昆虫表达系统是一类应用广泛的真核蛋白表达系统，它具有同大多数高等真核生物相似的翻译后修饰加工以及转移外源蛋白的能力。昆虫杆状病毒表达系统是自前国内外十分推票的真核表达系统。利用杆状病毒结构基因中多角体蛋白的强启动子构建的表达载体，可使很多真核目的基因得到有效甚至高水平的表达。它具有真核表达系统的翻译后加工功能，如二硫键的形成、糖基化及磷酸化等，使重组蛋白在结构和功能上更接近天然蛋白：其最高表达量可达昆虫细胞蛋白总量的50%：可表达非常大的外源性基因（200kDa）；具有在同一个感染昆虫细胞内同时表达多个外源基因的能力。SF9细胞用于转染、纯化和增殖重组病毒。SF9细胞大小一致，易于操作，能形成良好的单层细胞用于空斑实验。SF9细胞能用于重组蛋白的表达，但是Hi5细胞系的生产量更高。推荐用Hi5细胞系来表达分泌型重组蛋白，其能在无血清培养基中培养，适应悬浮培养以及能生产大量的重组蛋白。材料（MATERIALS）口试剂（REAGENTS）昆虫培养基、LB、卡那霉素、庆大霉素、四环素SIMSF培养基（实验室现用）：无血清即用型培养基，无需任何添加成分或加血清。然而加2%血清会减少感染过程中蛋白水解量。其优点：1）降低昂贵的血清成本；2）简化分泌重组蛋白纯化过程；3）消除血清组织敏感性。口实验前准备（SETUP）配置液体LB、配置固体LB平板、配制昆虫培养基口器械（EQUIPMENT）Thermo离心机、摇床、培养箱、培养皿、培养瓶、冻存管、移液管实验步骤（PROCEDURE）制备感受态（DH10Bac）1：将DH10Bac加入20mLLB培养基中（含有50μg/mL卡那霉素和10μg/mL四环素）培养过夜，再将培养物接种到500mLLB培养基（含有卡那霉素和四环素）震荡使OD值达到0.6~0.8。2.3000rpm，4C离心15min，用100mL50mMCaCl2重悬，混合均匀后3000rpm，4离心15min。3.重复用100mL50mMCaCl2重悬，冰上静置30min后3000rpm，4C离心15min。4.最后使用20mLCaCl2+15%glycerol重悬，分装至无菌的1.5mLEP管中-80C保存。质粒转化1.从冰箱中拿出一管100μL的DH10Bac感受态细胞（DH10Bac感受态细胞本身含有卡那霉素和四环素抗性，而供体质粒pFastbac含有庆大霉素的抗性，所以在制备DH10Bac感受态细胞时需要在培养时添加卡那霉素和四环素，而在制备杆粒时需要使用卡那霉素，四环素，庆大霉素的三抗平板。）加入1~2μg的质粒混匀，放在冰上静置30min。2.拿入42C热激45~90s，立即放于冰上冷却2min，加入500μL无抗性的LB，置于37C摇床中225rpm震荡2~4h。3.涂板（三抗的板子，50μg/mL卡那霉素，7μg/mL庆大霉素，10μg/mL四环霉素，100μg/mLX-gal，40μg/mLIPTG），闭光正置于37C培养箱中培养至少48h4.挑选白色的菌落，如果有需要将白色的菌落重新挑到三抗的板子划线，培养至少48h。5.接着挑取白色单克隆至含有5~10mL的LB（含有7μg/mL庆大霉素）管中，过夜摇菌后保种放于-80°C，剩余菌液可以提取Bacmid。、Bacmid的提取因为Bacmid大于130kb，质粒抽提不能使用如上述的膜吸附抽提，而要采用传统的乙醇沉淀法。1.准备试剂Bufferl:25mMTris-HCIpH8.0，50mM葡萄糖，10mMEDTA;Bufferll:0.2MNaOH,1%SDS（w/v);BufferIll:3MKAc,2MHAc。2.将震荡培养的菌液5mL离心，弃上清，留下大肠杆菌菌体。3.加入250μL提前加入RNaseA的BufferI，重悬细菌。4.加入250μLBufferIl，温和充分颠倒4~6次至形成透亮的溶液。5.加入350μLBufferl，温和颠倒6~8次，13400rpm离心5~8min。6.将上清转移到洁净灭菌的1.5mLEP管中，13400rpm离心5~8min。7.转移上清到洁净灭菌的1.5mLEP管中，加入等倍体积的异丙醇，冰上放置20min
昆虫表达系统是一类应用广泛的真核蛋白表达系统，它具有同大多数高等真核生物相似的翻译后修饰 加工以及转移外源蛋白的能力。昆虫杆状病毒表达系统是目前国内外十分推崇的真核表达系统。利用杆状 病毒结构基因中多角体蛋白的强启动子构建的表达载体，可使很多真核目的基因得到有效甚至高水平的表 达。它具有真核表达系统的翻译后加工功能，如二硫键的形成、糖基化及磷酸化等，使重组蛋白在结构和 功能上更接近天然蛋白；其最高表达量可达昆虫细胞蛋白总量的50%；可表达非常大的外源性基因（200 kDa）；具有在同一个感染昆虫细胞内同时表达多个外源基因的能力。 SF9细胞用于转染、纯化和增殖重组病毒。SF9细胞大小一致，易于操作，能形成良好的单层细胞用 于空斑实验。SF9细胞能用于重组蛋白的表达，但是Hi5细胞系的生产量更高。推荐用Hi5细胞系来表达分 泌型重组蛋白，其能在无血清培养基中培养，适应悬浮培养以及能生产大量的重组蛋白。 材料（MATERIALS） r 试剂（REAGENTS） 昆虫培养基、LB、卡那霉素、庆大霉素、四环素 SIM SF培养基（实验室现用）：无血清即用型培养基，无需任何添加成分或加血清。然而加2%血清会减 少感染过程中蛋白水解量。其优点：1）降低昂贵的血清成本；2）简化分泌重组蛋白纯化过程；3）消除 血清组织敏感性。 r 实验前准备（SETUP） 配置液体LB、配置固体LB平板、配制昆虫培养基 r 器械（EQUIPMENT） Thermo离心机、摇床、培养箱、培养皿、培养瓶、冻存管、移液管 实验步骤（PROCEDURE） ► 制备感受态（DH10Bac） 1. 将DH10Bac加入20 mL LB培养基中（含有50 µg/mL卡那霉素和10 µg/mL四环素）培养过夜，再将培 养物接种到500 mL LB培养基（含有卡那霉素和四环素）震荡使OD值达到0.6~0.8。 2. 3000 rpm，4 °C离心15 min，用100 mL 50 mM CaCl2重悬，混合均匀后3000 rpm，4 °C离心15 min。 3. 重复用100 mL 50 mM CaCl2重悬，冰上静置30 min后3000 rpm，4 °C离心15 min。 4. 最后使用20 mL CaCl2 +15% glycerol重悬，分装至无菌的1.5 mL EP管中-80 °C保存。 ► 质粒转化 1. 从冰箱中拿出一管100 μL的DH10Bac感受态细胞（DH10Bac感受态细胞本身含有卡那霉素和四环素抗 性，而供体质粒pFastbac含有庆大霉素的抗性，所以在制备DH10Bac感受态细胞时需要在培养时添加卡 那霉素和四环素，而在制备杆粒时需要使用卡那霉素，四环素，庆大霉素的三抗平板。）加入1~2 µg的质 粒混匀，放在冰上静置30 min。 2. 拿入42 °C热激45~90 s，立即放于冰上冷却2 min，加入500 μL无抗性的LB，置于37 °C摇床中225 rpm震荡2~4 h。 3. 涂板（三抗的板子，50 µg/mL卡那霉素，7 µg/mL庆大霉素，10 µg/mL四环霉素，100 µg/mL X-gal， 40 µg/mL IPTG），闭光正置于37 °C培养箱中培养至少48 h。 4. 挑选白色的菌落，如果有需要将白色的菌落重新挑到三抗的板子划线，培养至少48 h。 5. 接着挑取白色单克隆至含有5~10 mL的LB（含有7 µg/mL庆大霉素）管中，过夜摇菌后保种放于-80 °C，剩余菌液可以提取Bacmid。 ► Bacmid的提取 因为Bacmid大于130 kb，质粒抽提不能使用如上述的膜吸附抽提，而要采用传统的乙醇沉淀法。 1. 准备试剂 Buffer I：25 mM Tris-HCl pH 8.0，50 mM葡萄糖，10 mM EDTA； Buffer II：0.2 M NaOH，1% SDS（w/v）； Buffer III：3 M KAc，2 M HAc。 2. 将震荡培养的菌液 5 mL离心，弃上清，留下大肠杆菌菌体。 3. 加入250 μL提前加入RNase A 的Buffer I，重悬细菌。 4. 加入250 μL Buffer II，温和充分颠倒4~6次至形成透亮的溶液。 5. 加入350 μL Buffer III，温和颠倒6~8次，13400 rpm离心5~8 min。 6. 将上清转移到洁净灭菌的1.5 mL EP管中，13400 rpm离心5~8 min。 7. 转移上清到洁净灭菌的1.5 mL EP管中，加入等倍体积的异丙醇，冰上放置20 min
8.13400rpm，于4离心10min，小心移除上清，注意不要吸走白色沉淀或者油状物。9.加入1mL-40C预冷的70%乙醇，颠倒混匀后13400rpm4C离心1~10min，弃除乙醇，留下白色沉淀，此步骤可重复一次进一步减少杂质。10.开盖在干净通风处放置5~20min至乙醇完成挥发。11.加入30μL预热的ddH2O，充分溶解质粒，测浓度，用于后续实验。Bacmid转染（获得P1代病毒）1.将准备好的SF9细胞分到一个6孔培养板中，体积为2mL，密度为1×106，静置15min让细胞贴壁，轻轻摇动培养板观察到大部分细胞不晃动即可。2.取两个1.5mLEP管分别命名为转染试剂和Bacmid，每管加入100μL培养基，抽到的Bacmid取4ug加入到Bacmid管，转染试剂管中加入相应量的转染试剂，静置30min，再将两管混合孵育30min。3.将混合物滴入到SF9细胞中。4.培养皿放于27C静置培养5~7h后更换新鲜培养基继续在27°C培养66~72h。5.当大多数细胞变圆变肿后收集用1500rpm，4C避光离心10min收集上清病毒，可用0.22μm的滤膜过滤，即获得P1代病毒。病毒感染1.同上步，将准备好的SF9细胞分到一个6孔培养板中，体积为2mL，密度为1×106，但不需要静置使其贴壁。2.将P1代病毒以病毒：细胞1：100的比例加入6孔板中，避光在27℃摇床中培养3~7天。3.800rpm离心5min取上清，可用0.22μm的滤膜过滤，即获得P2代病毒。4.重复上述步骤扩增病毒即可获得P3、P4代病毒，在扩增获得P4代病毒时，可以扩大细胞体积，采用50mL细胞，细胞密度不变（若P4代病毒感染细胞表达蛋白水平不理想，可继续扩增）。5.获得P1代病毒后，需要对病毒感染细胞表达蛋白的能力进行检测。6.将准备好的Hi5细胞分到一个6孔培养板中，体积为2mL，密度为1×106。7.将P1代病毒以病毒：细胞1：100的比例加入6孔板中，避光在27C摇床中培养72h，检测蛋白表达情况；8.获得P4代病毒后，可对病毒：细胞比例设计梯度（例如1：10~1：100000）进行蛋白表达量检测，步骤同4，寻找合适比例用于后续大规模蛋白表达。9.寻找合适比例后，可进行大规模蛋白表达，Hi5细胞体积可改为50mL、500mL、1L逐步增多，密度同为1×106，按比例加入P4代病毒后，在27C摇床中培养3天，即可进行蛋白纯化。分泌蛋白沉淀法1.将1L细胞常温2000rpm离心15min，收集1L的上清，加入沉淀剂，1mL1MNiCl2（终浓度1mMNiCl2），1mL5MCaCl2（终浓度5mMCaCl2），50mL1MTrispH8.0（终浓度50mMTrispH8.0)。2．加入转子搅拌，会有大量白色沉淀出现。3．将这1L溶液常温6000rpm离心15min。4.收集上清，0.2μm滤膜抽滤。5.将0.2μm滤膜抽滤后的上清加入2mLNickelbeads，室温搅拌3小时以上。6.收集Nickelbeads，用咪唑洗脱蛋白。SF9细胞的冻存1.在150×25mm的培养血中，25mL培养基中生长细胞，当细胞密度大于90%时培养基使用1000rpm离心10min，然后用6mL冻存剂重悬（10%DMSO，90%FBS），吸取1mL放于冻存管中。2.将冻存管放于冻存盒，冻存盒依次放于-20℃冰箱6h，-80C冰箱24h，液氮罐。SF9细胞的复苏1.准备SF9培养基：在27~30°C预热。2.从液氮中拿出需要复苏的细胞，迅速放到27C水浴中快速摇解冻，转移至15mL离心管中，加入10mL培养基，1000rpm离心5分钟，移除上清，加入3mL培养基，使用移液枪慢慢吹吸三次后转移到60x15mm培养皿中（依据细胞的量选择培养皿）。3.显微镜下检查细胞状态，当大多数细胞贴壁后更换新鲜培养基，将培养皿放到27C培养箱中培养至少24 h。4.24h后细胞密度大于80%可以分血培养，少于80%需要继续更换新鲜培养基培养
8. 13400 rpm，于4 °C离心10 min，小心移除上清，注意不要吸走白色沉淀或者油状物。 9. 加入1 mL -40 °C预冷的70%乙醇，颠倒混匀后13400 rpm 4 °C离心1~10 min，弃除乙醇，留下白色沉 淀，此步骤可重复一次进一步减少杂质。 10. 开盖在干净通风处放置5~20 min至乙醇完成挥发。 11. 加入30 μL预热的ddH2O，充分溶解质粒，测浓度，用于后续实验。 ► Bacmid转染（获得P1代病毒） 1. 将准备好的SF9细胞分到一个6孔培养板中，体积为2 mL，密度为1×106，静置15 min让细胞贴壁，轻 轻摇动培养板观察到大部分细胞不晃动即可。 2. 取两个1.5 mL EP管分别命名为转染试剂和Bacmid，每管加入100 μL培养基，抽到的Bacmid取4 µg加 入到Bacmid管，转染试剂管中加入相应量的转染试剂，静置30 min，再将两管混合孵育30 min。 3. 将混合物滴入到SF9细胞中。 4. 培养皿放于27 °C静置培养5~7 h后更换新鲜培养基继续在27 °C培养66~72 h。 5. 当大多数细胞变圆变肿后收集用1500 rpm, 4 °C避光离心10 min收集上清病毒，可用0.22 µm的滤膜过 滤，即获得P1代病毒。 ► 病毒感染 1. 同上步，将准备好的SF9细胞分到一个6孔培养板中，体积为2 mL，密度为1×106，但不需要静置使其 贴壁。 2. 将P1代病毒以病毒：细胞1：100的比例加入6孔板中，避光在27 °C摇床中培养3~7天。 3. 800 rpm离心5 min取上清，可用0.22 µm的滤膜过滤，即获得P2代病毒。 4. 重复上述步骤扩增病毒即可获得P3、P4代病毒，在扩增获得P4代病毒时，可以扩大细胞体积，采用 50 mL细胞，细胞密度不变（若P4代病毒感染细胞表达蛋白水平不理想，可继续扩增）。 5. 获得P1代病毒后，需要对病毒感染细胞表达蛋白的能力进行检测。 6. 将准备好的Hi5细胞分到一个6孔培养板中，体积为2 mL，密度为1×106。 7. 将P1代病毒以病毒：细胞1：100的比例加入6孔板中，避光在27 °C摇床中培养72 h，检测蛋白表达情 况； 8. 获得P4代病毒后，可对病毒：细胞比例设计梯度（例如1：10~1：100000）进行蛋白表达量检测，步 骤同4，寻找合适比例用于后续大规模蛋白表达。 9. 寻找合适比例后，可进行大规模蛋白表达，Hi5细胞体积可改为50 mL、500 mL、1 L逐步增多，密度 同为1×106，按比例加入P4代病毒后，在27 °C摇床中培养3天，即可进行蛋白纯化。 ► 分泌蛋白沉淀法 1. 将1 L细胞常温2000 rpm离心15 min，收集1 L的上清，加入沉淀剂，1 mL 1 M NiCl2（终浓度1 mM NiCl2），1 mL 5 M CaCl2（终浓度5 mM CaCl2），50 mL 1 M Tris pH 8.0 （终浓度50 mM Tris pH 8.0）。 2. 加入转子搅拌，会有大量白色沉淀出现。 3. 将这1 L溶液常温6000 rpm离心15 min。 4. 收集上清，0.2 μm滤膜抽滤。 5. 将0.2 μm滤膜抽滤后的上清加入2 mL Nickel beads，室温搅拌3小时以上。 6. 收集Nickel beads，用咪唑洗脱蛋白。 ► SF9细胞的冻存 1. 在150×25 mm的培养皿中，25 mL培养基中生长细胞，当细胞密度大于90%时培养基使用1000 rpm离 心10 min，然后用6 mL冻存剂重悬（10% DMSO，90% FBS），吸取1 mL放于冻存管中。 2. 将冻存管放于冻存盒，冻存盒依次放于-20 °C冰箱6 h，-80 °C冰箱24 h，液氮罐。 ► SF9细胞的复苏 1. 准备SF9培养基：在27~30 °C预热。 2. 从液氮中拿出需要复苏的细胞，迅速放到27 °C水浴中快速摇晃解冻，转移至15 mL离心管中，加入10 mL培养基，1000 rpm离心5分钟，移除上清，加入3 mL培养基，使用移液枪慢慢吹吸三次后转移到 60×15 mm培养皿中（依据细胞的量选择培养皿）。 3. 显微镜下检查细胞状态，当大多数细胞贴壁后更换新鲜培养基，将培养皿放到27 °C培养箱中培养至少 24 h。 4. 24 h后细胞密度大于80%可以分皿培养，少于80%需要继续更换新鲜培养基培养
SF9细胞的传代培养1：SF9细胞培养在10~15mL培养基中每代培养2~3天，当密度达到2×106即可传代，避免超过5×106影响细胞状态。2.预热培养基，室温放置1小时。3.准备已培养2~3天的SF9细胞和一个新的锥形瓶，对SF9细胞进行计数，计算其密度。4.根据密度吸取一定量的新鲜培养基与SF9细胞至新锥形瓶中，总体积10mL或可根据需要增大体积，终密度为0.5×106Hi5细胞的传代培养操作同SF9，不同的是Hi5生长速度较快，每代培养1~2天即可传代。针对性建议（TROUBLESHOOTING）1.冻存（昆虫细胞冻手液氮中，确保细胞处于对数期）。2.Hi5细胞的冻存与复苏和SF9细胞一样，但50mL的Hi5细胞可以冻存10~20管。3.Hi5培养条件是250mL培养瓶，30~40mL培养基，在27C条件下100rpm振荡培养，每两天传一次代。4.在扩增病毒时，可在SIMSF培养基中加入10%血清。3.1.4硒代蛋白表达简介INTRODUCTION）如果某个蛋白没有同源结构，为了确定其相位，需要有重原子衍生物的蛋白晶体。目前最常用的手段就是引入硒代甲硫氨酸（SeMet）的方法。在蛋白表达过程中在培养基中加入硒代甲硫氨酸来替代通常的甲硫氨酸，因此表达出来的蛋白的甲硫氨酸全部取代为硒代甲硫氨酸。我们利用甲硫氨酸缺陷型菌株B834在无机的硒代培养基中表达目的蛋白。B834是一种改造过的表达菌株，缺失甲硫氨酸合成酶，因而不能自身合成甲硫氨酸，但是可以通过氨酰tRNA合成酶将外源的甲硫氨酸或者硒代甲硫氨酸加入到蛋白质的肽链中。材料（MATERIALS）口试剂（REAGENTS）B834、LB培养基、M9培养基、MediumA培养基、抗生素、硒代甲硫氨酸、IPTG口实验前准备（SETUP）收菌瓶要提前高压灭菌，烘干，预冷。1xM9Medium17.1 gNa2HPO4.12H203gKH2PO40.5gNaCI1.0 gNH4CIadd ddH20 to 1 L1xM9Medium，Glucose，MgSO4，CaCI2需要高压灭菌；Biotin，Thiamin，antibiotics需用0.22μm滤膜抽滤。MediumA:1000mL1xM9medium8 mL50% (w/v)glucose1 mL1 MMgS040.3 mL1 M CaCl21 mL1mg/mLBiotin1 mL1mg/mLThiaminX mLantibiotics实验步骤（PROCEDURE）1.将重组质粒转化表达菌株B834（DE3）感受态细胞，涂板，37C过夜培养
► SF9细胞的传代培养 1. SF9细胞培养在10~15 mL培养基中每代培养2~3天，当密度达到2×106 即可传代，避免超过5×106， 影响细胞状态。 2. 预热培养基，室温放置1小时。 3. 准备已培养2~3天的SF9细胞和一个新的锥形瓶，对SF9细胞进行计数，计算其密度。 4. 根据密度吸取一定量的新鲜培养基与SF9细胞至新锥形瓶中，总体积10 mL或可根据需要增大体积，终 密度为0.5×106。 ► Hi5细胞的传代培养 操作同SF9，不同的是Hi5生长速度较快，每代培养1~2天即可传代。 针对性建议（TROUBLESHOOTING） 1. 冻存（昆虫细胞冻于液氮中，确保细胞处于对数期）。 2. Hi5细胞的冻存与复苏和SF9细胞一样，但50 mL的Hi5细胞可以冻存10~20管。 3. Hi5培养条件是250 mL培养瓶，30~40 mL培养基，在27 °C条件下100 rpm振荡培养，每两天传一次 代。 4. 在扩增病毒时，可在SIM SF培养基中加入10%血清。 3.1.4 硒代蛋白表达 简介（INTRODUCTION） 如果某个蛋白没有同源结构，为了确定其相位，需要有重原子衍生物的蛋白晶体。目前最常用的手段 就是引入硒代甲硫氨酸（SeMet）的方法。在蛋白表达过程中在培养基中加入硒代甲硫氨酸来替代通常的 甲硫氨酸，因此表达出来的蛋白的甲硫氨酸全部取代为硒代甲硫氨酸。我们利用甲硫氨酸缺陷型菌株B834 在无机的硒代培养基中表达目的蛋白。B834是一种改造过的表达菌株，缺失甲硫氨酸合成酶，因而不能自 身合成甲硫氨酸，但是可以通过氨酰tRNA合成酶将外源的甲硫氨酸或者硒代甲硫氨酸加入到蛋白质的肽 链中。 材料（MATERIALS） r 试剂（REAGENTS） B834、LB培养基、M9培养基、MediumA培养基、抗生素、硒代甲硫氨酸、IPTG r 实验前准备（SETUP） 收菌瓶要提前高压灭菌，烘干，预冷。 1× M9 Medium 17.1 g Na2HPO4.12H2O 3 g KH2PO4 0.5 g NaCl 1.0 g NH4Cl add ddH2O to 1 L 1× M9 Medium，Glucose，MgSO4，CaCl2 需要高压灭菌；Biotin，Thiamin，antibiotics需用0.22 μm滤 膜抽滤。 Medium A: 1000 mL 1× M9 medium 8 mL 50% (w/v) glucose 1 mL 1 M MgSO4 0.3 mL 1 M CaCl2 1 mL 1 mg/mL Biotin 1 mL 1 mg/mL Thiamin x mL antibiotics 实验步骤（PROCEDURE） 1. 将重组质粒转化表达菌株B834（DE3）感受态细胞，涂板，37 °C过夜培养
2.第二天，挑单克隆到5mLLB中，37C摇过夜。3.第三天，将过夜菌全部加到1LLB中，在37C摇床中摇到OD600达到1.0~1.5。4.将菌液3700g，4℃离心10min，弃上清，收菌瓶要提前灭菌，并放烘箱烘干，再放4℃预冷。5.加入20mLMediumA培养基温和重悬菌液，此操作是为了洗去菌液表面残留的LB培养基，使细菌更快适应新的培养基，也避免丰富培养基中甲硫氨酸影响硒代效果。将菌液加入现配的等体积硒代培养基MediumA中（不含任何甲硫氨酸）；在37C摇床中摇4~8h至OD600=1.5。6.加1mL50mg/mL硒代甲硫氨酸，37C生长30min。7.向菌液中加入IPTG诱导，IPTG终浓度为0.25mM，4h×37Cor20h×16C。8.4000rpm，4℃，15min收菌，弃上清。将菌体用样品匙取出，加少量裂解液润洗离心瓶后冻-80℃冰箱。针对性建议（TROUBLESHOOTING）硒代甲硫氨酸价格很贵，因此第一次做，先用甲硫氨酸结合M9培养基试一遍，纯化重组蛋白，计算得率和纯度，摸索所有步骤。然后再用硒代摇2~3L菌。硒代甲硫氨酸属于有毒物质，请带手套和口罩。3.2蛋白纯化技术3.2.1AKTA使用规则及使用实例简介（INTRODUCTION）FPLC全称为快速蛋白液相色谱（Fastproteinliquidchromatography），其原理与高效液相色谱理论类似，是由经典的液体柱层析引入气相色谱理论，并且对相体进行了改革，配用高压输液泵，采用高灵敏检测器、梯度洗脱装置、自动收集装置和微机等发展起来的现代液相色谱。实验室有4套纯化仪，AKTAprimeplus，AKTAPure，AKTAEXPLORER，AKTAFPLC组装机。AKTA介绍菜单农生台2#换位1上样安全（Safety）、组件（Components）、方法编程（Methodprogramming）、使用方法（Usage）、维护注意事项（Maintenance）、针对性意见（Troubleshooting）、使用规则(Rules)AKTAPrimePlus纯化系统-安全(Safety）警告！系统必须与接地电源插座连接。警告！用户不能打开系统，因为系统含高压电路，会造成致命的电击。警告！必须用上样环或者接线，将上样阀的接口2和6连接。防止转换此阀时，液体从接口喷出，尤其是使用危险化学品时特别危险。警告！如果有大量溢出的液体渗入系统外壳并与带电零件接触的危险，应立即关闭系统并同指定的技术服务人员联系。警告！NaOH有害健康，应避免泄漏
2. 第二天，挑单克隆到5 mL LB中，37 °C摇过夜。 3. 第三天，将过夜菌全部加到1 L LB中，在37 °C摇床中摇到OD600达到1.0~1.5。 4. 将菌液3700 g，4 °C离心10 min，弃上清，收菌瓶要提前灭菌，并放烘箱烘干，再放4 °C预冷。 5. 加入20 mL Medium A培养基温和重悬菌液，此操作是为了洗去菌液表面残留的LB培养基，使细菌更 快适应新的培养基，也避免丰富培养基中甲硫氨酸影响硒代效果。将菌液加入现配的等体积硒代培养基 Medium A中（不含任何甲硫氨酸）；在37 °C摇床中摇 4~8 h至 OD600=1.5。 6. 加1 mL 50 mg/mL硒代甲硫氨酸，37 °C 生长30 min。 7. 向菌液中加入IPTG诱导, IPTG终浓度为0.25 mM，4 h×37 °C or 20 h×16 °C。 8. 4000 rpm，4 °C，15 min收菌，弃上清。将菌体用样品匙取出，加少量裂解液润洗离心瓶后冻-80 °C 冰箱。 针对性建议（TROUBLESHOOTING） 硒代甲硫氨酸价格很贵，因此第一次做，先用甲硫氨酸结合M9培养基试一遍，纯化重组蛋白，计算得 率和纯度，摸索所有步骤。然后再用硒代摇2~3 L菌。硒代甲硫氨酸属于有毒物质，请带手套和口罩。 3.2 蛋白纯化技术 3.2.1 AKTA使用规则及使用实例 简介（INTRODUCTION） FPLC全称为快速蛋白液相色谱（Fast protein liquid chromatography），其原理与高效液相色谱理论类 似，是由经典的液体柱层析引入气相色谱理论，并且对相体进行了改革，配用高压输液泵，采用高灵敏检 测器、梯度洗脱装置、自动收集装置和微机等发展起来的现代液相色谱。实验室有4套纯化仪，AKTA prime plus，AKTA Pure，AKTA EXPLORER，AKTA FPLC组装机。 AKTA介绍菜单 安全（Safety）、组件（Components）、方法编程（Method programming）、使用方法 （Usage）、维护注意事项（Maintenance）、针对性意见（Trouble shooting）、使用规则 （Rules） AKTA Prime Plus纯化系统 ► 安全(Safety) 警告！系统必须与接地电源插座连接。 警告！用户不能打开系统，因为系统含高压电路，会造成致命的电击。 警告！必须用上样环或者接线，将上样阀的接口2和6连接。防止转换此阀时，液体从接口喷出，尤其 是使用危险化学品时特别危险。 警告！如果有大量溢出的液体渗入系统外壳并与带电零件接触的危险，应立即关闭系统并同指定的技 术服务人员联系。 警告！NaOH有害健康，应避免泄漏。 ►
组件（Components）AKTAprimeplus蛋白质纯化系统包括下列部件：·缓冲液阀和梯度转换阀（Buffervalveandgradientswitchvalve）：缓冲液阀用于选择使用缓冲溶液，用于系统泵施加大的样品体积。梯度转换阀用于建立梯度。·系统泵（Systempump）：系统泵用于经系统运送液体，如样品或缓冲溶液。将液体经缓冲液阀、梯度转换阀或经上样阀进入流动通道。·压力传感器（Pressuresensor）：压力传感器可以测量在位液体压力。还可用作压力保护装置。·混合器（Mixer）：混合器用于混合两元梯度。以两步将溶液混合以得到最适宜的结果。混合器的体积可以选择。·上样阀（Injectionvalve）：上样阀用于装加样环和用于将样品注射到柱上。检测器（Monitor）：检测器的目的是测量流出柱后液体的UV吸收、电导率和pH（任选）。用于这些测量的流动池安装在系统的右侧。具有分流阀的分部收集器（Fractioncollectorwithflowdiversionvalve）：分部收集器用于将样品组分收集在管中供进一步分析。分流阀在废液和收集管之间转换流向。方法编程（Methodprogramming）该菜单出现在自检后启动时，用于运行予制的应用模主菜单Template板和法模板RunstoredMethod用于运行用户编辑的运行方法用于不使用方法，手工运行系统Manual Run用于编辑用户专用方法Program Method用于对检测紫外（UV）、电导、pH、温度、运转泵及混SetParameters合器设置参数用于检测系统内部参数，例如序列号、泵运行时间、和灯Check亮度。使用方法（Usage）利用AKTAPrimePlus洗脱镍柱中的蛋白（以5mL镍柱为例）1.打开AKTA（机器背部左下角），将A泵和B泵用蒸馏水冲洗干净分别插入到Ni-Bindingbuffer和Elutionbuffer中，并在Template中选择systemwash，洗泵（大概五分钟）。2.systemwash完毕后，先选择manualrun，%B=0，pressurelimitation=0.4MPa，流速=1mL/min。先将Ni柱底部接到探测器上，再将1号接线口接到镍柱上端（这样可以防止绿色线管扭曲），观察电脑屏幕待UV线、电导线平齐时Endprogram。3.设定程序：流速3mL/min，limitpressure为0.4MPa设定breakpoint：0mL:%B=4，setfractionsize=020mL：开始拉梯度，%B=4；开始收集样品，setfractionsize3mL/tube80mL：%B=60；同时也一直在收集样品，setfractionsize3mL/tube100mL:%B=60，setfractionsize3mL/tubeEnd（意思是：0mL时所有的系统全部要求置零，0~20mL区间跑4%Elutionbuffer把杂蛋白洗下来。20~80mL区间设定Elutionbuffer的浓度从4%慢慢升到60%同时收集样品，80~100mL区间用60%把剩余蛋白全部洗脱下来并收集样品，到达100mL时停止。）4.蛋白纯化结束后，要清洗AKTA泵内部溶液，方便下一位使用者，将A泵和B泵泵头用蒸馏水冲洗干净后放入蒸馏水中，并在Template中选择systemwash，洗A、B泵。用蒸馏水清洗完毕后如果长期不用机
主菜单Template 该菜单出现在自检后启动时，用于运行予制的应用模 板和法模板 Run stored Method 用于运行用户编辑的运行方法 Manual Run 用于不使用方法，手工运行系统 Program Method 用于编辑用户专用方法 Set Parameters 用于对检测紫外（UV）、电导、pH、温度、运转泵及混 合器设置参数 Check 用于检测系统内部参数，例如序列号、泵运行时间、和灯 亮度。 组件（Components） AKTA prime plus蛋白质纯化系统包括下列部件： 缓冲液阀和梯度转换阀（Buffer valve and gradient switch valve）：缓冲液阀用于选择使用缓冲溶 液，用于系统泵施加大的样品体积。梯度转换阀用于建立梯度。 系统泵（System pump）：系统泵用于经系统运送液体，如样品或缓冲溶液。将液体经缓冲液阀、 梯度转换阀或经上样阀进入流动通道。 压力传感器（Pressure sensor）：压力传感器可以测量在位液体压力。还可用作压力保护装置。 混合器（Mixer）：混合器用于混合两元梯度。以两步将溶液混合以得到最适宜的结果。混合器的 体积可以选择。 上样阀（Injection valve）：上样阀用于装加样环和用于将样品注射到柱上。 检测器（Monitor）：检测器的目的是测量流出柱后液体的UV吸收、电导率和pH（任选）。用于这 些测量的流动池安装在系统的右侧。 具有分流阀的分部收集器（Fraction collector with flow diversion valve）：分部收集器用于将样品 组分收集在管中供进一步分析。分流阀在废液和收集管之间转换流向。 ► 方法编程（Method programming） ► 使用方法（Usage） 利用AKTA Prime Plus 洗脱镍柱中的蛋白（以5 mL镍柱为例） 1. 打开AKTA （机器背部左下角），将A泵和B泵用蒸馏水冲洗干净分别插入到Ni-Binding buffer和Elution buffer中，并在Template中选择system wash，洗泵（大概五分钟）。 2. system wash完毕后，先选择manual run，%B=0，pressure limitation=0.4 MPa，流速=1 mL/min。先 将Ni柱底部接到探测器上，再将1号接线口接到镍柱上端（这样可以防止绿色线管扭曲），观察电脑屏幕 待UV线、电导线平齐时End program。 3. 设定程序：流速3 mL/min，limit pressure为0.4 MPa 设定breakpoint： 0 mL：%B=4，set fraction size=0 20 mL：开始拉梯度，%B=4；开始收集样品，set fraction size 3 mL/tube 80 mL：%B=60；同时也一直在收集样品，set fraction size 3 mL/tube 100 mL：%B=60，set fraction size3 mL/tube End （意思是：0 mL时所有的系统全部要求置零，0~20 mL区间跑4% Elution buffer把杂蛋白洗下来。 20~80 mL区间设定Elution buffer的浓度从4%慢慢升到60%同时收集样品，80~100 mL区间用60%把剩 余蛋白全部洗脱下来并收集样品，到达100 mL时停止。） 4. 蛋白纯化结束后，要清洗AKTA泵内部溶液，方便下一位使用者，将A泵和B泵泵头用蒸馏水冲洗干净 后放入蒸馏水中，并在Template中选择system wash，洗A、B泵。用蒸馏水清洗完毕后如果长期不用机