降而添加的酶切位点以及额外保护碱基序列。4.引物的3”末端的第一和第二个碱基影响DNA聚合酶的延伸效率，故其影响PCR反应的扩增效率和特异性。建议引物3’末端选择G或C，因为他们形成的碱基配对比较稳定。5.引物使用浓度：建议0.1~1.0μM，默认是1μM。浓度太高会导致错配、引物二聚体增加；浓度太低导致PCR效率降低。2.1.3Gibson assembly简介（INTRODUCTION）Gibsonassembly是一种onestep，onepot的快速基因组装方法。它只需要将基因片段和需要的三种酶混合在同一个管内在50°C下培养15~60min就可以得到组装好的DNA。H装配原理基于DNA片段间的重叠区域，过程依赖于三种酶：DNA外切酶（T5exonuclease），高保真DNA聚合酶（Phusionpolymerase）和耐热DNA连接酶（TaqDNAligase）的共同作用。首先，T5核酸外切酶消化DNA片段的方向是从5”端到3”端。每个DNA片段分别形成一个单链的突出部分，由于这两个相邻的突出片段有一部分具有同源性能够互补，所以DNA片段退火后，互补的序列重新配对连接。然后，在空缺的部分DNA聚合酶以另一条DNA单链为模板，沿3方向将对应的脱氧核苷酸连接到单链上，填补缺口。最后，连接酶将两条DNA单链黏合起来，密封裂缝。这样具有重叠区域的DNA片段就组装成一整条DNA分子了。最近我们实验室所使用的是5×T5试剂（里面只有一种T5exonuclease外切酶，没有其他组分），依靠细菌自身的重组能力进行重组转化克隆。下面是组装的示意图。最近文献和我们的结果显示，只采用T5exonuclease一种酶，等DNA退火后，可以直接转化入感受态细胞，利用细胞内DNA修复机制修复，从而复制完整双链质粒。这种方案效率更好，但是不能用电转法。材料（MATERIALS)口试剂（REAGENTS）NAD，H2O，1MMgCl2，1MDTT,10mMdNTPmix，1MTris-HClpH7.5，50%PEG-8000,2.7mg/mLTagligase，0.85μg/mLT5_ExO，Phusion（1×）、LB培养基、抗生素（据载体而定）、LB平板（相应抗性）口实验前准备（SETUP）于冰水浴中配制如下反应体系。如果不慎将液体粘在管壁，可通过短暂离心使其沉入管底。加入量4xisothermalassemblybufferNAD20 mgH20300 μL1 M MgCl2300μL1MDTT300μL10 mM dNTP mix600 μL
隆而添加的酶切位点以及额外保护碱基序列。 4. 引物的3’末端的第一和第二个碱基影响DNA聚合酶的延伸效率，故其影响PCR反应的扩增效率和 特异性。建议引物3’末端选择G或C，因为他们形成的碱基配对比较稳定。 5. 引物使用浓度：建议0.1~1.0 μM，默认是1 μM。浓度太高会导致错配、引物二聚体增加；浓度太 低导致PCR效率降低。 2.1.3 Gibson assembly 简介（INTRODUCTION） Gibson assembly是一种one step，one pot的快速基因组装方法。它只需要将基因片段和需要的三种 酶混合在同一个管内在50 °C下培养15~60 min就可以得到组装好的DNA。 装配原理基于DNA片段间的重叠区域，过程依赖于三种酶：DNA外切酶（T5 exonuclease），高 保真DNA聚合酶（Phusion polymerase）和耐热DNA连接酶（Taq DNA ligase）的共同作用。首先， T5核酸外切酶消化DNA片段的方向是从5’端到3’端。每个DNA片段分别形成一个单链的突出部 分，由于这两个相邻的突出片段有一部分具有同源性能够互补，所以DNA片段退火后，互补的序列 重新配对连接。然后，在空缺的部分DNA聚合酶以另一条DNA单链为模板，沿3’方向将对应的脱氧 核苷酸连接到单链上，填补缺口。最后，连接酶将两条DNA单链黏合起来，密封裂缝。这样具有重 叠区域的DNA片段就组装成一整条DNA分子了。最近我们实验室所使用的是5×T5试剂（里面只有一 种T5 exonuclease外切酶，没有其他组分），依靠细菌自身的重组能力进行重组转化克隆。下面是组 装的示意图。最近文献和我们的结果显示，只采用T5 exonuclease一种酶，等DNA退火后，可以直接 转化入感受态细胞，利用细胞内DNA修复机制修复，从而复制完整双链质粒。这种方案效率更好， 但是不能用电转法。 材料（MATERIALS） r 试剂（REAGENTS） NAD，H2O，1 M MgCl2，1 M DTT，10 mM dNTP mix，1 M Tris-HCl pH 7.5，50% PEG-8000， 2.7 mg/mL Tag ligase，0.85 μg/mL T5_ExO，Phusion（1×）、LB培养基、抗生素（据载体而 定）、LB平板（相应抗性） r 实验前准备（SETUP） 于冰水浴中配制如下反应体系。如果不慎将液体粘在管壁，可通过短暂离心使其沉入管底。 4x isothermal assembly buffer 加入量 NAD 20 mg H2O 300 μL 1 M MgCl2 300 μL 1 M DTT 300 μL 10 mM dNTP mix 600 μL
3 mL1 M Tris-HCI pH 7.53 mL50%PEG-8000加水到7.5mL，每管分500uL存于-20°C或-80C冰箱，够3000个反应。加入量2x assembly mix: best combination:1 mL100reaction10 μL2.7 mg/mL Tag ligase100 μL0.85 μg/ mL T5_ExO25 μLPhusion(1x)500 μL4xisothermal assemblebuffer加水365μL，存于-20C冰箱，有效期1年。实验步骤（PROCEDURE）1.设计引物通过PCR的方法在DNA片段的两端加上同源片段，NEB推荐同源片段的长度为15-40bp，同时要求这部分对应的退火温度高于50℃。2.进行DNA纯化：PCR产物进行琼脂糖电泳，胶回收，或者PCR产物回收试剂盒回收。3.进行重组反应，以20反应体系为例：组分加入量10 μLIsothermal assembly Master Mix线性化载体10~100 ng (1~2 μL)插入片段8~9μL（3~5倍载体）补足至20μLSterilized ddH2050C反应15~60min。4.转化10uL的重组反应产物，涂板及克隆鉴定同传统分子克隆方法。针对性建议1.线性化载体的制备有两种，第一种是使用内切酶对克隆载体进行酶切，此方法的优点是载体的突变率较低，高保真，但缺点是酶切不完全会使假阳性克隆空载体的出现影响单克隆的鉴定。第二种是反向PCR扩增制备线性化克隆载体，再采用胶回收或者DpnI消化以去除环状载体质粒模板的影响，此方法的优点是假阳性克隆较少，但缺点是因PCR扩增的条带较长，突变的概率也会相应增加。2.在进行DNA纯化时，PCR产物最好进行琼脂糖电泳，然后进行胶回收以去除PCR扩增时加入环状质粒模板对克隆鉴定的影响。3.在选择克隆位点时，应避免选择克隆位点上下游50bp内有重复序列的区域。当克隆位点上下游20bp区域内GC含量均在40%60%范围之内时，重组效率将达到最大。如这部分区域GC含量高于70%或者低于30%，重组效率会受到较大影响。4.Gibson组装克隆法缺点之一是适用与长度超过200bp的片段的组装；缺点之二是如果黏性未端形成稳定的二级结构，如发夹结构或者茎环结构，那么成功率会大受影响，优点是可以同时进行多个片段的组装克隆。5.在进行重组反应时，载体用量一般在50~100ng较好，载体和片段的摩尔比为1：1至1：3，当片段小于200bp时，片段的用量可增加到载体的5倍量。6.50℃C反应的时间最好不要超过60分钟。2.1.4质粒抽提-大抽简介（INTRODUCTION）本方法使用QIAGEN（德国凯杰）质粒提取试剂盒。QIAGEN-tips内独特的阴离子交换树脂专为纯化核酸设计。它独特的分离特性，使纯化的DNA的纯度相当于连续2次CsCI梯度离心得到的DNA纯
1 M Tris-HCl pH 7.5 3 mL 50% PEG-8000 3 mL 加水到7.5 mL，每管分500 μL存于-20 °C或-80 °C冰箱，够3000个反应。 2× assembly mix: best combination: 加入量 100 reaction 1 mL 2.7 mg/mL Tag ligase 10 μL 0.85 μg/ mL T5_ExO 100 μL Phusion（1×） 25 μL 4× isothermal assemble buffer 500 μL 加水365 μL，存于-20 °C冰箱，有效期1年。 实验步骤（PROCEDURE） 1. 设计引物通过PCR的方法在DNA片段的两端加上同源片段，NEB推荐同源片段的长度为15-40 bp，同时要求这部分对应的退火温度高于50 °C。 2. 进行DNA纯化：PCR产物进行琼脂糖电泳，胶回收，或者PCR产物回收试剂盒回收。 3. 进行重组反应，以20 μL反应体系为例： 组分 加入量 Isothermal assembly Master Mix 10 μL 线性化载体 10~100 ng（1~2 μL） 插入片段 8~9 μL （3~5倍载体） Sterilized ddH2O 补足至20 μL 50 °C反应15~60 min。 4. 转化10 μL的重组反应产物，涂板及克隆鉴定同传统分子克隆方法。 针对性建议 1. 线性化载体的制备有两种，第一种是使用内切酶对克隆载体进行酶切，此方法的优点是载体的突 变率较低，高保真，但缺点是酶切不完全会使假阳性克隆空载体的出现影响单克隆的鉴定。第二种 是反向PCR扩增制备线性化克隆载体，再采用胶回收或者Dpn I消化以去除环状载体质粒模板的影 响，此方法的优点是假阳性克隆较少，但缺点是因PCR扩增的条带较长，突变的概率也会相应增 加。 2. 在进行DNA纯化时，PCR产物最好进行琼脂糖电泳，然后进行胶回收以去除PCR扩增时加入环状 质粒模板对克隆鉴定的影响。 3. 在选择克隆位点时，应避免选择克隆位点上下游50 bp内有重复序列的区域。当克隆位点上下游20 bp区域内GC含量均在40%～60%范围之内时，重组效率将达到最大。如这部分区域GC含量高于 70%或者低于30%，重组效率会受到较大影响。 4. Gibson组装克隆法缺点之一是适用与长度超过200 bp的片段的组装；缺点之二是如果黏性末端形 成稳定的二级结构，如发夹结构或者茎环结构，那么成功率会大受影响，优点是可以同时进行多个 片段的组装克隆。 5. 在进行重组反应时，载体用量一般在50~100 ng较好，载体和片段的摩尔比为1：1至1：3，当片段 小于200 bp时，片段的用量可增加到载体的5倍量。 6. 50 °C反应的时间最好不要超过60分钟。 2.1.4 质粒抽提-大抽 简介（INTRODUCTION） 本方法使用QIAGEN（德国凯杰）质粒提取试剂盒。QIAGEN-tips内独特的阴离子交换树脂专为 纯化核酸设计。它独特的分离特性，使纯化的DNA的纯度相当于连续2次CsCl梯度离心得到的DNA纯