生物化学:核酸的生物合成 山农大生物化学与分子生物学系 第1页共14页 第九章核酸的生物合成 中心法则 第一节DNA的生物合成 第二节RNA的生物合成 第三节基因工程简介
生物化学: 核酸的生物合成 山农大生物化学与分子生物学系 第 1 页 共 14 页 1 第九章 核酸的生物合成 中心法则 第一节 DNA 的生物合成 第二节 RNA 的生物合成 第三节 基因工程简介
生物化学:核酸的生物合成 山农大生物化学与分子生物学系 第2页共14页 生物与非生物的根本区别在于生物能进行新陈代谢和具有繁殖能力。新陈代谢 为生物个体的生长发育提供了必要的物质和能量,而繁殖和遗传则使生物群体得以 繁衍生息、不断进化。现代科学已经充分证明,核酸是生物遗传的物质基础。除少 数RNA病毒外,几乎所有的生物均以DNA为遗传信息载体。生物的遗传信息以密 码的形式贮存在DNA分子上,表现为特定的核苷酸排列顺序。在细胞分裂过程中, 通过DNA复制把亲代细胞所含的遗传信息忠实地传递给两个子代细胞。在子代细胞 的生长发育过程中,这些遗传信息通过转录传递给RNA,再由RNA通过翻译转变 成相应的蛋白质多肽链上的氨基酸序列,由蛋白质执行各种各样的生物学功能,使 后代表现出与亲代极其相似的遗传特征。 中心法则 复制 DNA 复 翻译 制 RNA 蛋白质 中心法则:遗传信息的传递规律(路线) 复制:以亲代DNA双链中的每一股链为模板,按照碱基配对原则,合成出与 亲代完全相同的两个双链DNA分子的过程。 转录:以DNA为模板,按照碱基配对原则,将DNA分子的遗传信息转移到 RNA分子上的过程 翻译:以RNA为模板,根据三个碱基决定一个AA的原则,合成具有特定AA 顺序的蛋白质的过程。 逆转录:逆转录病毒能以其RNA为模板,合成DNA,称为逆转录。 第一节DNA的生物合成 、DNA的复制 (-)DNA的半保留复制(复制方式)
生物化学: 核酸的生物合成 山农大生物化学与分子生物学系 第 2 页 共 14 页 2 生物与非生物的根本区别在于生物能进行新陈代谢和具有繁殖能力。新陈代谢 为生物个体的生长发育提供了必要的物质和能量，而繁殖和遗传则使生物群体得以 繁衍生息、不断进化。现代科学已经充分证明，核酸是生物遗传的物质基础。除少 数 RNA 病毒外，几乎所有的生物均以 DNA 为遗传信息载体。生物的遗传信息以密 码的形式贮存在 DNA 分子上，表现为特定的核苷酸排列顺序。在细胞分裂过程中， 通过 DNA 复制把亲代细胞所含的遗传信息忠实地传递给两个子代细胞。在子代细胞 的生长发育过程中，这些遗传信息通过转录传递给 RNA，再由 RNA 通过翻译转变 成相应的蛋白质多肽链上的氨基酸序列，由蛋白质执行各种各样的生物学功能，使 后代表现出与亲代极其相似的遗传特征。 中心法则 中心法则：遗传信息的传递规律（路线） 复制：以亲代 DNA 双链中的每一股链为模板，按照碱基配对原则，合成出与 亲代完全相同的两个双链 DNA 分子的过程。 转录：以 DNA 为模板，按照碱基配对原则，将 DNA 分子的遗传信息转移到 RNA 分子上的过程。 翻译：以 RNA 为模板，根据三个碱基决定一个 AA 的原则，合成具有特定 AA 顺序的蛋白质的过程。 逆转录：逆转录病毒能以其 RNA 为模板，合成 DNA，称为逆转录。 第一节 DNA 的生物合成 一、DNA 的复制 （一）DNA 的半保留复制（复制方式） R N A D N A 翻译 蛋白质 复制 复制 转 录 逆转录 ?
生物化学:核酸的生物合成 山农大生物化学与分子生物学系 第3页共14页 1、半保留复制的概念: Watson和 Crick于1953年提出DNA双螺旋结构模型时,就 对其复制的分子机制作出科学的预测。即 在DNA复制过程中,亲代的一个DNA双螺旋分子通过复制形成了两个与原先 的碱基序列完全相同的子代DNA分子,每个子代分子中有一条链来自亲代DNA, 另一条链是新合成的。这样的复制方式,称为半保留复制。 双链DNA复制模型。 半保留复制的证据 1958年M. Meselson和F.MStl利用同位素标记大肠杆菌,首先证明了DNA 半保留复制。P3ll 3、半保留复制的生物学意义 使生物的遗传性保持了相对稳定性。 (二)参与大肠杆菌DNA复制的酶类及有关因子 除模板、四种dNTP、底物、Mg2外,在起始、延长、终止各阶段都需酶及蛋 白因子 l、DNA聚合酶 大肠杆菌中至少有5种,分别命为DNA聚合酶Ⅰ、Ⅲ、Ⅲ、Ⅳ、V。 ①DNA聚合酶I(单体酶:单肽链) 主要功能:负责DNA的损伤修复及在DNA复制中,切除引物,填补空隙的作用 要负责DNA的损伤修复。 若用枯草杆菌蛋白酶处理此酶,可得两个片段 a.分子量76KD,有5→3聚合酶和3→5外切酶活力,叫 Klenow片段。3→5 外切活性能及时切除错配核苷酸(发生错配时,此E活性提高),与53→33聚 合活性共同保证DNA复制的过程中的高保真度。广泛用于DNA序列分析和其它 究 b.分子量34kD,5→3外切酶活力 作用于双链DNA的碱基配对部分,从5'端切下单核苷酸或寡核苷酸 在DNA损伤修复和切除RNA引物中发挥作用 ②DNA聚合酶Ⅱ(单体酶 主要功能参于DNA的损伤修复
生物化学: 核酸的生物合成 山农大生物化学与分子生物学系 第 3 页 共 14 页 3 1、半保留复制的概念：Watson 和 Crick 于 1953 年提出 DNA 双螺旋结构模型时，就 对其复制的分子机制作出科学的预测。即 在 DNA 复制过程中，亲代的一个 DNA 双螺旋分子通过复制形成了两个与原先 的碱基序列完全相同的子代 DNA 分子，每个子代分子中有一条链来自亲代 DNA， 另一条链是新合成的。这样的复制方式，称为半保留复制。 双链 DNA 复制模型。 2、半保留复制的证据 1958 年 M. Meselson 和 F. M. Stall 利用同位素标记大肠杆菌，首先证明了 DNA 半保留复制。P311 3、 半保留复制的生物学意义 使生物的遗传性保持了相对稳定性。 （二）参与大肠杆菌 DNA 复制的酶类及有关因子 除模板、四种 dNTP、底物、Mg2+外，在起始、延长、终止各阶段都需酶及蛋 白因子。 1、DNA 聚合酶 大肠杆菌中至少有 5 种，分别命为 DNA 聚合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ。 ①DNA 聚合酶 I（单体酶：单肽链） 主要功能：负责 DNA 的损伤修复及在 DNA 复制中，切除引物，填补空隙的作用。 主要负责 DNA 的损伤修复。 若用枯草杆菌蛋白酶处理此酶，可得两个片段： a.分子量 76KD，有 5’→3’聚合酶和 3’→5’外切酶活力，叫 Klenow 片段。3’ →5’ 外切活性能及时切除错配核苷酸（发生错配时，此 E 活性提高），与 5’→3’聚 合活性共同保证 DNA 复制的过程中的高保真度。广泛用于 DNA 序列分析和其它 研究。 b.分子量 34kD，5’→3’外切酶活力。 作用于双链 DNA 的碱基配对部分，从 5’端切下单核苷酸或寡核苷酸。 在 DNA 损伤修复和切除 RNA 引物中发挥作用。 ②DNA 聚合酶Ⅱ（单体酶） 主要功能参于 DNA 的损伤修复
生物化学:核酸的生物合成 山农大生物化学与分子生物学系第4页共14页 具有5→3聚合活力,较弱,3→5外切活性。但无5→3外切活性 ⑧DNA聚合酶Ⅲ(寡聚酶) 是催化大肠杆菌DNA复制的主酶 全酶有10种亚基,含Zn a亚基有5→3聚合活力 e亚基有3’→5’外切活性 形成 →>低活性的核心或 polly 0刺激e的3’→5外切活力 β亚基大约把酶的核心夹于模板上,从而提高全酶的工作能力。 ④DNA聚合酶IV和V 与DNA的修复有关。(1999鉴定) 2、引发酶和引发体 所有DNA聚合E都只能在模板链指令下,在引物(通常为RNA)3′-OH端添加 新核苷酸(延伸新链)功能,没有从头合成活力。 引发酶合成一小段RNA引物(有游离的3′-0H),作为DNA合成的引物 引发酶为一条单链多肽,单独存在时相当不活泼,只有与几种辅助蛋白组装成 引发体,才有合成引物活性。 3、DNA连接藤 催化双链DNA中一条链上缺口的共价连接,形成3′,5′—一磷酸二酯键。缺 口上的3′一0H,5′一磷酰基必须相邻。如果缺少一个或几个核苷酸残基,连接酶 不能将缺口弥合。也不能将两条游离的单链连接起来。需要消耗能量,大肠杆菌 NAD’,真核细胞ATP。 4、DNA解螺旋酶 DNA双螺旋在复制和修复中都必须解链,以便提供单链DNA模板。催化DNA双 螺旋解链,都有依赖双链DNA的 ATPase活性。水解ATP提供解链所需能量。 5、单链DNA结合蛋白 SSB结合蛋白的作用: DNA双螺旋经解螺旋酶解链形成的单链很快被SB所覆盖。 ①保护单链DNA免遭核酸的降解,使单链DNA保持伸展态,以便作为模板。 ②降低DMA的Tm,促进DNA解链。原核细胞SSB有协同效应,真核细胞无 协同效应:先结合到已存在的单链区,其后的SSB的结合能力可提高10倍,表现出协同效应
生物化学: 核酸的生物合成 山农大生物化学与分子生物学系 第 4 页 共 14 页 4 具有 5’→3’聚合活力，较弱，3’→5’外切活性。但无 5’→3’外切活性。 ③DNA 聚合酶 Ⅲ（寡聚酶） 是催化大肠杆菌 DNA 复制的主酶 全酶有 10 种亚基，含 Zn2+ β亚基大约把酶的核心夹于模板上，从而提高全酶的工作能力。 ④DNA 聚合酶 IV 和 V 与 DNA 的修复有关。 （1999 鉴定） 2、引发酶和引发体 所有 DNA 聚合 E 都只能在模板链指令下，在引物（通常为 RNA）3′－OH 端添加 新核苷酸（延伸新链）功能，没有从头合成活力。 引发酶合成一小段 RNA 引物（有游离的 3′－OH），作为 DNA 合成的引物。 引发酶为一条单链多肽，单独存在时相当不活泼，只有与几 种辅助蛋白组装成 引发体，才有合成引物活性。 3、DNA 连接酶 催化双链 DNA 中一条链上缺口的共价连接，形成 3ˊ，5ˊ－－磷酸二酯键。缺 口上的 3′－OH，5ˊ－磷酰基必须相邻。如果缺少一个或几个核苷酸残基，连接酶 不能将缺口弥合。也不能将两条游离的单链连接起来。需要消耗能量，大肠杆菌 NAD+ ，真核细胞 ATP。 4、DNA 解螺旋酶 DNA 双螺旋在复制和修复中都必须解链，以便提供单链 DNA 模板。催化 DNA 双 螺旋解链，都有依赖双链 DNA 的 ATPase 活性。水解 ATP 提供解链所需能量。 5、单链 DNA 结合蛋白 SSB 结合蛋白的作用： DNA 双螺旋经解螺旋酶解链形成的单链很快被 SSB 所覆盖。 ①保护单链 DNA 免遭核酸的降解，使单链 DNA 保持伸展态，以便作为模板。 ②降低 DNA 的 Tm，促进 DNA 解链。原核细胞 SSB 有协同效应，真核细胞无。 协同效应：先结合到已存在的单链区，其后的 SSB 的结合能力可提高 103 倍，表现出协同效应。 ΠΙ → → → ⎯⎯ →⎯ ⎪⎭ ⎪ ⎬ ⎫ 低活性的核心或pol 形成 θ刺激ε的3' 5'外切活力 ε亚基有3' 5'外切活性 a亚基有5' 3'聚合活力
生物化学:核酸的生物合成 山农大生物化学与分子生物学系 第5页共14页 6、拓扑异构E 大肠杆菌(原核生物)DNA为双链环形,其三级结构为麻花状超螺旋形式,连 环数是表示超螺旋的一个参数。大小和一级结构完全相同的DNA分子,可因连环数 不同而形成一系列拓扑异构体 引起拓扑异构反应的E,亦称旋转酶。有两种类型 拓扑异构酶Ⅰ,松解螺旋,能切开一条DNA链在复制叉前面的一段DNA的一个 磷酸二酯键,允许该DNA链绕着另一条完整的DNA链自由旋转,而后由拓扑异构 酶重新形成磷酸二酯键。(不需ATP,可切无DMA双螺旋中的一条链) 拓扑异构酶Ⅱ(旋转E)细菌环形DNA复制后,两个DNA分子是互锁的。该酶结 合到一双链DNA环上,造成一暂时性的双链断裂,另一DNA环正好从这一断裂处穿 过,然后拓扑异构酶重新封上这个链的断口。(引入负超螺旋,需ATP,消除复制叉 前进时产生的扭曲张力。在无ATP时,可松解负超螺旋。可同时切断DNA双链。) 三)原核生物DNA复制 nIdATP dgtP dNA+ DN聚合E,DNA+(n1+n+n+n4)PPi n3dCTP n4dTTP 以四种dNTP为底物在DNA模板指令下,按碱基配对的原则,由DNA聚合酶催化,向 DNA的3′-0H端添加核苷酸,以5→3的方向合成与模板互补的新链 1、复制的起始 原核生物:特定位点开始,特定位点终止,只有一个复制子。(基因组能独立进 行复制的单位)。 真核生物:多个位点起始,多复制子。 大肠杆菌复制起始点:oriC 终止点:ter 些特殊的Pr可以识别并结合到复制起点,随即使DNA双螺旋局部解链,形成 复制眼,在其两端的DNA的两股链呈丫字状,称为复制叉。分别向两侧进行复制 通常复制叉双向等速前进,某些质粒,病毒和细胞器DNA的复制可以单向或是不等 速的或是先合成一条链后再合成另一条链
生物化学: 核酸的生物合成 山农大生物化学与分子生物学系 第 5 页 共 14 页 5 6、拓扑异构 E 大肠杆菌（原核生物）DNA 为双链环形，其三级结构为麻花状超螺旋形式，连 环数是表示超螺旋的一个参数。大小和一级结构完全相同的 DNA 分子，可因连环数 不同而形成一系列拓扑异构体。 引起拓扑异构反应的 E，亦称旋转酶。有两种类型： 拓扑异构酶Ⅰ，松解螺旋，能切开一条 DNA 链在复制叉前面的一段 DNA 的一个 磷酸二酯键，允许该 DNA 链绕着另一条完整的 DNA 链自由旋转，而后由拓扑异构 酶重新形成磷酸二酯键。（不需 ATP，可切无 DNA 双螺旋中的一条链） 拓扑异构酶Ⅱ（旋转 E）细菌环形 DNA 复制后，两个 DNA 分子是互锁的。该酶结 合到一双链 DNA 环上，造成一暂时性的双链断裂，另一 DNA 环正好从这一断裂处穿 过，然后拓扑异构酶重新封上这个链的断口。（引入负超螺旋，需 ATP，消除复制叉 前进时产生的扭曲张力。在无 ATP 时，可松解负超螺旋。可同时切断 DNA 双链。） （三）原核生物 DNA 复制 以四种 dNTP 为底物在 DNA 模板指令下，按碱基配对的原则，由 DNA 聚合酶催化，向 DNA 的 3′－OH 端添加核苷酸，以 5’→3’的方向合成与模板互补的新链。 1、复制的起始 原核生物：特定位点开始，特定位点终止，只有一个复制子。（基因组能独立进 行复制的单位）。 真核生物：多个位点起始，多复制子。 大肠杆菌复制起始点：oriC 终止点：ter 一些特殊的 Pr 可以识别并结合到复制起点，随即使 DNA 双螺旋局部解链，形成 复制眼，在其两端的 DNA 的两股链呈丫字状，称为复制叉。分别向两侧进行复制， 通常复制叉双向等速前进，某些质粒，病毒和细胞器 DNA 的复制可以单向或是不等 速的或是先合成一条链后再合成另一条链。 ⎯DNA ⎯ → ⎯聚合⎯⎯E 2+ Mg n1dATP n2dGTP n3dCTP n4dTTP DNA + DNA+(n1+n2+n3+n4)PPi