Laser Scanning Confocal Microscopy) 原理 ◆应用 排除焦平面以外光的干扰,增强 图像反差和提高分辨率(1417), 可重构样品的三维结构。 ◆相差显微镜( phase-contrast microscope) 将光程差或相位差转换成振幅差,可用于观察活细胞 ◆微分干涉显微镜( differential-interference microscope) 偏振光经合成后,使样品中厚度上的微小区别转化成 明暗区别,增加了样品反差且具有立体感。适于研究 活细胞中较大的细胞器 ◆录像增差显微镜技术( video- enhance microscopy 计算机辅助的DIC显微镜可在高分辨率 下研究活 细胞中的颗粒及细胞器的运动 电镜与光镜的比较 主要电镜制样技术 超薄切片技术用于电镜观察的样本制备示意图 ●负染色技术( Negative staining)与金属投影 染色背景,衬托出样品的精细结构 ●冰冻蚀刻技术( Freeze etching)(技术示意图) 冰冻断裂与蚀刻复型:主要用来观察膜断裂面的蛋白质 颗粒 和膜表面结构。 快速冷冻深度蚀刻技术( quick freeze deep etching ●电镜三维重构技术 电子显微术、电子衍射与计算机图象处理相结合而形成的 具有重要应用前景的一门新技术 电镜三维重构技术与X射线晶体衍射技术及核磁共振
（Laser Scanning Confocal Microscopy） 原理 应用： 排除焦平面以外光的干扰，增强 图像反差和提高分辨率(1.4—1.7)， 可重构样品的三维结构。 相差显微镜（phase-contrast microscope） 将光程差或相位差转换成振幅差，可用于观察活细胞 微分干涉显微镜（differential-interference microscope） 偏振光经合成后，使样品中厚度上的微小区别转化成 明暗区别，增加了样品反差且具有立体感。适于研究 活细胞中较大的细胞器 录像增差显微镜技术（video-enhance microscopy） 计算机辅助的DIC显微镜可在高分辨率 下研究活 细胞中的颗粒及细胞器的运动 电镜与光镜的比较 主要电镜制样技术 超薄切片技术 用于电镜观察的样本制备示意图 负染色技术（Negative staining）与金属投影 染色背景，衬托出样品的精细结构 冰冻蚀刻技术（Freeze etching） （技术示意图） 冰冻断裂与蚀刻复型：主要用来观察膜断裂面的蛋白质 颗粒 和膜表面结构。 快速冷冻深度蚀刻技术（quick freeze deep etching） 电镜三维重构技术 电子显微术、电子衍射与计算机图象处理相结合而形成的 具有重要应用前景的一门新技术。 电镜三维重构技术与X-射线晶体衍射技术及核磁共振
分析技术相结合,是当前结构生物学( Structura1 Biology) 一主要研究生物大分子空间结构及其相互关系的主要实验手 段 扫描电镜 原理与应用: ●电子"探针"扫描,激发样品表面放出二次电子,探测器收集二次电子 成象。 ●CO2临界点干燥法防止引起样品变形的表面张 力问题 离心分离技术 ●用途:于分离细胞器与生物大分子及其复合物 ●差速离心:分离密度不同的细胞组分 ●密度梯度离心:精细组分或生物大分子的分离 二、细胞内核酸、蛋白质 酶、糖与脂类等的显示方法 ●原理:利用一些显色剂与所检测物质中一些 特殊基团特异性结合的特征,通过显 色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来 判断某种物质在细胞中的分布和含量。 Feulgen Staining 三、特异蛋白抗原的定位与定性 ◆免疫酶标技术 ◆免疫胶体金●免疫荧光技术: 快速、灵敏、有特异性,但其分辨率有限(图) ●蛋白电泳(SDS-PAGE) 与免疫印迹反应( Western-B1ot)
分析技术相结合，是当前结构生物学（Structural Biology） ——主要研究生物大分子空间结构及其相互关系的主要实验手 段。 扫描电镜 原理与应用： 电子“探针”扫描，激发样品表面放出二次电子，探测器收集二次电子 成象。 CO2临界点干燥法防止引起样品变形的表面张 力问题 一、 离心分离技术 用途：于分离细胞器与生物大分子及其复合物 差速离心：分离密度不同的细胞组分 密度梯度离心：精细组分或生物大分子的分离 二、 细胞内核酸、蛋白质、 酶、糖与脂类等的显示方法 原理：利用一些显色剂与所检测物质中一些 特殊基团特异性结合的特征，通过显 色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来 判断某种物质在细胞中的分布和含量。 Feulgen Staining 三、特异蛋白抗原的定位与定性 免疫酶标技术 免疫胶体金免疫荧光技术： 快速、灵敏、有特异性，但其分辨率有限 （图） 蛋白电泳(SDS-PAGE) 与免疫印迹反应(Western-Blot)
●免疫电镜技术 ◆免疫铁蛋白技术 技术 应用:通过对分泌蛋白的定位,可以确定某种蛋白的分泌动态 胞内酶的研究;膜蛋白的定位与骨架蛋白的定位等 四、细胞内特异核酸的定位与定性 ◆光镜水平的原位杂交技术 (同位素标记或荧光素标记的探针) ◆电镜水平的原位杂交技术 (生物素标记的探针与抗生物素抗体相连的胶体金标记结合 ◆PCR技术 五、放射自显影技术 ●原理及应用 ◆利用同位素的放射自显影,对细胞内生物大分子进行定 性、定位与半定量研究; ◆实现对细胞内生物大分子进行动态和追踪研究 步骤 ◆前体物掺入细胞(标记:持续标记和脉冲标记) 放射自显影 六.定量细胞化学分析技术 ●细胞显微分光光度术( Microspectrophotometry ◆利用细胞内某些物质对特异光谱的吸收,测定这些物质 (如核酸与蛋白质等)在细胞内的含量。 包括 紫外光显微分光光度测定法 可见光显微分光光度测定法 ●流式细胞仪( Flow Cytometry ◆主要应用 用于定量测定细胞中的DNA、RNA或某一特异蛋白的含量; 测定细胞群体中不同时相细胞的数量; 从细胞群体中分离某些特异染色的细胞;
免疫电镜技术： 免疫铁蛋白技术 技术 应用：通过对分泌蛋白的定位，可以确定某种蛋白的分泌动态； 胞内酶的研究；膜蛋白的定位与骨架蛋白的定位等 四、细胞内特异核酸的定位与定性 光镜水平的原位杂交技术 （同位素标记或荧光素标记的探针） 电镜水平的原位杂交技术 （生物素标记的探针与抗生物素抗体相连的胶体金标记结合） PCR技术 五、放射自显影技术 原理及应用： 利用同位素的放射自显影，对细胞内生物大分子进行定 性、定位与半定量研究； 实现对细胞内生物大分子进行动态和追踪研究。 步骤： 前体物掺入细胞（标记：持续标记和脉冲标记） ———放射自显影 六．定量细胞化学分析技术 细胞显微分光光度术（Microspectrophotometry） 利用细胞内某些物质对特异光谱的吸收，测定这些物质 （如核酸与蛋白质等）在细胞内的含量。 包括： 紫外光显微分光光度测定法 可见光显微分光光度测定法 流式细胞仪（Flow Cytometry） 主要应用： 用于定量测定细胞中的DNA、RNA或某一特异蛋白的含量； 测定细胞群体中不同时相细胞的数量； 从细胞群体中分离某些特异染色的细胞；
分离DNA含量不同的中期染色体 细胞的培养 ●动物细胞培养 ◆类型:原代培养细胞( primary culture ce1) 继代培养细胞(sub- culture cel1) ◆细胞株( cell strain)正常二倍体,接触抑制 ◆细胞系( cell line)亚二倍体,接触抑制丧失 ●植物细胞 ◆类型:原生质体培养(体细胞培养) 单倍体细胞培养(花药培养) ●非细胞体系(cel1- free system) 细胞工程 ●细胞融合( cell fusion)与细胞杂交( cell hybridization)技术 ●单克隆抗体( monoclone antibody)技术图 ●细胞拆合与显微操作技术 ◆物理法结合显微操作技术(图1、图2) ◆化学法结合离心技术 ◆制备核体( karyoplast)和胞质体( cytoplast)。 ●其它技术 遗传分析( mutant, knock out, knock in) 对细胞生命活动的研究成为当今生命科学发展的瓶颈 对细胞生命活动的研究成为当今生命科学发展的瓶颈 第四章细胞质膜与细胞表面 ●细胞质膜与细胞表面特化结构 ●细胞连接 ●细胞外被与细胞外基质
分离DNA含量不同的中期染色体。 一、细胞的培养 动物细胞培养 类型：原代培养细胞（primary culture cell） 继代培养细胞（sub-culture cell） 细胞株（cell strain） 正常二倍体，接触抑制 细胞系（cell line） 亚二倍体，接触抑制丧失 植物细胞 类型： 原生质体培养 （体细胞培养） 单倍体细胞培养（花药培养） 非细胞体系（cell-free system） 二、细胞工程 细胞融合（cell fusion）与细胞杂交（cell hybridization）技术 单克隆抗体（monoclone antibody）技术 图 细胞拆合与显微操作技术 物理法结合显微操作技术(图1、图2) 化学法结合离心技术 制备核体（karyoplast）和胞质体（cytoplast）。 其它技术 遗传分析（mutant, knock out, knock in） 对细胞生命活动的研究成为当今生命科学发展的瓶颈 对细胞生命活动的研究成为当今生命科学发展的瓶颈 第四章 细胞质膜与细胞表面 细胞质膜与细胞表面特化结构 细胞连接 细胞外被与细胞外基质
第一节细胞质膜与细胞表面特化结构 细胞质膜( plasma membrane),又称细胞膜( cell membrane) 细胞内膜( intracellular membrane);生物膜( biomem brane) 细胞质膜的结构模型 ●膜脂—生物膜的基本组成成分 膜蛋白 确定膜蛋白方向的实验程序 ●光脱色恢复技术 分子生物学技术在膜蛋白研究上的应用 ●生物膜结构特征 细胞质膜的功能 膜骨架与细胞表面的特化结构 第二节细胞连接 ●细胞连接的功能分类 ●封闭连接 锚定连接 ●通讯连接 ●细胞表面的粘连分子 胞质膜的结构模型 ●研究简史 ●结构模型 ●生物膜结构 结构模型 ◆E. Gorter和F. Grendel(1925) 蛋白质-脂类-蛋白质〃三夹板质膜结构模型 ◆J.D. Robertson(1959年): 单位膜模型( unit membrane model) ◆S.J. Singer和G. Nicolson(1972) 生物膜的流动镶嵌模型( fluid mosaic model ◆ K. Simons et al(1997)脂筏模型( lipid rafts model) Functional rafts in cell membranes, Nature 387: 569-572
第一节 细胞质膜与细胞表面特化结构 细胞质膜(plasma membrane),又称细胞膜(cell membrane)。 细胞内膜(intracellular membrane); 生物膜(biomembrane) 细胞质膜的结构模型 膜脂——生物膜的基本组成成分 膜蛋白 确定膜蛋白方向的实验程序 光脱色恢复技术 分子生物学技术在膜蛋白研究上的应用 生物膜结构特征 细胞质膜的功能 膜骨架与细胞表面的特化结构 第二节 细胞连接 细胞连接的功能分类 封闭连接 锚定连接 通讯连接 细胞表面的粘连分子 一、胞质膜的结构模型 研究简史 结构模型 生物膜结构 结构模型 ◆E.Gorter和F．Grendel（1925）: “蛋白质-脂类-蛋白质”三夹板质膜结构模型 ◆J.D.Robertson（1959年）： 单位膜模型(unit membrane model) ◆S.J.Singer和G.Nicolson（1972）： 生物膜的流动镶嵌模型(fluid mosaic model) ◆K.Simons et al(1997): 脂筏模型（lipid rafts model） Functional rafts in Cell membranes. Nature 387:569-572