、新的测序策略-全基因组鸟枪法测序 对某基因组文库全部克隆片段进行末端序列 测定中未测到的碱基数,即缺口(gap),与已测定 的总碱基数相关。随着已测定碱基数的增加,缺 口的总碱基数目会按照泊松公式的一个推论 (P=e-m)迅速减小。其中P为基因组中某个碱基 未被测定的概率,m为所测定的碱基数与基因组 大小相比的倍数。m越大P值越小。当m值达到5 (即随机测定的碱基数达到基因组5倍时),基因 组中未测定的碱基数为基因组总碱基数的 0.67%(e-5=0.0067)。对流感嗜血杆菌这样大的基 因组(1.83Mb),可能留有128个平均长度为100bp 的缺口
二、新的测序策略--全基因组鸟枪法测序 对某基因组文库全部克隆片段进行末端序列 测定中未测到的碱基数，即缺口(gap)，与已测定 的总碱基数相关。随着已测定碱基数的增加，缺 口的总碱基数目会按照泊松公式的一个推论 （P=e-m）迅速减小。其中P为基因组中某个碱基 未被测定的概率，m为所测定的碱基数与基因组 大小相比的倍数。m越大P值越小。当m值达到5 （即随机测定的碱基数达到基因组5倍时），基因 组中未测定的碱基数为基因组总碱基数的 0.67%(e-5=0.0067)。对流感嗜血杆菌这样大的基 因组(1.83Mb)，可能留有128个平均长度为100bp 的缺口
DNA fragments CAATGCATTA GCAGCCAATGC Sequences Overla Figure 2.1 The shotgun approach to sequence assembly
全基因组鸟枪法测序的主要步骤是 第一,建立高度随机、插入片段大小为2kb左右的基因 组文库。克隆数要达到一定数量,即经末端测序的克隆片 段的碱基总数应达到基因组5倍以上。 第二,高效、大规模的未端测序。对文库中每一个克 隆,进行两端测序,TGR在完成流感嗜血杆菌的基因组 时,使用了14台测序仪,用三个月时间完成了必需的 28,463个测序反应,测序总长度达6倍基因组。 第 序列集合。TGR发展了新的软件,修改了序列 集合规则以最天限度地排除错误的连锁匹配。 第四,填补缺口。有两种待填补的缺口,一是没有相 应模板DNA的物理缺口,二是有模板DNA但未测序的序列 缺口。他们建立了插入片段为15-20kb的λ文库以备缺口填
▪ 全基因组鸟枪法测序的主要步骤是： 第一，建立高度随机、插入片段大小为2kb左右的基因 组文库。克隆数要达到一定数量，即经末端测序的克隆片 段的碱基总数应达到基因组5倍以上。 第二，高效、大规模的末端测序。对文库中每一个克 隆，进行两端测序，TIGR在完成流感嗜血杆菌的基因组 时，使用了14台测序仪，用三个月时间完成了必需的 28,463个测序反应，测序总长度达6倍基因组。 第三，序列集合。TIGR发展了新的软件，修改了序列 集合规则以最大限度地排除错误的连锁匹配。 第四，填补缺口。有两种待填补的缺口，一是没有相 应模板DNA的物理缺口，二是有模板DNA但未测序的序列 缺口。他们建立了插入片段为15-20kb的λ文库以备缺口填 补
鸟枪法测序的缺点 着所测基因组总量增大,所需测序的片段大量增加,各 高等真核生物(如人类)基因组中有大量重复序列,导致 判断失误。 Repetitive DNA DNA 500bp Fragments GAT TAGAT TAGAT TA GAT TAGAT TA Sequences lnc。 rrect overlap Figure 2.2 Problems with the shotgun approach
▪ 鸟枪法测序的缺点 随着所测基因组总量增大，所需测序的片段大量增加，各 个片段重叠或一个连续体的概率是2n2-2n 高等真核生物（如人类）基因组中有大量重复序列，导致 判断失误
(A) Correct sequence assembly 对鸟枪法的改进 (1) Clone contig法 Genome-wide repeats 首先用稀有内切酶 Ikb DNA sequence 把待测基因组降解 为数百kb以上的片 段,再分别测序 Both end-sequences from a 10kb insert can be (2)靶标鸟枪法 positioned in the master sequence direted shotgun)。 首先根据染色体上 (B)Incorrect sequence assembly 已知基因和标记的 位置来确定部分 Sequence between repeats has been left out DNA片段的相对位 置,再逐步缩小各 片段之间的缺口 Only one end-sequence appears in the master Figure 4.17 Avoiding errors when the directed shotgun as approach is used
▪ 对鸟枪法的改进 (1) Clone contig法。 首先用稀有内切酶 把待测基因组降解 为数百kb以上的片 段，再分别测序。 (2) 靶标鸟枪法 (direted shotgun)。 首先根据染色体上 已知基因和标记的 位置来确定部分 DNA片段的相对位 置，再逐步缩小各 片段之间的缺口