(1)感受态细菌的制备 接种一环DH5a于2mlLB中37℃,振荡过夜 以约1%的接种量接入20mLB中 振荡培养约90至OD600.2离心(K,5) 收集菌体—一加入预冷CaC12(10ml100mM) 冰浴20 离心收集菌体 加入 100u00mM预冷CaCl2混匀
（1）感受态细菌的制备 接种一环DH5于2ml LB中 37℃，振荡过夜 以约1%的接种量接入20ml LB中 振荡培养约90’至OD600≈0.2 离心（5K，5’） 收集菌体 加入预冷CaCl2（10 ml 100mM） 冰浴20’ 离心 收集菌体 加入 100ul100mM预冷CaCl2混匀
(2)转化:0℃,在1.5m1离心管中按下表加入 CaC2、受体菌及DNA进行转化实验 转化项目 CaCl2受体菌 DNA 液体LB 皿 a阳性对照 10ul PBR322DNAlng 100ul b阴性对照① 2ul连接液 100ul c阴性对照② 1 Oul 100ul d连接液转化组 60ul 6ul连接液 600ul 冰浴303—42℃2(热休克)一冰浴,2 加37℃预热LB培养45表中a、b、c各取100ul/皿 涂布(连接液转化组d梯度涂布Ⅰ50ul×2皿 Ⅱ500u浓缩后×2皿) 37℃倒置培养过夜 检查细菌生长情况
转化项目 CaCl2 受体菌 DNA 液体LB 皿 a阳性对照 —— 10ul PBR322DNAlng 100ul b阴性对照① 10ul —— 2ul连接液 100ul c阴性对照② —— 10ul —— 100ul d连接液转化组 —— 60ul 6ul连接液 600ul （2）转化： 0℃，在1.5ml离心管中按下表加入 CaCl2、受体菌及DNA进行转化实验 冰浴30’ 42℃ 2’（热休克） 冰浴，2’ 加37℃预热LB培养45’ 表中a、b、c各取100ul/皿 涂布（连接液转化组d梯度涂布 I 50ul2皿； II.500ul浓缩后2皿） 37℃倒置培养过夜 检查细菌生长情况
(电穿孔法 原理:利用高压脉冲电场,在宿主细胞表面 形成暂时性的微孔,质粒DNA可乘隙而入 在脉冲过后,微孔复原。 它比CaCl法操作更简单,转化效率高 (一般可达109~1010个转化子/g DNA),不仅无需制备感受态细胞,而且 适用于任何菌株
㈢电穿孔法 原理：利用高压脉冲电场, 在宿主细胞表面 形成暂时性的微孔, 质粒DNA可乘隙而入, 在脉冲过后, 微孔复原 。 它比CaCl2法操作更简单，转化效率高 （一般可达109～1010个转化子／μg DNA）, 不仅无需制备感受态细胞, 而且 适用于任何菌株
通过接合作用传递质粒DNA F质粒(F因子)又称性质粒,除了含有自我复 制基因外,还带有一套接合转移的基因,凡携有F质 粒的细菌称F菌株。不带有F质粒的细菌称F菌株。 F菌株(供体菌)一旦与Fˉ菌株(受体菌)发生接 触,F菌株可通过性菌毛将F质粒转给Fˉ菌株,使F 菌株转变成F菌株。质粒由F向Fˉ菌的转移过程 叫接合作用传递质粒,又称质粒的接合传递。凡带有 在染色体上整合F质粒的细菌又称高频重组株系 (H株系)。H株系不稳定,F质粒可发生接合传 递质粒DNA,F菌株可失去F质粒,F菌也可获得F质 粒,其转移难以人为控制,又不稳定,通常不用作克 隆载体
二、通过接合作用传递质粒DNA F质粒（F因子）又称性质粒, 除了含有自我复 制基因外, 还带有一套接合转移的基因, 凡携有F质 粒的细菌称F +菌株。不带有F质粒的细菌称F－菌株。 F +菌株（供体菌）一旦与F－菌株（受体菌）发生接 触，F +菌株可通过性菌毛将F质粒转给F－菌株，使F －菌株转变成 F +菌株。质粒由F +向F－菌的转移过程 叫接合作用传递质粒, 又称质粒的接合传递。凡带有 在染色体上整合F质粒的细菌又称高频重组株系 （Hfr株系）。Hfr株系不稳定，F质粒可发生接合传 递质粒DNA, F+菌株可失去F质粒, F－菌也可获得F质 粒, 其转移难以人为控制,又不稳定， 通常不用作克 隆载体
接合 F+×F Donor F Recipient
接合---- F +×F－ F + F - F + F - F + F + F + F + Donor Recipient