4、质量评估凝胶电泳12光密度值测定3)限制酶切分析细胞裂解二、1.酶法：利用某些细胞壁裂解酶使细胞变为原生质体，然后加去垢剂使原生质体裂解。1)细菌：溶菌酶2）酵母：蜗牛酶、Novozyme234、glusulase、zymolase等3）丝状真菌：Novozyme234、溶壁酶、纤维素酶4)植物细胞：纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶酶法裂解时要注意细胞的生长条件和生长时间，反应时尽可能满足酶的最佳反应条件
4、质量评估 1） 凝胶电泳 2）光密度值测定 3）限制酶切分析 二、细胞裂解 1. 酶法： 利用某些细胞壁裂解酶使细胞变为原生质体，然后加去垢剂 使原生质体裂解。 1) 细菌：溶菌酶 2) 酵母：蜗牛酶、Novozyme234、glusulase、zymolase 等 3) 丝状真菌：Novozyme234、溶壁酶、纤维素酶 4) 植物细胞：纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶 酶法裂解时要注意细胞的生长条件和生长时间，反应时尽可能满 足酶的最佳反应条件
2.机械法（芽孢细菌1)压力剪切法：French压力机，酵母细胞，和G+球菌除外）搅切器（blender），混合2)射击破碎法：Braun破碎机，器（mixer），0.1-0.45mm玻璃球3)固体研磨法：将待破碎细胞与玻璃球（0.1~0.45mm同时致冷，在未融熔前用研杆磨成粉未4)反复冻融法三、DNA的分离与纯化1、供体DNA的分离与纯化要求：尽可能地保持其高分子量，无其它污染物。基因组大小：1
2. 机械法 1) 压力剪切法：French压力机，酵母细胞，细菌（芽孢 和G+球菌除外） 2)射击破碎法：Braun破碎机，搅切器（blender），混合 器（mixer），0.1-0.45mm玻璃球 3)固体研磨法：将待破碎细胞与玻璃球（0.1~0.45mm） 同时致冷，在未融熔前用研杵磨成粉末 4)反复冻融法 三、DNA的分离与纯化 1、供体DNA的分离与纯化 要求：尽可能地保持其高分子量，无其它污染物。 1) 基因组大小：
染色体线粒体细菌线状藻类3300~4200kb15kb酵母酵母环状15.000kb19~78kb果蝇植物环状1.28x105kb100~150kb人3x106kb动物(扁虫到人)环状15~18kb植物锥虫网状2x105~1x108kb6000kb(幼体）天花病毒288kb网状短膜虫30.000kb（幼体）痘病毒196 kb(Kinetoplast)质体几~100以上kb叶绿体双子叶植物121（菠菜）-~154kb（豌豆）单子叶植物151（玉米）182kb（浮萍）藻类132（裸藻）~191kb（衣藻）
染色体 细菌 3300~4200kb 酵母 15,000 kb 果蝇 1.28x105 kb 人 3x106 kb 植物 2x105~1x108 kb 天花病毒 288 kb 痘病毒 196 kb 质体 几~100以上kb 线粒体 藻类 线状 15kb 酵母 环状 19~78 kb 植物 环状 100~150 kb 动物(扁虫到人)环状 15~18 kb 锥虫 网状 6000 kb(幼体) 短膜虫 网状 30,000 kb(幼体) (Kinetoplast） 叶绿体 双子叶植物 121（菠菜）~154kb（豌豆） 单子叶植物 151（玉米）~182kb（浮萍） 藻类 132（裸藻）~191kb（衣藻）
DNA分离纯化过程破碎细胞+DNA抽提液(EDTA、去污剂、还原剂)一65℃温育冰浴冷却一离心去细胞碎片20'苯酚抽提法①CsCI密度梯度离心21）苯酚抽提法上清液缓冲液用水饱和苯酚抽提2~3次一上层液相用氯仿抽至界面无蛋白变性物→上层液相用两倍体积冷乙醇沉淀沉淀物用70%冷乙醇洗涤，干燥溶于缓冲液一加入RNAase处理除去RNA一苯酚氯仿抽提沉淀干燥
1) DNA分离纯化过程 破碎细胞 + DNA抽提液(EDTA、去污剂、还原剂) 65℃温育 20’ 冰浴冷却 离心去细胞碎片 苯酚抽提法① CsCl密度梯度离心② 1) 苯酚抽提法 上清液 缓冲液用水饱和苯酚抽提2~3次 上层液相用氯仿抽 至界面无蛋白变性物 上层液相用两倍体积冷乙醇沉淀 沉 淀物用70%冷乙醇洗涤,干燥 溶于缓冲液 加入RNAase处理 除去RNA 苯酚氯仿抽提 沉淀干燥
2）CsCI密度梯度离心上清液一加入固体CsCI与EtBr溶液一室温下超速离心一（45,000rpm）16小时一穿孔取出DNA（320nm）一异丙醇抽提溴乙锭一一缓冲液透析除去残余CsCI两倍体积冷乙醇沉淀DNA一一→离心、洗涤、干燥*两种方法比较：CsCI法操作步骤少，分离DNA分子量大，耗财多，且需超速离心机。苯酚法耗时少，不需昂贵仪器，但操作步骤多，易使DNA分子断裂。若小心操作，所获DNA亦符合要求。*＊上述两种分离方法都包含了下述四个分离步骤i.可溶与不可溶物分离：高速离心除去细胞碎片，保留上清液i.使蛋白质分离：苯酚抽提或超速离心i.使RNA分离：RNase处理或超速离心iv.使DNA与其它可溶物分离
2) CsCl密度梯度离心 上清液 加入固体CsCl与EtBr溶液 室温下超速离心 (45,000rpm）16小时 穿孔取出DNA（320nm） 异丙醇抽提 溴乙锭 缓冲液透析除去残余CsCl 两倍体积冷乙醇沉淀 DNA 离心、洗涤、干燥 *两种方法比较： CsCl法操作步骤少，分离DNA分子量大，耗财多，且需超速 离心机。 苯酚法耗时少，不需昂贵仪器，但操作步骤多，易使DNA分 子断裂。 若 小心操作，所获DNA亦符合要求。 ** 上述两种分离方法都包含了下述四个分离步骤 ⅰ.可溶与不可溶物分离：高速离心除去细胞碎片，保留上清液。 ⅱ. 使蛋白质分离：苯酚抽提或超速离心 ⅲ. 使RNA分离：RNase处理或超速离心 ⅳ. 使DNA与其它可溶物分离