基因工程原理实验指导 录 实验一质粒的制备 实验二DNA的琼脂糖凝胶电泳 实验三外源DNA片段在质粒载体中的克隆 实验四感受态细胞的制备 实验五质粒的转化及转化子的鉴定 实验六PCR技术 实验七植物总DNA的快速少量抽提(CTAB法) 实验八总DNA质量检测及酶切 实验九电泳、转膜 实验十RNA Extraction(mini prep) 实验十一RT-PCR实验 附录试剂配方 一细菌培养试剂 二质粒抽提试剂 三DNA操作试剂 四RNA操作试流
基因工程原理实验指导 5 目 录 实验一 质粒的制备 实验二 DNA 的琼脂糖凝胶电泳 实验三 外源 DNA 片段在质粒载体中的克隆 实验四 感受态细胞的制备 实验五 质粒的转化及转化子的鉴定 实验六 PCR 技术 实验七 植物总 DNA 的快速少量抽提（ CTAB 法） 实验八 总 DNA 质量检测及酶切 实验九 电泳、转膜 实验十 RNA Extraction (mini prep) 实验十一 RT-PCR 实验 附录 试剂配方 一 细菌培养试剂 二 质粒抽提试剂 三 DNA 操作试剂 四 RNA 操作试剂
基因工程原理实验指导 实验一质粒的制备 质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的主要载体，它在基因操作中具 有重要作用。质粒的分离与提取是最常用、最基本的实验技术】 质粒的提取方法很多，大多包括3个主要步骤：细菌的培养、细菌的收集和裂 解、质粒DNA的分离和纯化。本实验以碱裂解法为例，介绍质粒的抽提过程。 实验目的：掌握碱裂解法抽提质粒的原理、步骤及各试剂的作用。 实验材料：含有质粒pUC18载体的大肠杆菌菌液，克降有水稻外源片段 的BAC的大肠杆菌菌液。 实验原理：在pH12.0~12.6碱性环境中，细菌的线性大分子量染色体 DNA变性分开，而共价闭环的质粒DNA虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。将 pH调至中性并有高盐存在及低温的条件下，大部分染色体DNA、大分子量的 RNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍然为可溶状 态。通过离心，可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质 粒DNA尚在上清中，然后用酚、氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。 实验步骤： 1.取含有pUC18质粒的大肠杆菌菌液于LA培养基上37℃过夜培养 2.用无菌牙签挑取单菌落，接种于含有Amp抗生素的LB培养基中，37℃ 摇床，250rmin过夜培养： 3.吸取1.5ml菌液，12000g离心2分钟，收集菌体，倒掉菌液：吸取1.5 ml菌液，再次收集菌体，尽量将菌液倒干净： 4.加入300μ1溶液1振荡打匀，重新悬浮细胞，震荡混匀（注意：应彻底 打匀沉淀或碎块)： 5.加入300μ1溶液Ⅱ，轻柔颠倒混匀，放置至清亮，一般不超过5分钟： 6.加入300μ1溶液Ⅲ颠倒混匀，放置于冰上10分钟，使杂质充分沉淀： 12000g离心10分钟： 7.吸取8O0μ1上清液（注意：不要吸取到飘浮的杂质）至另一Eppendorf管 中，加入23体积的异丙醇，室温下放置5分钟： 12000g常温离心15分钟： 8.倒尽上清，加75%乙醇浸洗除盐（放置片刻或离心3分钟后倒去上清）： 9.室温放置或超净台上风干DNA: 10.加40μ1灭菌超纯水或TE溶解： 11.质粒、BAC的质量检测，于-20℃保存
基因工程原理实验指导 6 实验一 质粒的制备 质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的主要载体，它在基因操作中具 有重要作用。质粒的分离与提取是最常用、最基本的实验技术。 质粒的提取方法很多，大多包括 3 个主要步骤：细菌的培养、细菌的收集和裂 解、质粒 DNA 的分离和纯化。本实验以碱裂解法为例，介绍质粒的抽提过程。 实验目的： 掌握碱裂解法抽提质粒的原理、步骤及各试剂的作用。 实验材料： 含有质粒 pUC18 载体的大肠杆菌菌液，克隆有水稻外源片段 的 BAC 的大肠杆菌菌液。 实验原理： 在 pH 12.0～12.6 碱性环境中，细菌的线性大分子量染色体 DNA 变性分开，而共价闭环的质粒 DNA 虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。将 pH 调至中性并有高盐存在及低温的条件下，大部分染色体 DNA 、大分子量的 RNA 和蛋白质在去污剂 SDS 的作用下形成沉淀，而质粒 DNA 仍然为可溶状 态。通过离心，可除去大部分细胞碎片、染色体 DNA 、 RNA 及蛋白质，质 粒 DNA 尚在上清中，然后用酚、氯仿抽提进一步纯化质粒 DNA 。 实验步骤： 1． 取含有 pUC18 质粒的大肠杆菌菌液于 LA 培养基上 37 ℃过夜培养； 2． 用无菌牙签挑取单菌落，接种于含有 Amp 抗生素的 LB 培养基中， 37 ℃ 摇床，250 r/min 过夜培养； 3． 吸取 1.5 ml 菌液， 12000 g 离心 2 分钟，收集菌体，倒掉菌液；吸取 1.5 ml 菌液，再次收集菌体，尽量将菌液倒干净； 4． 加入 300 μl 溶液 I 振荡打匀，重新悬浮细胞，震荡混匀（注意：应彻底 打匀沉淀或碎块）； 5． 加入 300 μl 溶液 II ，轻柔颠倒混匀，放置至清亮，一般不超过 5 分钟； 6． 加入 300 μl 溶液 III 颠倒混匀，放置于冰上 10 分钟，使杂质充分沉淀； 12000 g 离心 10 分钟； 7． 吸取 800 μl 上清液（注意：不要吸取到飘浮的杂质）至另一 Eppendorf 管 中，加入 2/3 体积的异丙醇，室温下放置 5 分钟； 12000 g 常温离心 15 分钟； 8． 倒尽上清，加 75 ％乙醇浸洗除盐（放置片刻或离心 3 分钟后倒去上清）； 9． 室温放置或超净台上风干 DNA ； 10． 加 40 μl 灭菌超纯水或 TE 溶解； 11． 质粒、 BAC 的质量检测，于 -20 ℃保存
基因工程原理实验指导 附注：质粒检测 电泳检测：质粒电泳一般有三条带，分别为质粒的超螺旋、开环、线型三种构型 吸光值检测：采用分光光度计检测260nm、280nm波长吸光值，若吸光值 260nm/280nm的比值介于1.7一1.9之间，说明质粒质量较好，1.8为最佳， 低于1.8说明有蛋白质污染，大于1.8说明有RNA污染。 实验二DNA的琼脂糖凝胶电泳 带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。电泳的种类多，应用非常广泛， 它己成为分子生物学技术中分离生物大分子的重要手段。琼脂糖凝胶电泳由于其 操作简单、快速、灵敏等优点，己成为分离和鉴定核酸的常用方法。 实验目的：掌握琼脂糖凝胶电泳的原理，学习琼脂糖凝胶电泳的操作。 实验材料：质粒DNA、BAC、植物总DNA或它们的酶切产物。 实验原理：在H值为80一83时，核酸分子威基几平不解离，磷移全部解 离，核酸分子带负电，在电泳时向正极移动。采用适当浓度的凝胶介质作为电泳 支持物，在分子蹄的作用下，使分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较》 的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。核酸分子中嵌入荧光染料（如 EB)后，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。 实验步骤： 1.用胶带将洗净、干燥的制胶板的两端封好，水平放置在工作台上： 2,调整好梳子的高度： 3.称取0.24g琼脂糖于30ml0.5×TBE中，在微波炉中使琼脂糖颗粒完全 溶解，冷却至4550℃时倒入制胶板中： 4.凝胶凝固后，小心拔去梳子，撕下胶带： 5.将电泳样品与溴酚蓝混合后将样品依次点入加样孔中： 6.pUC185μ1+ddH203μ1+溴酚蓝2μl共10u】于0.5 ml tube中混合后 点样： 7.将制胶板放入电泳槽中，加入电泳液，打开电泳仪，使核酸样品向正极泳动： 8.电泳完成后切断电源，取出凝胶，放入0.5μgml的溴化乙锭(EB)溶液 中染色10一I5mi,清水漂洗后置于紫外透射仪上观察电泳结果，并照相记 录。 附注：1.影响DNA在琼脂糖凝胶中迁移速率的因素： ①DNA分子大小迁移速率U与IogN成反比(N为碱基对数目)。分子大 小相等，电荷基本相等(DNA结构重复性)。分子越大，迁移越慢。等量的 空间结构紧密的电泳快（超螺旋>线性DNA)
基因工程原理实验指导 7 附注： 质粒检测 电泳检测：质粒电泳一般有三条带，分别为质粒的超螺旋、开环、线型三种构型 吸光值检测：采用分光光度计检测 260nm 、 280nm 波长吸光值，若吸光值 260nm/280nm 的比值介于 1.7 － 1.9 之间，说明质粒质量较好， 1.8 为最佳， 低于 1.8 说明有蛋白质污染，大于 1.8 说明有 RNA 污染。 实验二 DNA 的琼脂糖凝胶电泳 带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。电泳的种类多，应用非常广泛， 它已成为分子生物学技术中分离生物大分子的重要手段。琼脂糖凝胶电泳由于其 操作简单、快速、灵敏等优点，已成为分离和鉴定核酸的常用方法。 实验目的： 掌握琼脂糖凝胶电泳的原理，学习琼脂糖凝胶电泳的操作。 实验材料： 质粒 DNA 、 BAC 、植物总 DNA 或它们的酶切产物。 实验原理： 在 pH 值为 8.0～8.3 时，核酸分子碱基几乎不解离，磷酸全部解 离，核酸分子带负电，在电泳时向正极移动。采用适当浓度的凝胶介质作为电泳 支持物，在分子筛的作用下，使分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大 的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。核酸分子中嵌入荧光染料（如 EB ）后，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。 实验步骤： 1． 用胶带将洗净、干燥的制胶板的两端封好，水平放置在工作台上； 2． 调整好梳子的高度； 3． 称取 0.24 g 琼脂糖于 30 ml 0.5 × TBE 中，在微波炉中使琼脂糖颗粒完全 溶解，冷却至 45-50℃ 时倒入制胶板中； 4． 凝胶凝固后，小心拔去梳子，撕下胶带； 5． 将电泳样品与溴酚蓝混合后将样品依次点入加样孔中； 6． pUC18 5μl + ddH2O 3μl + 溴酚蓝 2μl 共 10μl 于 0.5ml tube 中混合后 点样 ； 7． 将制胶板放入电泳槽中，加入电泳液，打开电泳仪，使核酸样品向正极泳动； 8． 电泳完成后切断电源，取出凝胶，放入 0.5 μg/ml 的溴化乙锭（ EB）溶液 中染色 10－15 min，清水漂洗后置于紫外透射仪上观察电泳结果，并照相记 录。 附注： 1．影响 DNA 在琼脂糖凝胶中迁移速率的因素： ① DNA 分子大小 迁移速率 U 与 logN 成反比（ N 为碱基对数目）。分子大 小相等，电荷基本相等（ DNA 结构重复性）。分子越大，迁移越慢。等量的 空间结构紧密的电泳快（超螺旋 > 线性 DNA ）
基因工程原理实验指导 ②琼脂糖浓度：logU=logU0Krt胶浓度，U为迁移率，U0为DNA的自由电 泳迁移率，t为胶浓度，K灯为介质阻滞系数。不同的凝胶浓度，分辨不同范 围的DNA Agarose 0.5%：1-30kb 0.7%:0.8-12kb 1.2%:0.4-7kb:1.5%:02-3kb. ③DNA构象： 一般迁移速率超螺旋环状>线状DNA>单链开环。当条件变 化时，情况会相反，还与琼脂糖的浓度、电流强度、离子强度及EB含量有关。 ④所加电压：低电压时，线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。使分 排效果 凝胶 上所加电压不应超过 t 5V/em ⑤碱基组成与温度： 般影响不大4-30℃ ©嵌入染料的存在：降低线性DNA迁移率（不提倡加在电泳液中） ⑦电泳缓冲液(O.5XTBE)的组成及其离子强度影响DNA的迁移率，无 离子存在时，核酸基本不泳动，离子强度过大产热厉害，熔化凝胶并导致DNA 变性， 般采用1XTAE,1XTBE,1XTPE(均含EDTA PH8.0 2.溴化乙锭(EB)为致癌剂，操作时应戴手套，尽量减少台面污染。 3.电泳指示剂：核酸电泳常用的指示剂有两种，溴酚蓝(bromophenol blue,Bb) 呈蓝紫色：二甲苯晴(xylene cyanol,Xc)呈蓝色，它携带的电荷量比溴酚蓝 少，在凝胶中的迁移率比溴酚蓝慢。 实验三外源DNA片段在质粒载体中的克隆 DNA重组技术包括载体及外源DNA片段的酶切消化、目的片段的获得及纯 化、目的片段与克隆载体的体外连接、重组子的筛选和鉴定等内容。DNA片 段的克隆技术是分子操作的核心部分。 实验目的：学习DNA的酶切、纯化及外源片段与载体的连接，将BAC克隆 所携带的外源DNA酶切片段亚克隆到pUC18载体上。 实验材料：外源片段来自一个含有水稻DNA片段的BAC克隆的酶切片段， 克隆载体为PUC18。 实验原理：限制性内切酶可识别特定位点并切割DNA产生粘性末端或平端的 外源片段，经DNA的纯化处理后用于连接反应：选择克隆载体pUC18多克隆 位点上相应的限制性内切酶切割，并用碱性磷酸酶处理防止载体自连：在连接酶 的作用下将外源片段连接到载体上，实现外源片段的克隆。 实验步骤： 1.载体pUC18和外源DNA片段的限制性酶切： (50l反应体系，用1.5 ml tube,冰上操作) DNA 30 ul R.E1ul 10×buffer5l ddH2O 14 ul
基因工程原理实验指导 8 ② 琼脂糖浓度： logU=logU0Krt 胶浓度， U 为迁移率，U0 为 DNA 的自由电 泳迁移率， t 为胶浓度， Kr 为介质阻滞系数。不同的凝胶浓度，分辨不同范 围的 DNA Agarose ： 0.5% ： 1-30 kb ； 0.7% ： 0.8-12 kb 1.2% ： 0.4-7 kb ； 1.5% ： 0.2-3 kb. ③ DNA 构象：一般迁移速率超螺旋环状 > 线状 DNA> 单链开环。当条件变 化时，情况会相反，还与琼脂糖的浓度、电流强度、离子强度及 EB 含量有关。 ④ 所加电压：低电压时，线状 DNA 片段的迁移速率与所加电压成正比。使分 辨效果好，凝胶上所加电压不应超过 5V/cm ⑤ 碱基组成与温度：一般影响不大 4 -30 ℃ ⑥ 嵌入染料的存在：降低线性 DNA 迁移率 ( 不提倡加在电泳液中 ) ⑦ 电泳缓冲液 （ 0.5 × TBE ）的组成及其离子强度影响 DNA 的迁移率，无 离子存在时，核酸基本不泳动，离子强度过大产热厉害，熔化凝胶并导致 DNA 变性，一般采用 1 × TAE ， 1 × TBE ， 1 × TPE （均含 EDTA pH 8.0 ）。 2．溴化乙锭（ EB ）为致癌剂，操作时应戴手套，尽量减少台面污染。 3．电泳指示剂：核酸电泳常用的指示剂有两种，溴酚蓝（ bromophenol blue, Bb ） 呈蓝紫色；二甲苯晴（ xylene cyanol, Xc ）呈蓝色，它携带的电荷量比溴酚蓝 少，在凝胶中的迁移率比溴酚蓝慢。 实验三 外源 DNA 片段在质粒载体中的克隆 DNA 重组技术包括载体及外源 DNA 片段的酶切消化、目的片段的获得及纯 化、目的片段与克隆载体的体外连接、重组子的筛选和鉴定等内容。 DNA 片 段的克隆技术是分子操作的核心部分。 实验目的： 学习 DNA 的酶切、纯化及外源片段与载体的连接，将 BAC 克隆 所携带的外源 DNA 酶切片段亚克隆到 pUC18 载体上。 实验材料： 外源片段来自一个含有水稻 DNA 片段的 BAC 克隆的酶切片段， 克隆载体为 PUC18 。 实验原理： 限制性内切酶可识别特定位点并切割 DNA 产生粘性末端或平端的 外源片段，经 DNA 的纯化处理后用于连接反应；选择克隆载体 pUC18 多克隆 位点上相应的限制性内切酶切割，并用碱性磷酸酶处理防止载体自连；在连接酶 的作用下将外源片段连接到载体上，实现外源片段的克隆。 实验步骤： 1．载体 pUC18 和外源 DNA 片段的限制性酶切： （ 50 µl 反应体系，用 1.5ml tube ，冰上操作） DNA 30 µl R.E 1 µl 10 × buffer 5 µl ddH2O 14 µl
基因工程原理实验指导 37℃反应1hr,分别取8山外源片段酶切产物和5lPUC18酶切产物于 1.O%凝胶检测酶切是否完全：按2一5步纯化、回收DNA 2.加入ddH20150l(扩大体积)，加入等体积氯仿/异戊醇(24：1)， 颠倒混匀，12000g离心10min: 3.吸取上清，加110体积3 M NaAc和两倍体积无水乙醇，-20℃放置15分 钟以上： 4.12000g4C冷冻离心15分钟： 5.倒去上清，用75%乙醇浸洗沉淀，风干后外源DNA溶于10山l ddH2O (0.5 ml tube中)，PUC18溶于20 ulddH0(1.5 ml tube中)； 6.按以下反应去除载体PUC18的5磷酸基团，50℃反应30min以上 DNA 20 ul CIAP(TaKaRa)0.5μl 10xbuffer 4 0 ul ddH2O 15.5 ul 7.70℃水浴10min,使CIAP失活： 8.按2一5步纯化载体，溶于10lddH0 9.连接反应(15体系)： DNA 10 ul pUC18 2.5 ul 5xbuffer 1.5 ul T4 ligase (3U/ul)1 ul 16℃水浴过夜 10.转化大肠杆菌感受态细胞 11.转化子的鉴定 附注： 根据试验目的和外源片段的不同可选用不同的载体，采用不同粘性末端的双酶切 可实现外源片段的定向克隆 克降中用到的几种工具酶 (1)限制性内切翼 限制性内切酶的一个活性单位(1U)：指在50反应体系中，37℃下，经 过1小时的反应将1gDNA完全切割所需要的酶量。 限制性内切酶的star活性：限制酶在某些条件下使用时，对DNA切割的位点 特异性可能降低，即可以切割与原来识别的特定DNA序列不同的碱基序列， 这种现象叫限制酶的star活性。它的出现与限制酶、底物DNA以及反应条件 有关。 9
基因工程原理实验指导 9 37 ℃反应 1hr ，分别取 8 µl 外源片段酶切产物和 5 µl PUC18 酶切产物于 1.0% 凝胶检测酶切是否完全；按 2 － 5 步纯化、回收 DNA 2．加入 ddH2O 150 µl （扩大体积），加入等体积氯仿 / 异戊醇（ 24:1 ）， 颠倒混匀， 12000g 离心 10 min ； 3．吸取上清，加 1/10 体积 3M NaAc 和两倍体积无水乙醇， -20 ℃放置 15 分 钟以上； 4．12000g 4 ℃冷冻离心 15 分钟； 5．倒去上清，用 75 ％乙醇浸洗沉淀，风干后外源 DNA 溶于 10 µl ddH2O （ 0.5ml tube 中）， PUC18 溶于 20µl ddH2O （ 1.5ml tube 中）； 6．按以下反应去除载体 PUC18 的 5 '磷酸基团， 50 ℃反应 30 min 以上 DNA 20 µl CIAP （ TaKaRa ） 0.5 µl 10×buffer 4.0 µl ddH2O 15.5 µl 7．70 ℃水浴 10 min, 使 CIAP 失活； 8．按 2 － 5 步纯化载体，溶于 10 µl ddH2O ； 9．连接反应（ 15 µl 体系）： DNA 10 µl pUC18 2.5 µl 5×buffer 1.5 µl T4 ligase (3U/ µl) 1 µl 16 ℃水浴过夜 10．转化大肠杆菌感受态细胞 11．转化子的鉴定 附注： 根据试验目的和外源片段的不同可选用不同的载体，采用不同粘性末端的双酶切 可实现外源片段的定向克隆。 克隆中用到的几种工具酶： （ 1 ）限制性内切酶 限制性内切酶的一个活性单位（ 1U ）：指在 50 µl 反应体系中， 37 ℃下，经 过 1 小时的反应将 1µg DNA 完全切割所需要的酶量。 限制性内切酶的 star 活性：限制酶在某些条件下使用时，对 DNA 切割的位点 特异性可能降低，即可以切割与原来识别的特定 DNA 序列不同的碱基序列， 这种现象叫限制酶的 star 活性。它的出现与限制酶、底物 DNA 以及反应条件 有关