2.若久后柱子很堵或很脏，使完毕后，2MNaCI过5CV-ddH2O过5CV→5CV0.2MNaOH冲洗柱子，消化杂物一10CVddH2O冲洗NaOH→最后2CV20%酒精填充柱子，常温保存。/疏水柱（Phenyl）简介1.HIC5mL基本信息Hitrap Phenyl HP45mLFtap PenBed VolumeFlowRate3mL/minePressure Max+4 bar [0.4 MPa]-HitrapPhenytHP,5mStorage Conditions4to30°C,20%Ethanol疏水柱清洁方法11.使用完毕后，5CV的20mMTris清洗残留的蛋白一5CV的ddH2O清洗Tris-2CV20%酒精填充柱子，于保存。2.若久后柱子很堵或很脏，使用完毕后，用5CV2MNaCI清洗残留的蛋白-→5CVddH2O清洗NaCI→5CV0.2MNaOH消化冲洗不掉的内含物—→10CVddH2O再次冲洗→2CV20%酒精填充柱子，用于保存。ProteinA/G简介1.ProteinA5mL基本信息ProteinAtBed Volume5mLFlowRate3mL/minPressure Max0.4MPaProteinA,5mLStorage Conditions+4to30C.20%Ethanol2.ProteinG1mL基本信息ProteinG1mL.Bed Volume.FlowRate1mL/minPressureMax0.4MPaStorage Conditions4to30C,20%EthanolProtein G, 1mLProteinA/G清洁方法用洗脱缓冲液（0.1MGlycine-HCIpH2.7）洗脱十个柱体积，ddH2O洗，最后保存在20%乙醇中，放4C冰箱。GST简介
2. 若久后柱子很堵或很脏，使完毕后，2 M NaCl过5 CV→ddH2O过5 CV→5 CV 0.2 M NaOH 冲洗柱 子，消化杂物→10 CV ddH2O冲洗NaOH →最后2 CV 20%酒精填充柱子，常温保存。 ► 疏水柱（Phenyl）简介 1. HIC 5 mL基本信息 ► 疏水柱清洁方法 1.使用完毕后，5 CV的 20 mM Tris清洗残留的蛋白→5 CV的ddH2O清洗Tris→2 CV 20%酒精填充柱子， 于保存。 2. 若久后柱子很堵或很脏，使用完毕后，用5 CV 2 M NaCl清洗残留的蛋白→5 CV ddH2O清洗NaCl→5 CV 0.2 M NaOH消化冲洗不掉的内含物→10 CV ddH2O再次冲洗→2 CV 20%酒精填充柱子，用于保存。 ► Protein A/G简介 1. Protein A 5 mL基本信息 2. Protein G 1 mL基本信息 ► Protein A/G清洁方法 用洗脱缓冲液（0.1 M Glycine-HCl pH 2.7）洗脱十个柱体积，ddH2O洗，最后保存在20%乙醇中，放 4 °C冰箱。 ► GST 简介
1.GST5mL基本信息GST.5mL.Bed VolumeFlowRate3mL/minPressure Max0.4 MPaGST,5mLStorage Conditions4to30°C,20%Ethanol1GST清洁方法1.沉淀或变性物质的清洗：先用2倍柱体积6M盐酸胍清洗，再用5倍柱体积纯化缓冲液PBS平衡柱子。2.疏水缔合物质的清洗：先用3~4倍柱体积70%乙醇（或2倍柱体积去垢剂，如1%TritonX-100）清洗柱子，再用5倍柱体积纯化缓冲液PBS平衡介质。实验室常用柱子类型统计柱类型数量（根）分子筛5Superdex TM 200, 24 mL2Superdex TM 75, 24 mL2Superdex TM 200, 380 mL1Superdex TM 200, 300 mLSuperdex TM 200, 120 mL21BioRad Erich TM sEC650, 24 mL1离子交换柱Source Q15 Max, 8 mL1Source Q15 tricorn, 2 mL1SourceO15tricorn,1mL1CMSepharoseFastFlow,10mL若干Ni-NTAHisTrapTMHP,1mL,5mL,20mL2GSTGST. 5 mL若干疏水柱HIC,5mL4ProteinA/GProtein A,5mL2Protein G,ImL3.2.3透析袋的使用简介（INTRODUCTION）透析袋应用：除盐、除少量有机溶剂、除生物小分子杂质、浓缩样品。透析的动力是扩散压，扩散压是由横跨膜两边的浓度梯度形成的。透析的速度反比于膜的厚度，正比于欲透析的小分子溶质在膜内外两边的浓度梯度，还正比于膜的面积和温度，通常是4°C透析，升高温度可加快透析速度。使用步骤（PROCEDURE）1.选择合适的透析袋1)选择合适的截留分子量选择截留分子量值约为要保留的大分子分子量的一半，以获得至少90%的保留率。（对于需对几种分子进行分离的应用，分子之间的分子量差至少为5倍，才能完成有效的膜透析。分子量差超过100倍时，可以同时保证高收率和高纯度。）2）选择适当的扁平宽度（体积）透析袋扁平宽度的选择取决于样品体积和透析容量。较小的透析管透析更快；较大的透析管因扩散距离较长透析较慢。为易于使用，建议使用总长（包括闭合夹和顶部空间）为大约10~15cm的
► GST清洁方法 1. 沉淀或变性物质的清洗：先用2倍柱体积6 M盐酸胍清洗，再用5倍柱体积纯化缓冲液PBS平衡柱子。 2. 疏水缔合物质的清洗：先用3~4倍柱体积70%乙醇 (或2倍柱体积去垢剂，如 1% Triton™ X-100) 清洗柱 子，再用5倍柱体积纯化缓冲液PBS平衡介质。 ► 实验室常用柱子类型统计 柱类型 数量（根） 分子筛 SuperdexTM 200, 24 mL 5 SuperdexTM 75, 24 mL 2 SuperdexTM 200, 380 mL 2 SuperdexTM 200, 300 mL 1 SuperdexTM 200, 120 mL 2 BioRad Erich TM SEC650, 24 mL 1 离子交换柱 Source Q15 Max, 8 mL 1 Source Q15 tricorn, 2 mL 1 Source Q15 tricorn, 1 mL 1 CM Sepharose Fast Flow, 10 mL 1 Ni-NTA HisTrapTM HP, 1 mL，5 mL，20 mL 若干 GST GST, 5 mL 2 疏水柱 HIC, 5 mL 若干 Protein A/G Protein A, 5 mL 4 Protein G, 1mL 2 3.2.3 透析袋的使用 简介（INTRODUCTION） 透析袋应用：除盐、除少量有机溶剂、除生物小分子杂质、浓缩样品。 透析的动力是扩散压，扩散压是由横跨膜两边的浓度梯度形成的。透析的速度反比于膜的厚度，正比 于欲透析的小分子溶质在膜内外两边的浓度梯度，还正比于膜的面积和温度，通常是4 °C透析，升高温度 可加快透析速度。 使用步骤（PROCEDURE） 1. 选择合适的透析袋 1) 选择合适的截留分子量 选择截留分子量值约为要保留的大分子分子量的一半，以获得至少90%的保留率。（对于需对几 种分子进行分离的应用，分子之间的分子量差至少为5倍，才能完成有效的膜透析。分子量差超过 100倍时，可以同时保证高收率和高纯度。） 2) 选择适当的扁平宽度（体积） 透析袋扁平宽度的选择取决于样品体积和透析容量。较小的透析管透析更快；较大的透析管因扩 散距离较长透析较慢。为易于使用，建议使用总长（包括闭合夹和顶部空间）为大约10~15 cm的
透析袋。3）选择适合的透析膜材质对于球蛋白，相对的结合亲和性由低到高为CE<RC<PVDF。2.透析袋使用前处理实验要求不高的，用沸水煮5至10min，再用蒸馏水洗净，即可使用。对于即用型透析袋：用去离子水清洗即可使用的（这种透析袋具有特殊的生物技术膜，不含硫化物及金属杂质）。3.透析过程控制1）透析液体积：建议为样品体积量的100倍。2）透析时间：根据需求。通常允许过夜透析。在持续透析的过程中，至少要进行3次全部更换透析液。建议在透析后2~4h，6~8h和10~14h更换透析液。最后换液后至少继续进行2小时的透析。注意：对于高浓度污染物，样品可能需要较长的时间透析，透析液需要更频繁的更换。3）透析温度：主要取决于样品。温度最高限制主要取决于膜的类型。纤维素透析袋可以承受的温度高达37℃。再生纤维素透析袋可以承受的温度可高达60℃C。4.透析袋浓缩样品1）吹干浓缩法：将蛋白溶液装入透析袋内，放在风扇下吹。此法简单，但速度慢，且温度最好不要超过15℃C。2）透析袋浓缩法：将蛋白溶液放入透析袋（无透析袋可用玻璃纸代替），把高分子（6000~12000）聚合物如聚乙二醇（碳蜡）、聚乙烯吡咯、烷酮等或蔗糖撒在透析袋外即可。也可将吸水剂配成30%40%浓度的溶液，将装有蛋白液的透析袋放入即可。吸水剂用过后，可放入温箱中烘干或自然干燥后，仍可再用。5.透析袋的存储1)在适当的储存条件下，保质期一般在两年以上。干燥的透析袋要在室温或4°C储存在聚乙烯袋中。未开封的透析袋4C储存。2）透析袋一且变湿，应浸泡在溶液中，不要让透析袋干燥。不断干燥会造成孔隙结构不可恢复的倒塌。3）使用后的透析袋洗净后可存于4℃C蒸馏水或者30%乙醇中，确保透析袋始终浸没在溶液内。若长时间不用，可加少量NaN3，以防长菌。从此时起，取用透析袋必须戴手套。3.2.4浓缩管的使用简介（INTRODUCTION）超滤管的应用：浓缩，脱盐、换Buffer及部分纯化功能。Millipore离心超滤管这里主要介绍Millipore离心超滤管。使用步骤（PROCEDURE）1.选对截留分子量的浓缩管
透析袋。 3) 选择适合的透析膜材质 对于球蛋白，相对的结合亲和性由低到高为CE＜RC＜PVDF。 2. 透析袋使用前处理 实验要求不高的，用沸水煮5至10 min，再用蒸馏水洗净，即可使用。对于即用型透析袋：用去离子水 清洗即可使用的（这种透析袋具有特殊的生物技术膜，不含硫化物及金属杂质）。 3.透析过程控制 1) 透析液体积：建议为样品体积量的100倍。 2) 透析时间：根据需求。通常允许过夜透析。在持续透析的过程中，至少要进行3次全部更换透析 液。建议在透析后2~4 h，6~8 h和10~14 h更换透析液。最后换液后至少继续进行2小时的透析。 ▲ 注意：对于高浓度污染物，样品可能需要较长的时间透析，透析液需要更频繁的更换。 3) 透析温度：主要取决于样品。温度最高限制主要取决于膜的类型。纤维素透析袋可以承受的温度高 达37 °C。再生纤维素透析袋可以承受的温度可高达60 °C。 4. 透析袋浓缩样品 1) 吹干浓缩法：将蛋白溶液装入透析袋内，放在风扇下吹。此法简单，但速度慢，且温度最好不要超 过15 °C。 2) 透析袋浓缩法：将蛋白溶液放入透析袋（无透析袋可用玻璃纸代替），把高分子（6000~12000） 聚合物如聚乙二醇（碳蜡）、聚乙烯吡咯、烷酮等或蔗糖撒在透析袋外即可。也可将吸水剂配成 30%~40%浓度的溶液，将装有蛋白液的透析袋放入即可。吸水剂用过后，可放入温箱中烘干或自 然干燥后，仍可再用。 5. 透析袋的存储 1) 在适当的储存条件下，保质期一般在两年以上。干燥的透析袋要在室温或4 °C储存在聚乙烯袋中。 未开封的透析袋4 °C储存。 2) 透析袋一旦变湿，应浸泡在溶液中，不要让透析袋干燥。不断干燥会造成孔隙结构不可恢复的倒 塌。 3) 使用后的透析袋洗净后可存于4 °C蒸馏水或者30%乙醇中，确保透析袋始终浸没在溶液内。若长时 间不用，可加少量NaN3，以防长菌。从此时起，取用透析袋必须戴手套。 3.2.4 浓缩管的使用 简介（INTRODUCTION） 超滤管的应用：浓缩，脱盐、换Buffer及部分纯化功能。 这里主要介绍Millipore离心超滤管。 使用步骤（PROCEDURE） 1. 选对截留分子量的浓缩管
Table3.Typical Retention of Protein MarkersMolecularDevice% Retention%RetentionSpinTimeMarker/ConcentrationWeightNMWLSwinging BucketFixedAngle(min)a-Chymotrypsinogen(1mg/mL)25,0003K>95>9560Cytochromec(0.25mg/mL)12.400>95>9560VitaminB-12(0.2mg/ml)1,350<25<256010Ka-Chymotrypsinogen.(1mg/mL)25,000>95>9530Cytochromec(0.25mg/mL)12,400>95>9530VitaminB-12(0.2mg/mL)1,350<5<530BSA(1mg/mL)67.00030K>95>9520Ovalbumin(1mg/mL)45,000>95>9520Cytochromec(0.25mg/mL)12.40010<1020Vitamin.B-12(0.2:mg/mL)1,350<5<S20BSA (1mg/mL)67.00050K>90>9010Ovalbumin(1mg/mL)45,000~65~5510Cytochromec(0.25mg/mL)12,400<5<510Thyroglobulin(o.5mg/mt)677.000100K>90>9020IgG(1mg/mL)156,000>90>9020Ovalbumin(1mg/mL)45.000≤25<1520SpinConditionsforTables3and4:Swingingbucketrotor(4.o00xg.15mLstartingvolume).orfixedanglerotor(5,000×g,12mlstartingvolume),roomtemperature,n=6 (meanvalueof3membranelots).2.使用前处理1)清洗A.新的超滤管用buffer清洗后可直接使用。B.重复使用的超滤管：旧浓缩管使用前处理0.1M的NaOH浸泡1~2h用水清洗用相关溶液（灭菌水或PBS）离心清洗3次即可用于浓缩新的蛋白清洗过程不可马虎2）判断超滤离心管是否失效取一相同截留的对照管加水离心，根据滤下速度判断是否失效。或者通过测定滤下液的蛋白浓度判断。3.使用过程控制1）离心转速：离心机转速一般采用3000rpm（一般建议为3000g，最大不能超过4000g）。速度过高，目的蛋白会离下，导致目的蛋白丢失；速度过低，耗时，工效低；超滤离心管不能高温高压灭菌（也可参照上文表格）。2）减少吸附损失：滤膜会吸附蛋白，最高可达30%；吸尽蛋白后，再用蛋白buffer吹洗管底。注意用枪头（200μL）伸入超滤管中时，必须防止碰到滤膜，以免戳破滤膜。4.回收保存不常用的超滤离心管的处理：用0.1M的NaOH溶液浸泡1~2h，用水清洗，用20%的乙醇浸泡保存，务必保持滤膜润湿，不能长菌。（注：常检查）。浓缩管脱盐
2. 使用前处理 1) 清洗 A.新的超滤管用buffer清洗后可直接使用。 B. 重复使用的超滤管： 旧浓缩管使用前处理 0.1 M的NaOH浸泡1~2 h 用水清洗 用相关溶液（灭菌水或PBS）离心清洗3次 即可用于浓缩新的蛋白 ▲ 清洗过程不可马虎 2) 判断超滤离心管是否失效 取一相同截留的对照管加水离心，根据滤下速度判断是否失效。或者通过测定滤下液的蛋白浓度 判断。 3. 使用过程控制 1) 离心转速： 离心机转速一般采用3000 rpm（一般建议为3000 g，最大不能超过4000 g）。速度过高，目的蛋 白会离下，导致目的蛋白丢失；速度过低，耗时，工效低；超滤离心管不能高温高压灭菌（也可 参照上文表格）。 2) 减少吸附损失： 滤膜会吸附蛋白，最高可达30％；吸尽蛋白后，再用蛋白buffer吹洗管底。注意用枪头（200 μL）伸入超滤管中时，必须防止碰到滤膜，以免戳破滤膜。 4. 回收保存 不常用的超滤离心管的处理：用0.1 M的NaOH溶液浸泡1~2 h，用水清洗，用20％的乙醇浸泡保存，务 必保持滤膜润湿，不能长菌。（注：常检查）。 ► 浓缩管脱盐
t0入14.8mlIomMNaCu进定的冲漆第心浓姆200uL15ml15m200μL1mg/mLate1mg/mL送白75mg/mL白75.mg/mL蛋白样品，食有群品，合有群品，合有样品：食有100mM11.2mMNac100mMNaa112mMNacNad100mM11.2mMNadNad三使用超滤离心管进行脱盐处理3.2.5TEV蛋白酶的使用简介（INTRODUCTION）TEVProtease是一种在大肠杆菌中重组表达的带His标签（6xHistag）的烟草蚀纹病毒（TobaccoEtchViruS，TEV）的半胱氨酸蛋白酶，能特异性地识别七肽序列Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly/Ser，并在Gln和Gly/Ser氨基酸残基之间进行酶切，常用于去除融合蛋白的MBP、GlutathioneS-transferase（GST)、His或者其它标签的蛋白酶。材料（MATERIALS）试剂（REAGENTS）Buffer：Tris-HCIpH8.0EGFP蛋白TEV酶使用步骤（PROCEDURE）在这里分别用了四种不同的反应条件来测定TEV酶的蛋白酶活，以下逐个进行介绍。1.EGFP为带有TEV酶切位点的目的蛋白，浓度为0.37mg/mL，使用TEV和EGFP不同的摩尔比例1：10，1:20，1:40，1：80，1:160，1:320分别放置在冰上4°C和室温测试TEV酶切活性。南2.EGFP为带有TEV酶切位点的目的蛋白，浓度为0.37mg/mL，按照TEV和EGFP摩尔比例1：10分别放置在冰上4C和室温测试不同时间点的酶切效果，检测TEV酶切活性针对性建议（TROUBLESHOOTING）1.综上四个不同条件的酶切效果，在保证目的蛋白拥有良好状态的情况下，建议使用TEV和目的蛋白摩尔比例为1：10放置在四度冰箱或冰上过夜酶切。2.在使用TEV酶切蛋白时，需要蛋白buffer中存在DTT，因此最好不要一边透析一边酶切，酶切和透析分开来做，这样有助于实现良好的酶切效果。3.TEV加入量计算公式：TEV(ml)=(0D280grotih+Fproten 10)/Dagrtet 0.1 XVprete)/(0D280rEv+ 1.121 ×10/28.745)OD280：目的蛋白的OD280E：目的蛋白的消光系数M：目的蛋白的分子量（kDa）V：目的蛋白体积
3.2.5 TEV蛋白酶的使用 简介（INTRODUCTION） TEV Protease是一种在大肠杆菌中重组表达的带His标签（6×His tag）的烟草蚀纹病毒（Tobacco Etch Virus，TEV）的半胱氨酸蛋白酶，能特异性地识别七肽序列Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly/Ser，并在Gln和 Gly/Ser氨基酸残基之间进行酶切，常用于去除融合蛋白的MBP、Glutathione S-transferase (GST)、His或者 其它标签的蛋白酶。 材料（MATERIALS） r 试剂（REAGENTS） Buffer：Tris-HCl pH 8.0 EGFP蛋白TEV酶 使用步骤（PROCEDURE） 在这里分别用了四种不同的反应条件来测定TEV酶的蛋白酶活，以下逐个进行介绍。 1. EGFP为带有TEV酶切位点的目的蛋白，浓度为0.37 mg/mL，使用TEV和EGFP不同的摩尔比例1：10， 1：20，1：40，1：80，1：160，1：320分别放置在冰上4 °C和室温测试TEV酶切活性。 2. EGFP为带有TEV酶切位点的目的蛋白，浓度为0.37 mg/ mL，按照TEV和EGFP摩尔比例1：10分别放置 在冰上4 °C和室温测试不同时间点的酶切效果，检测TEV酶切活性。 针对性建议（TROUBLESHOOTING） 1. 综上四个不同条件的酶切效果，在保证目的蛋白拥有良好状态的情况下，建议使用TEV和目的蛋白摩尔 比例为1：10放置在四度冰箱或冰上过夜酶切。 2. 在使用TEV酶切蛋白时，需要蛋白buffer中存在DTT，因此最好不要一边透析一边酶切，酶切和透析分 开来做，这样有助于实现良好的酶切效果。 3. TEV加入量计算公式： TEV(ml)= OD280：目的蛋白的OD280 ε：目的蛋白的消光系数 M：目的蛋白的分子量（kDa） V：目的蛋白体积