、生长因子、信号分子 等叠加于其涂层之上，模拟细胞与内环境的相互关联， 在计算机指令下层层打印，形成有生理功能的活体器 官，达到修复或替代的目的。美国 Organovo 公司将 叠加约 20 层的肝实质细胞、星状细胞及添加的血管 内壁细胞通过 3D 打印获得肝脏微型模具，该结构能 向肝细胞供应养分和氧气，使细胞组织可存活 5 d 以 上 [21] 。尽管 3D 打印在组织器官重建领域尚存在瓶颈， 但是 3D 打印与干细胞相结合的技术将会成为未来研 图 2 基于微型模具制作新型肝脏“组织种子” [20] Figure 2 Fabrication of new liver tissue seed based on micro mold
340· 器官移植 第8卷 究的突破方向 其内含有肝芽样组织、造血组织、间质组织及早期神 人工生物材料微型模具有生物相容性、可降解、经组织。 基质孔径可控、促进血管生成的优点,结合自身来源 尽管无支架细胞诱导的立体培养方法能够培育出 的诱导多能干细胞定向分化的细胞种植,所构建的人具有一定结构和功能的肝芽,但该肝芽组织并未形成 工器官可有效避免移植排斥反应的发生,具有独特的正常肝脏所具有的精细管道结构,且体积大小也与正 优势,必将开启器官立体培养的新途径。 常肝脏相差甚远,距离能够直接用于肝移植的阶段还 有非常大距离。究其原因,目前对肝脏发育及成熟相 3通过细胞诱导的无支架培养构建肝脏关的诸多因素尚未完全明确,体外诱导环境暂时很难 类器官 模拟出胚胎发育的真实环境。因此,进一步研究胚胎 细胞诱导的无支架培养,其原理是在体外模拟胚时期肝脏发育的相关因素,对于体外构建出质量更高 胎时期肝脏发育的过程,利用细胞培养微环境的刺激的肝脏类器官具有重要意义。 诱导多能干细胞自发地形成肝芽或肝脏类器官。近年4通过构建嵌合体制备人工肝脏 来,体细胞重编程诱导多能干细胞及多能干细胞定向 肝分化技术的出现和日臻成熟22,为细胞诱导的 嵌合体( chimera)一词源于希腊文,古希腊神 无支架立体培养技术提供了重要基础。 话中描述用它代表羊头、狮身、蛇尾这样一些由不同 研究表明在肝芽建立血供之前,内胚层表皮细种类的动物所拼凑成的怪物,反映了人类最早改造自 胞、间充质细胞和内皮祖细胞之间的生物信息交流在然的愿望。20世纪60年代中期,在高等哺乳动物体 胚胎期肝芽的形成过程中发挥了重要作用∞,而血内得到了由两个或两个以上不同遗传性状组成的胚胎 流动力学的刺激对肝芽的进一步发育成熟具有重要影发育成的个体,这种个体的组织器官是由基因型不同 响。 Takebe等诱导多能干细胞分化为肝脏特的细胞群所组成,称为嵌合体。由于本身的特性,嵌 定内胚层细胞,之后与脐静脉内皮细胞及间充质干细合体在胚胎学、发育生物学、细胞生物学等研究领域, 胞共同培养,形成肝芽,接着异位移植于免疫缺陷小都具有广阔的应用前景。 鼠腹腔内,最终形成血管化的肝脏类器官并发挥肝脏 嵌合肝( chimeric liver)是不同种属肝细胞移植 的代谢功能,提示这种体外构建的肝芽具有临床应用后在受体动物体内形成的含有不同种属肝细胞及其立 的潜能。此外, Takebe等ω还根据体外构建肝芽的体结构的混合肝,是组织工程、人工器官研究的热 经验和胚胎时期其他器官芽发育学的特点,成功地在点领域。1995年,Rhm等首次报道了将大鼠肝 体外构建出了胰腺、肾脏、小肠、肺、心脏及大脑等细胞移植至具有肝毒性基因的白蛋白-尿激酶型血浆 类器官。然而,胚胎发育时期来源于3个胚层的各种纤溶酶原激活物( albumin-urokinase type plasminogen 祖细胞间的协同作用与器官发育息息相关,单纯利用 activator,Ab-uPA)小鼠肝内获得成功,植入的大 上述3种细胞组合的培养模式与自然胎肝发育模式相鼠肝细胞增生完全重建了小鼠肝脏。该实验证明移植 差较远。此外,3种细胞组合的培养模式可能还会遇异种肝细胞可以建立功能性肝脏,提示Ab-uPA小 到细胞来源困难等问题,不利于实际操作。因此,在鼠肝脏可用于广泛物种肝细胞的重建,也为人肝细 Takebe等的研究基础上,Guye等探索了一种仅胞进行小鼠嵌合肝脏动物模型的构建提供了有力的 使用诱导多能干细胞且模拟三胚层协同发育的培养模实验依据。随后,肝脏学研究者尝试着将人肝细胞 式。GATA6是一种重要的肝脏发育相关的转录因子,植入免疫缺陷动物构建含人肝细胞的嵌合肝动物模 在许多与肝脏发育相关的胚胎组织均有表达(如横膈型。由于uPA转基因具有强烈促进外源性肝细胞再 间质及心脏中胚层),同时能维持这些组织中与肝脏生的能力,研究人员将其与免疫缺陷鼠如核基因重组 发育相关生长因子的表达。Gue等圆首先利激活基因2( recombinant activation gene-2,Rag2) 用病毒转染技术获得过表达GATA6的诱导多能干细基因敲除小鼠或重症联合免疫缺陷( severe combined 胞,随后依次在干细胞、非干细胞及肝细胞专用培养 immune deficiency,SCID)小鼠进行杂交,从而获得 基中培养多能干细胞,经过培养后,过表达GATA6满足人鼠嵌合肝模型构建的小鼠山PA/Rag2-和uPA 的多能干细胞自我组装形成了成分复杂的组织团块,SCID模型。2001年,研究证实人源性肝细胞可以在
·340· 器官移植 第8卷 究的突破方向。 人工生物材料微型模具有生物相容性、可降解、 基质孔径可控、促进血管生成的优点，结合自身来源 的诱导多能干细胞定向分化的细胞种植，所构建的人 工器官可有效避免移植排斥反应的发生，具有独特的 优势，必将开启器官立体培养的新途径。 3 通过细胞诱导的无支架培养构建肝脏 类器官 细胞诱导的无支架培养，其原理是在体外模拟胚 胎时期肝脏发育的过程，利用细胞培养微环境的刺激 诱导多能干细胞自发地形成肝芽或肝脏类器官。近年 来，体细胞重编程诱导多能干细胞及多能干细胞定向 肝分化技术的出现和日臻成熟 [22-23] ，为细胞诱导的 无支架立体培养技术提供了重要基础。 研究表明在肝芽建立血供之前，内胚层表皮细 胞、间充质细胞和内皮祖细胞之间的生物信息交流在 胚胎期肝芽的形成过程中发挥了重要作用 [24] ，而血 流动力学的刺激对肝芽的进一步发育成熟具有重要影 响 [25] 。Takebe 等 [26] 诱导多能干细胞分化为肝脏特 定内胚层细胞，之后与脐静脉内皮细胞及间充质干细 胞共同培养，形成肝芽，接着异位移植于免疫缺陷小 鼠腹腔内，最终形成血管化的肝脏类器官并发挥肝脏 的代谢功能，提示这种体外构建的肝芽具有临床应用 的潜能。此外，Takebe 等 [27] 还根据体外构建肝芽的 经验和胚胎时期其他器官芽发育学的特点，成功地在 体外构建出了胰腺、肾脏、小肠、肺、心脏及大脑等 类器官。然而，胚胎发育时期来源于 3 个胚层的各种 祖细胞间的协同作用与器官发育息息相关，单纯利用 上述 3 种细胞组合的培养模式与自然胎肝发育模式相 差较远。此外，3 种细胞组合的培养模式可能还会遇 到细胞来源困难等问题，不利于实际操作。因此，在 Takebe 等的研究基础上，Guye 等 [28] 探索了一种仅 使用诱导多能干细胞且模拟三胚层协同发育的培养模 式。GATA6 是一种重要的肝脏发育相关的转录因子， 在许多与肝脏发育相关的胚胎组织均有表达（如横膈 间质及心脏中胚层），同时能维持这些组织中与肝脏 发育相关生长因子的表达 [29-30] 。Guye 等 [28] 首先利 用病毒转染技术获得过表达 GATA6 的诱导多能干细 胞，随后依次在干细胞、非干细胞及肝细胞专用培养 基中培养多能干细胞，经过培养后，过表达 GATA6 的多能干细胞自我组装形成了成分复杂的组织团块， 其内含有肝芽样组织、造血组织、间质组织及早期神 经组织。 尽管无支架细胞诱导的立体培养方法能够培育出 具有一定结构和功能的肝芽，但该肝芽组织并未形成 正常肝脏所具有的精细管道结构，且体积大小也与正 常肝脏相差甚远，距离能够直接用于肝移植的阶段还 有非常大距离。究其原因，目前对肝脏发育及成熟相 关的诸多因素尚未完全明确，体外诱导环境暂时很难 模拟出胚胎发育的真实环境。因此，进一步研究胚胎 时期肝脏发育的相关因素，对于体外构建出质量更高 的肝脏类器官具有重要意义。 4 通过构建嵌合体制备人工肝脏 嵌合体（chimera）一词源于希腊文，古希腊神 话中描述用它代表羊头、狮身、蛇尾这样一些由不同 种类的动物所拼凑成的怪物，反映了人类最早改造自 然的愿望。20 世纪 60 年代中期，在高等哺乳动物体 内得到了由两个或两个以上不同遗传性状组成的胚胎 发育成的个体，这种个体的组织器官是由基因型不同 的细胞群所组成，称为嵌合体。由于本身的特性，嵌 合体在胚胎学、发育生物学、细胞生物学等研究领域， 都具有广阔的应用前景。 嵌合肝（chimeric liver）是不同种属肝细胞移植 后在受体动物体内形成的含有不同种属肝细胞及其立 体结构的混合肝，是组织工程、人工器官研究的热 点领域。1995 年，Rhim 等 [31] 首次报道了将大鼠肝 细胞移植至具有肝毒性基因的白蛋白 - 尿激酶型血浆 纤溶酶原激活物（albumin-urokinase type plasminogen activator，Alb-uPA）小鼠肝内获得成功，植入的大 鼠肝细胞增生完全重建了小鼠肝脏。该实验证明移植 异种肝细胞可以建立功能性肝脏，提示 Alb-uPA 小 鼠肝脏可用于广泛物种肝细胞的重建，也为人肝细 胞进行小鼠嵌合肝脏动物模型的构建提供了有力的 实验依据。随后，肝脏学研究者尝试着将人肝细胞 植入免疫缺陷动物构建含人肝细胞的嵌合肝动物模 型。由于 uPA 转基因具有强烈促进外源性肝细胞再 生的能力，研究人员将其与免疫缺陷鼠如核基因重组 激活基因 2（recombinant activation gene-2，Rag2） 基因敲除小鼠或重症联合免疫缺陷（severe combined immune deficiency，SCID）小鼠进行杂交，从而获得 满足人鼠嵌合肝模型构建的小鼠 uPA/Rag2-/- 和 uPA/ SCID 模型。2001 年，研究证实人源性肝细胞可以在
第5期 杨扬等.肝脏组织工程研究进展 PA/Rag2-小鼠体内生长繁殖,但是该模型仍然胎中发育成人类器官迈出了重要一步。 不能满足研究人员的需要。2004年, Tateno等倒将 近年来,我们团队也在嵌合体研究领域不断 人源肝细胞移植廴 UPA/SCID小鼠模型,人肝细胞对探索,项鹏教授带领其课题组成功构建了森林姬鼠 病变的小鼠肝组织进行了大规模的替换,并形成了具( apodemus sylvaticus)和小家鼠( mus musculus) 有功能的胆小管圓。此后,科学家们构建了以延胡两个物种的异种嵌合体动物模型,还研究证实食 索酰乙酰乙酸水解酶( fumarylacetoacetate hydrolase,蟹猴胚胎干细胞可在猪体内发育形成猴猪嵌合体 Fah)敲除的Fah小鼠的人鼠嵌合肝模型,从此随着基因组编辑技术的快速发展,利用特异高效的 Fah小鼠肝损伤模型在研究外源细胞在肝脏的定植 CRISPR/Cas9系统多基因同时敲除来解决异种间排斥 状况中得到了广泛应用,与uPA诱导的肝损伤反应和病毒传播等问题,并抑制特定器官的分化、发 模型相比能更方便地调控肝损伤程度。这些研究都为育,使植λ的细胞形成增殖优势,实现定冋的器官再 人的细胞与大动物的细胞形成嵌合体制备人源化器官生,同时通过神经细胞和生殖细胞特异启动子携带自 奠定了重要的基础。 杀基因,避免伦理问题,这一构想将为利用嵌合体成 目前大部分研究者都认为猪更适合作为器官移植功制备人源化器官提供新的思路,有望解决当前全球 的供体。猪的器官体积和生理指标与人类接近、繁殖移植器官短缺的医学难题。 迅速、易于基因改造和修饰、安全性好,是理想的异 种器官供体来源。目前,国际学术界已经对供体猪进5总结 行了大量的基因工程改造,分别获得了a-1,3-半 肝脏是结构和功能极为精细复杂的生命器官,体 乳糖基转移酶基因敲除(α-1,3- galactosyltransferase外再造肝脏之路注定艰难而漫长。组织工程的主要研 gene-knockout,GTKO)、猪内源性逆转录病毒( porcine究方向包括种子细胞、生物材料与组织构建。作为组 endogenous retrovirus,PERV)剔除、Fah敲除及表织工程的最佳种子细胞,干细胞因其高度的自我复制 达人CD46、CD59、TM等的转基因猪。基于规律成和多向分化潜能而备受瞩目。器官发育过程中关键因 簇的间隔短回文重复( clustered regularly interspaced子的研究为人类多能干细胞诱导成肝细胞提供了重要 short palindromic repeats, CRISPR)基因靶向修饰技基础,而去细胞化基质支架、生物材料微型模具、细 术,结合诱导多能干细胞通过囊胚补偿法制备嵌合胞诱导的无支架培养及嵌合体的构建为制备人源化肝 体猪,从而使在猪体内培育人类器官成为可能1。脏提供了有效途径。截至目前,上述方法均还未能再 主要途径是将患者自身的体细胞诱导成多能干细胞后造出可直接用于人体器官移植的肝脏,每种方法都有 注入基因组靶向修饰猪的胚胎,最终制备人源化的器其局限性,有待进一步探索改进。肝脏组织工程技术 官。最近,华人科学家Wu等首次实现了人近年来取得了长足的进步并融合了多种最新生物技术, 诱导多能干细胞与猪早期胚胎成功嵌合,该研究利用通过科研、临床、产业的紧密协作,在人工肝脏的设 人的皮肤组织诱导生成人多能干细胞,再将这些诱导计及制备上获得了可喜的成果。我们相信,人工肝脏 多能干细胞移植到猪的早期胚胎,成功培育出一批人必将成为解决供肝短缺问题的有力武器,为肝脏的替 猪嵌合胚胎(图3),为实现人类细胞在人猪嵌合胚代治疗带来新的希望。 领邮画画 不同培养策略产生的多种类型人诱导多能干细胞 009 荧光检测 2.免疫组化分析 3.基因组分析 囊胚注射 受体 人猪嵌合胚胎 (3~10个细胞) (2128d) 图3人猪嵌合胚胎的培育 igure 3 Cultivation of human and porcine chimeric embryos
第5期 杨扬等．肝脏组织工程研究进展 ·341· uPA/Rag2-/- 小鼠体内生长繁殖 [32] ，但是该模型仍然 不能满足研究人员的需要。2004 年，Tateno 等 [33] 将 人源肝细胞移植入 uPA/SCID 小鼠模型，人肝细胞对 病变的小鼠肝组织进行了大规模的替换，并形成了具 有功能的胆小管 [34] 。此后，科学家们构建了以延胡 索酰乙酰乙酸水解酶（fumarylacetoacetate hydrolase， Fah）敲除的 Fah-/- 小鼠的人鼠嵌合肝模型，从此 Fah-/- 小鼠肝损伤模型在研究外源细胞在肝脏的定植 状况中得到了广泛应用 [35-36] ，与 uPA 诱导的肝损伤 模型相比能更方便地调控肝损伤程度。这些研究都为 人的细胞与大动物的细胞形成嵌合体制备人源化器官 奠定了重要的基础。 目前大部分研究者都认为猪更适合作为器官移植 的供体。猪的器官体积和生理指标与人类接近、繁殖 迅速、易于基因改造和修饰、安全性好，是理想的异 种器官供体来源。目前，国际学术界已经对供体猪进 行了大量的基因工程改造，分别获得了 α-1，3- 半 乳糖基转移酶基因敲除（α-1，3-galactosyltransferase gene-knockout，GTKO）、猪内源性逆转录病毒（porcine endogenous retrovirus，PERV） 剔 除、Fah 敲除及表 达人 CD46、CD59、TM 等的转基因猪。基于规律成 簇的间隔短回文重复（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）基因靶向修饰技 术，结合诱导多能干细胞通过囊胚补偿法制备嵌合 体猪，从而使在猪体内培育人类器官成为可能 [37-41] 。 主要途径是将患者自身的体细胞诱导成多能干细胞后 注入基因组靶向修饰猪的胚胎，最终制备人源化的器 官 [37, 42]。最近，华人科学家 Wu 等 [43] 首次实现了人 诱导多能干细胞与猪早期胚胎成功嵌合，该研究利用 人的皮肤组织诱导生成人多能干细胞，再将这些诱导 多能干细胞移植到猪的早期胚胎，成功培育出一批人 猪嵌合胚胎（图 3），为实现人类细胞在人猪嵌合胚 图 3 人猪嵌合胚胎的培育 [43] Figure 3 Cultivation of human and porcine chimeric embryos 胎中发育成人类器官迈出了重要一步。 近年来，我们团队也在嵌合体研究领域不断 探索，项鹏教授带领其课题组成功构建了森林姬鼠 （apodemus sylvaticus） 和 小 家 鼠（mus musculus） 两个物种的异种嵌合体动物模型 [44] ，还研究证实食 蟹猴胚胎干细胞可在猪体内发育形成猴猪嵌合体 [45] 。 随着基因组编辑技术的快速发展，利用特异高效的 CRISPR/Cas9 系统多基因同时敲除来解决异种间排斥 反应和病毒传播等问题，并抑制特定器官的分化、发 育，使植入的细胞形成增殖优势，实现定向的器官再 生，同时通过神经细胞和生殖细胞特异启动子携带自 杀基因，避免伦理问题，这一构想将为利用嵌合体成 功制备人源化器官提供新的思路，有望解决当前全球 移植器官短缺的医学难题。 5 总 结 肝脏是结构和功能极为精细复杂的生命器官，体 外再造肝脏之路注定艰难而漫长。组织工程的主要研 究方向包括种子细胞、生物材料与组织构建。作为组 织工程的最佳种子细胞，干细胞因其高度的自我复制 和多向分化潜能而备受瞩目。器官发育过程中关键因 子的研究为人类多能干细胞诱导成肝细胞提供了重要 基础，而去细胞化基质支架、生物材料微型模具、细 胞诱导的无支架培养及嵌合体的构建为制备人源化肝 脏提供了有效途径。截至目前，上述方法均还未能再 造出可直接用于人体器官移植的肝脏，每种方法都有 其局限性，有待进一步探索改进。肝脏组织工程技术 近年来取得了长足的进步并融合了多种最新生物技术， 通过科研、临床、产业的紧密协作，在人工肝脏的设 计及制备上获得了可喜的成果。我们相信，人工肝脏 必将成为解决供肝短缺问题的有力武器，为肝脏的替 代治疗带来新的希望