安徽农业大学学报（社会科学版）：微生物在防治黄曲霉菌及毒素中的应用

安徽农业大学学报，2017,44(3)：502-507 Journal of Anhui Agricultural University [D0010.13610/j.cnki.1672-352x20170524.009网络出版时间：2017/5/2411：18：51 [URL]http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1162.S.20170524.1118.018.html 微生物在防治黄曲霉菌及毒素中的应用 宫安东2，孔宪巍2，方海宾，王天文12 (1.信阳师范学院生命科学学院，信阳464000：2.信阳师范学院大别山农业生物资源保护与利用研究院，信阳464000) 摘要：黄曲霉菌及其黄曲霉毒素对人类的严重危害是世界性难题，给粮食生产和人类健康带来了极大的损害。 在对黄曲寄菌及毒素的防治研究中，微生物资源已被证明具有高效的抑菌作用。近年来，多种新颖的微生物资源被 筛选和应用于防治田间或储藏期作物黄曲雾病害，取得了高效的应用价值。研究对近期报道的各类功能微生物在防 治田间和储藏期黄曲霉菌及毒素的最新进展进行了综述，微生物通过竞争抑制、拮抗作用、毒素的吸附和降解、储 藏期呼吸抑制、以及新发现的微生物挥发气体抑菌等方式发挥拮抗作用，为田间和储藏期作物的合理防控、食品安 全和人类健康等提供重要的参考依据。 关键词：黄曲雾菌：黄曲霉毒素：生物防治：田间防治：储藏期防治 中图分类号：Q939.95 文献标识码：A 文章编号：1672-352X(2017)03-0502-06 Application of microbes in control of crop Aspergillus flavus and aflatoxins GONG Andong2,KONG Xianwei,FANG Haibin',WANG Tianwen'2 (1.College of Life Sciences,Xinyang Normal University,Xinyang 464000; 2.Institute for Conservation and Utilization of Agro-bioresources in Dabie Mountains,Xinyang Normal University,Xinyang 464000) Abstract:Aflatoxins produced by Aspergillus flavus are hazardous to humans all over the world,causing great damage to crop production and human health.Among the methods used in control of 4.flavus and aflatoxins, microbes have been proven validly and effectively in the field or post-harvest.In this study,we reviewed currently reported microbes which show great biocontrol activity against A.favus and aflatoxins at pre-or post-harvest The biocontrol strategies of these microbes include competitive effect,antagonistic effect,aflatoxins elimination effect,pathogen respiratory depression,and the newfound microbe antifungal volatiles.These methods will pro- vide useful strategies for preventing field and harvested crops from pathogen damage and further keeping food safety and human health. Key words:Aspergillus flavus;aflatoxin:biological control;field control:postharvest control 黄曲霉菌(Aspergillus1amvs)是对人类危害严中国，林强等人检测了不同花生榨油作坊的59份成 重的植物病原真菌，能侵染花生、玉米、水稻、大品油样品，所有样品中AFB1的检出率为100%，超 豆和棉籽等多种重要的粮食和油料作物，并产生高标率达66.1%四。近期媒体报道的蒙牛乳业黄曲霉毒 毒和强致癌性黄曲霉毒素(Aflatoxins,AFT),严重 素M1超标140%事件1、山东进口花生果AFT超标 危害粮食生产和人类健康。20世纪60年代，美国报事件4及广东省检出食用油AFT超标事件等，给人 道的10万只火鸡中毒死亡事件，让人们第一次认识 们的生活和健康带来严重的安全隐患。 到了AFT的严重危害。近年来，随着全球性气候变 AFT是目前已知的毒性最强的霉菌毒素，误食 化、物质交换及人类活动的趋于频繁，黄曲霉菌及 后易引发高烧、呕吐、水肿和黄疸等多种不良反应， 毒素导致的损失愈加严重。在美国佐治亚州每年因 严重时可致急性死亡6。到目前为止，已发现20余 AFT污染导致的花生损失高达2500万美元刊。在 种AFT,以黄曲霉毒素B1(AFB1)毒性最高，达 收稿日期：2016-10-01 基金项目：国家重点基础研究发展计划(2013CB127801),河南省科技攻关计划项目(172102110260)和河南省教有厅科 学技术研究重点项目(16A180036)共同资助。 作者简介：宫安东，博士，副教授。E-mail:gad-123.123@126.com

收稿日期: 2016-10-01 基金项目: 国家重点基础研究发展计划（2013CB127801），河南省科技攻关计划项目（172102110260）和河南省教育厅科 学技术研究重点项目（16A180036）共同资助。 作者简介: 宫安东，博士，副教授。E-mail：gad-123.123@126.com 安徽农业大学学报, 2017, 44(3): 502-507 Journal of Anhui Agricultural University [DOI] 10.13610/j.cnki.1672-352x.20170524.009 网络出版时间：2017/5/24 11:18:51 [URL] http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1162.S.20170524.1118.018.html 微生物在防治黄曲霉菌及毒素中的应用 宫安东 1,2，孔宪巍 2 ，方海宾 1 ，王天文 1,2 (1. 信阳师范学院生命科学学院，信阳 464000；2. 信阳师范学院大别山农业生物资源保护与利用研究院，信阳 464000) 摘 要：黄曲霉菌及其黄曲霉毒素对人类的严重危害是世界性难题，给粮食生产和人类健康带来了极大的损害。 在对黄曲霉菌及毒素的防治研究中，微生物资源已被证明具有高效的抑菌作用。近年来，多种新颖的微生物资源被 筛选和应用于防治田间或储藏期作物黄曲霉病害，取得了高效的应用价值。研究对近期报道的各类功能微生物在防 治田间和储藏期黄曲霉菌及毒素的最新进展进行了综述，微生物通过竞争抑制、拮抗作用、毒素的吸附和降解、储 藏期呼吸抑制、以及新发现的微生物挥发气体抑菌等方式发挥拮抗作用，为田间和储藏期作物的合理防控、食品安 全和人类健康等提供重要的参考依据。 关键词：黄曲霉菌；黄曲霉毒素；生物防治；田间防治；储藏期防治 中图分类号：Q939.95 文献标识码：A 文章编号：1672352X (2017)03050206 Application of microbes in control of crop Aspergillus flavus and aflatoxins GONG Andong1,2, KONG Xianwei2 , FANG Haibin1 , WANG Tianwen1,2 (1. College of Life Sciences, Xinyang Normal University, Xinyang 464000; 2. Institute for Conservation and Utilization of Agro-bioresources in Dabie Mountains, Xinyang Normal University, Xinyang 464000) Abstract: Aflatoxins produced by Aspergillus flavus are hazardous to humans all over the world, causing great damage to crop production and human health. Among the methods used in control of A. flavus and aflatoxins, microbes have been proven validly and effectively in the field or post-harvest. In this study, we reviewed currently reported microbes which show great biocontrol activity against A. flavus and aflatoxins at pre- or post-harvest. The biocontrol strategies of these microbes include competitive effect, antagonistic effect, aflatoxins elimination effect, pathogen respiratory depression, and the newfound microbe antifungal volatiles. These methods will pro￾vide useful strategies for preventing field and harvested crops from pathogen damage and further keeping food safety and human health. Key words: Aspergillus flavus; aflatoxin; biological control; field control; postharvest control 黄曲霉菌（Aspergillus flavus）是对人类危害严 重的植物病原真菌，能侵染花生、玉米、水稻、大 豆和棉籽等多种重要的粮食和油料作物，并产生高 毒和强致癌性黄曲霉毒素（Aflatoxins，AFT），严重 危害粮食生产和人类健康。20 世纪 60 年代，美国报 道的 10 万只火鸡中毒死亡事件，让人们第一次认识 到了 AFT 的严重危害。近年来，随着全球性气候变 化、物质交换及人类活动的趋于频繁，黄曲霉菌及 毒素导致的损失愈加严重。在美国佐治亚州每年因 AFT 污染导致的花生损失高达 2 500 万美元[1]。在 中国，林强等人检测了不同花生榨油作坊的 59 份成 品油样品，所有样品中 AFB1 的检出率为 100%，超 标率达 66.1%[2]。近期媒体报道的蒙牛乳业黄曲霉毒 素 M1 超标 140%事件[3]、山东进口花生果 AFT 超标 事件[4]及广东省检出食用油 AFT 超标事件等[5]，给人 们的生活和健康带来严重的安全隐患。 AFT 是目前已知的毒性最强的霉菌毒素，误食 后易引发高烧、呕吐、水肿和黄疸等多种不良反应， 严重时可致急性死亡[6]。到目前为止，已发现 20 余 种 AFT，以黄曲霉毒素 B1（AFB1）毒性最高，达

44卷3期 宫安东等：微生物在防治黄曲霉菌及毒素中的应用 503 氰化钾的10倍、砒霜的68倍刀。AFB1也是一种 和玉米黄曲霉病害中得到了进一步验证6。在美 强致癌物，易诱发肝癌、肾癌和直肠癌等严重人体 国，有2个非产毒黄曲霉菌剂已获批环境保护组织 病变，是世界卫生组织(WHO)认定的最强致癌物。 (environmental protection agency,EPA)注册证明。 中国每年约有37万人死于肝癌，占世界肝癌死亡人 AF36作为其中之一，从1999年开始，AF36已在 数的50%以上⑧1，发病的原因与AFT的污染具有 美国亚利桑那州和德克萨斯州的玉米种植田地中得 直接相关性。2004年，肯尼亚东部发生严重的AFT 到广泛应用，现已推广到加利福尼亚州的开心果试 中毒事件，造成317人肝脏衰竭病变，125人死亡， 验田中。该菌株不产毒的主要原因是基因组中缺少 死亡原因与食用储藏期污染AFT的粮食作物直接 了毒素合成的关键基因聚酮合成酶PksA,阻碍了 相关。 毒素的产生17。另一个商品化制剂为Afa-Guard, 长期以来，对粮、油作物黄曲霉菌及AFT的防 是由脱壳的大麦包被有不产毒的黄曲霉孢子 治主要依靠抗病育种，化学药剂防治和生物防治等。 NRRL21882组成。该菌株可抑制田间花生中AFT 生物防治作为一种环保、安全的防治手段，在黄曲 的污染，处理种植67d的花生后，毒素污染明显降 霉菌及毒素的防治工作中不断被人们认可。至今为 低。未处理的对照组中AFT含量为516.8ugkg, 止，已报道了多种植物提取物可抑制黄曲霉菌及毒 处理后的毒素量为54.1gkg。经一段时间的储藏 素的危害，如丁香、柠檬草、牛至叶、薄荷、大豆 后再次检测，对照组的毒素含量已高达9145.1 和玉米等9-1。提取自迷迭香(Rosemarinus off- ugkg,处理组的毒素含量为374.2ugkg。表明 cianalis),鼠尾草(Salvia officinalis)和柑橘(Citrus) 该菌株在田间对AFT具有高效的抑制作用，且抑制 中的植物精油已被加工成抑菌剂DMC base Natura, 作用可进一步的延续到储藏期18。Afla-Guard菌剂 提取自肉桂(Cinnamomum zeylandicum)的植物精 已注册可应用于花生和玉米，为先正达公司 油加工成CinnamiteTM菌剂，Rosemarinus officianalis (Syngenta)所持有io。 提取物加工成SporanTM菌剂，以及自百里香 非产毒黄曲霉菌株生防作用的高效应用呈现了 (Th)mus vulgaris)提取物制成的PromaxTM菌剂等， 国际化发展趋势。在非洲，报道的非产毒菌BN30 均为生防杀真菌剂，具有显著的生防效果21。 可抑制玉米AFT的产生1：澳大利亚报道的非产 植物源抑菌物质提取自植物，具有很好的安全 毒菌降低花生AFT量达到95%：在中国，生防 效应和生防前景。然而，由于植物生长周期长，需 菌株AF051,对种植花生的土壤中黄曲霉种群的抑 求面积大，提取繁琐等，在一定程度上制约了其应 制率达99%20。国际化非产毒菌株的筛选和验证， 用和发展。与植物相比，微生物个体微小、结构简 为黄曲霉菌及毒素的控制提供了很好的应用价值。 单、繁殖速度快且代谢迅速，可用于快速产生和富 1.2拮抗作用 集功能代谢物质，具有很好的应用前景和研究价值。 对黄曲霉菌及毒素的防控中，具有拮抗作用的 到目前为止，多种微生物己被成功应用于黄曲霉菌 菌株报道最多27-2)，如芽孢杆菌(Bacillus spp.)、 及毒素的防控工作中。作用方式包括竞争抑制、拮 乳酸杆菌(Lactobacillus sp.)、假单胞菌(Pseudomonas 抗作用、呼吸抑制作用、吸附和脱毒酶降解以及微 sp.)、伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.)、李斯特菌 生物产气抑菌等，为田间和储藏期黄曲霉病害及毒 (Listeria sp.)、链霉菌(Streptomyces sp.)、寡养单 素的安全防控提供了新颖有效的生物资源。 胞菌(Stenotrophomonas sp.)和罗尔斯通菌(Rals1onia 1 微生物抑制黄曲霉菌及毒素的作用机制 sp.)等，均通过产生拮抗代谢产物，抑制黄曲霉菌 的生长和毒素的积累26。 1.1竞争性抑制作用 Yan等2分析了伯克霍尔德菌与致病黄曲霉菌 利用不产毒黄曲霉菌防治作物黄曲霉病害是目 的关系，发现细菌可产生米酵菌酸类代谢产物，进 前应用最广的生防手段，非产毒黄曲霉菌株与产毒 而抑制黄曲霉菌的菌丝生长和孢子产生，最终抑制 菌株的营养状况相同，接种后依靠种群数量和竞争 了AFT的产生。研究同时表明，M3能利用死亡的 优势，占据营养、空间和水分等生态龛位，进而抑 黄曲霉菌丝细胞为营养，供给自身生长需要且不受 制了致病黄曲霉菌的发病和产毒，减少了作物损 毒素损伤，具有很好开发和应用前景。Kumar等Bo 失14.20世纪80年代，该方法首次在温室棉花上 鉴定了蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)对黄曲霉菌 试用，从7个非产毒菌株中筛选到抑菌效果最显著 的抑制作用，在与黄曲霉菌进行共培养时，该菌株 的生防菌株AF36I51。AF36的生防效果在防治花生 可显著抑制黄曲霉菌在花生上的定值和侵染。分析

44 卷 3 期 宫安东等: 微生物在防治黄曲霉菌及毒素中的应用 503 氰化钾的 10 倍、砒霜的 68 倍[7]。AFB1 也是一种 强致癌物，易诱发肝癌、肾癌和直肠癌等严重人体 病变，是世界卫生组织（WHO）认定的最强致癌物。 中国每年约有 37 万人死于肝癌，占世界肝癌死亡人 数的 50％ 以上[8]，发病的原因与 AFT 的污染具有 直接相关性。2004 年，肯尼亚东部发生严重的 AFT 中毒事件，造成 317 人肝脏衰竭病变，125 人死亡， 死亡原因与食用储藏期污染 AFT 的粮食作物直接 相关。 长期以来，对粮、油作物黄曲霉菌及 AFT 的防 治主要依靠抗病育种，化学药剂防治和生物防治等。 生物防治作为一种环保、安全的防治手段，在黄曲 霉菌及毒素的防治工作中不断被人们认可。至今为 止，已报道了多种植物提取物可抑制黄曲霉菌及毒 素的危害，如丁香、柠檬草、牛至叶、薄荷、大豆 和玉米等 [9-11]。提取自迷迭香（Rosemarinus offi￾cianalis），鼠尾草（Salvia officinalis）和 柑橘（Citrus） 中的植物精油已被加工成抑菌剂 DMC base Natura， 提取自肉桂（Cinnamomum zeylandicum）的植物精 油加工成 Cinnamite™菌剂，Rosemarinus officianalis 提取物加工成 Sporan™ 菌剂，以及自百里香 （Thymus vulgaris）提取物制成的 Promax™菌剂等， 均为生防杀真菌剂，具有显著的生防效果[12-13]。 植物源抑菌物质提取自植物，具有很好的安全 效应和生防前景。然而，由于植物生长周期长，需 求面积大，提取繁琐等，在一定程度上制约了其应 用和发展。与植物相比，微生物个体微小、结构简 单、繁殖速度快且代谢迅速，可用于快速产生和富 集功能代谢物质，具有很好的应用前景和研究价值。 到目前为止，多种微生物已被成功应用于黄曲霉菌 及毒素的防控工作中。作用方式包括竞争抑制、拮 抗作用、呼吸抑制作用、吸附和脱毒酶降解以及微 生物产气抑菌等，为田间和储藏期黄曲霉病害及毒 素的安全防控提供了新颖有效的生物资源。 1 微生物抑制黄曲霉菌及毒素的作用机制 1.1 竞争性抑制作用 利用不产毒黄曲霉菌防治作物黄曲霉病害是目 前应用最广的生防手段，非产毒黄曲霉菌株与产毒 菌株的营养状况相同，接种后依靠种群数量和竞争 优势，占据营养、空间和水分等生态龛位，进而抑 制了致病黄曲霉菌的发病和产毒，减少了作物损 失[14]。20 世纪 80 年代，该方法首次在温室棉花上 试用，从 7 个非产毒菌株中筛选到抑菌效果最显著 的生防菌株 AF36[15]。AF36 的生防效果在防治花生 和玉米黄曲霉病害中得到了进一步验证[16]。在美 国，有 2 个非产毒黄曲霉菌剂已获批环境保护组织 （environmental protection agency，EPA) 注册证明。 AF36 作为其中之一，从 1999 年开始，AF36 已在 美国亚利桑那州和德克萨斯州的玉米种植田地中得 到广泛应用，现已推广到加利福尼亚州的开心果试 验田中。该菌株不产毒的主要原因是基因组中缺少 了毒素合成的关键基因聚酮合成酶 pksA，阻碍了 毒素的产生[17]。另一个商品化制剂为 Afla-Guard， 是由脱壳的大麦包被有不产毒的黄曲霉孢子 NRRL21882 组成。该菌株可抑制田间花生中 AFT 的污染，处理种植 67 d 的花生后，毒素污染明显降 低。未处理的对照组中 AFT 含量为 516.8 µg·kg-1， 处理后的毒素量为 54.1 µg·kg-1。经一段时间的储藏 后再次检测，对照组的毒素含量已高达 9 145.1 µg·kg-1，处理组的毒素含量为 374.2 µg·kg-1。表明 该菌株在田间对 AFT 具有高效的抑制作用，且抑制 作用可进一步的延续到储藏期[18]。Afla-Guard 菌剂 已注册可应用于花生和玉米，为先正达公司 （Syngenta）所持有[16]。 非产毒黄曲霉菌株生防作用的高效应用呈现了 国际化发展趋势。在非洲，报道的非产毒菌 BN30 可抑制玉米 AFT 的产生 [19]；澳大利亚报道的非产 毒菌降低花生 AFT 量达到 95% [11]；在中国，生防 菌株 AF051，对种植花生的土壤中黄曲霉种群的抑 制率达 99% [20]。国际化非产毒菌株的筛选和验证， 为黄曲霉菌及毒素的控制提供了很好的应用价值。 1.2 拮抗作用 对黄曲霉菌及毒素的防控中，具有拮抗作用的 菌株报道最多[27-28]，如芽孢杆菌（Bacillus spp.）、 乳酸杆菌(Lactobacillus sp.)、假单胞菌(Pseudomonas sp.）、伯克霍尔德菌（Burkholderia sp.）、李斯特菌 （Listeria sp.）、链霉菌（Streptomyces sp.）、寡养单 胞菌(Stenotrophomonas sp.）和罗尔斯通菌（Ralstonia sp.）等，均通过产生拮抗代谢产物，抑制黄曲霉菌 的生长和毒素的积累[26]。 Yan 等[29]分析了伯克霍尔德菌与致病黄曲霉菌 的关系，发现细菌可产生米酵菌酸类代谢产物，进 而抑制黄曲霉菌的菌丝生长和孢子产生，最终抑制 了 AFT 的产生。研究同时表明，M3 能利用死亡的 黄曲霉菌丝细胞为营养，供给自身生长需要且不受 毒素损伤，具有很好开发和应用前景。Kumar 等[30] 鉴定了蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus）对黄曲霉菌 的抑制作用，在与黄曲霉菌进行共培养时，该菌株 可显著抑制黄曲霉菌在花生上的定值和侵染。分析

504 安徽农业大学学报 2017年 其代谢物质发现，该菌株可产环缩二胺酸类物质， 浓度高于200μgmL时仅呈现弱毒性，低浓度下对 抑制黄曲霉菌的发病和产毒。同时，该类物质对另 细胞无毒害。该类物质的发现为黄曲霉菌及毒素的 外5株黄曲霉菌具有广谱抑制作用，其最低抑菌浓 防控，新型天然代谢产物的开发和应用提供了重要 度低至2μgmL。且该物质对动物细胞危害弱， 依据。 表1已报道的具有生防作用的非产毒黄曲霉菌株 Table 1 The effective non-toxigenic A.flavus strains used nowdays 作物 非产毒黄曲霉 毒素抑制率% 参考文献 Crop Non-toxigenic strain Reduction rate Reference 玉米 K49 83-98 [21-22] Maize Afla-guard 975 [22-231 GZ-15 17-50 [24] WF-5 52-76 [24 WF-20 31-75 [24 JZ-2 13-34 [24 YC-8 37-53 [24 花生 AFCHG2 75 [25] Peanut AR27.AR100G 78-89 [26 GZ-15 55-75 [24] WF-5 11~50 [24 WF-20 15-83 [24 JZ-2 11~38 [24 YC-8 14~53 [24 NRRL 21882/NRRL 21369 93-97 [18 棉花Cotton AF36 20-88 [22] 为研究微生物抑制AF产生的作用机制， 于储藏期植物病害的防治。迄今为止，多种微生物 Verheecke等B分析了链霉菌与黄曲霉菌的互做关 源挥发性气体被证明可抑制储藏期病害29,34。针对 系，表明链霉菌抑制曲霉菌产毒的主要原因是因为 储藏期黄曲霉菌及毒素的防治中，产气菌株的开发 其干扰了曲霉菌细胞多个关键产毒基因的表达 和应用研究仍然较少，到目前为止，仅有1株细菌 (afD,aM,afP,afR,aS),其中以基因aS, 被证明可产挥发性气体物质，防治储藏期黄曲霉菌 aR和aM的表达受抑制最为明显，研究结构同 及毒素。 时显示，aM基因的表达水平与AFB1的产量呈正 Gong等28以海洋微生物为筛选材料，筛选到 相关，可作为监测AFB1污染程度的潜在标记。Kong 一株产气海藻希瓦氏菌YM8。该菌株可产生挥发性 等2筛选到对黄曲霉菌具有生防活性的海洋巨大 抑菌物质，抑制黄曲霉菌的菌丝生长和孢子萌发， 芽孢杆菌(Bacillus megaterium),该菌株同样可抑 抑菌效果显著。在花生和玉米的储藏试验中(3种 制黄曲霉菌产毒基因aS和aR的表达，降低了 水活度)，YM8菌株产生的挥发性物质，可抑制黄 储藏期AFT的危害。Cho等B]分离得到一株细菌 曲霉菌的发病和毒素的产生，抑菌率均达到100%。 Bacillus pumilus HY1,可抑制黄曲霉菌的生长和产 经透射电镜试验表明，该菌株可作用于黄曲霉孢子 毒。经检测发现，该菌株可产生具有广谱抑菌效果 的细胞壁，导致细胞皱缩，丧失侵染和产毒能力。 的依枯草菌素，该物质为脂肽类物质，具有环状多 进一步的验证表明，YM8菌株产生的挥发性气体具 肽和长链脂肪酸结构，通过与真菌细胞膜中的甾醇 有广谱抑菌效果，可抑制9种不同的病原真菌生长。 类物质发生相互作用，导致真菌细胞膜破裂和内容 采用SPME-GC-MS鉴定产生的挥发性物质，确定 物流失，致使真菌细胞裂解和死亡，从而抑制了黄 YM8菌株可产生多种物质，以二甲基三硫的丰度最 曲霉菌的生长和产毒，因而具有很好的生防活性和 高。经验证表明，二甲基三硫抑菌效果显著， 应用前景。 200ugL(物质重量/储藏空间)浓度下，可完全 1.3挥发性气体抑菌 抑制黄曲霉菌侵染花生，对产毒的抑制率达到 微生物产生的挥发性气体抑菌机制新颖，可用 100%。YM8菌株及产生的二甲基三硫均体现出显

504 安 徽 农 业 大 学 学 报 2017 年 其代谢物质发现，该菌株可产环缩二胺酸类物质， 抑制黄曲霉菌的发病和产毒。同时，该类物质对另 外 5 株黄曲霉菌具有广谱抑制作用，其最低抑菌浓 度低至 2 µg·mL-1。且该物质对动物细胞危害弱， 浓度高于 200 µg·mL-1 时仅呈现弱毒性，低浓度下对 细胞无毒害。该类物质的发现为黄曲霉菌及毒素的 防控，新型天然代谢产物的开发和应用提供了重要 依据。 表 1 已报道的具有生防作用的非产毒黄曲霉菌株 Table 1 The effective non-toxigenic A. flavus strains used nowdays 作物 Crop 非产毒黄曲霉 Non-toxigenic strain 毒素抑制率/% Reduction rate 参考文献 Reference 玉米 K49 83～98 [21-22] Maize Afla-guard 9～75 [22-23] GZ-15 17～50 [24] WF-5 52～76 [24] WF-20 31～75 [24] JZ-2 13～34 [24] YC-8 37～53 [24] 花生 AFCHG2 75 [25] Peanut AR27, AR100G 78～89 [26] GZ-15 55～75 [24] WF-5 11～50 [24] WF-20 15～83 [24] JZ-2 11～38 [24] YC-8 14～53 [24] NRRL 21882/ NRRL 21369 93～97 [18] 棉花 Cotton AF36 20～88 [22] 为研究微生物抑制 AF 产生的作用机制， Verheecke 等[31]分析了链霉菌与黄曲霉菌的互做关 系，表明链霉菌抑制曲霉菌产毒的主要原因是因为 其干扰了曲霉菌细胞多个关键产毒基因的表达 （aflD，aflM，aflP，aflR，aflS），其中以基因 aflS， aflR 和 aflM 的表达受抑制最为明显，研究结构同 时显示，aflM 基因的表达水平与 AFB1 的产量呈正 相关，可作为监测 AFB1 污染程度的潜在标记。Kong 等[32]筛选到对黄曲霉菌具有生防活性的海洋巨大 芽孢杆菌（Bacillus megaterium），该菌株同样可抑 制黄曲霉菌产毒基因 aflS 和 aflR 的表达，降低了 储藏期 AFT 的危害。Cho 等[33]分离得到一株细菌 Bacillus pumilus HY1，可抑制黄曲霉菌的生长和产 毒。经检测发现，该菌株可产生具有广谱抑菌效果 的依枯草菌素，该物质为脂肽类物质，具有环状多 肽和长链脂肪酸结构，通过与真菌细胞膜中的甾醇 类物质发生相互作用，导致真菌细胞膜破裂和内容 物流失，致使真菌细胞裂解和死亡，从而抑制了黄 曲霉菌的生长和产毒，因而具有很好的生防活性和 应用前景。 1.3 挥发性气体抑菌 微生物产生的挥发性气体抑菌机制新颖，可用 于储藏期植物病害的防治。迄今为止，多种微生物 源挥发性气体被证明可抑制储藏期病害 [29,34]。针对 储藏期黄曲霉菌及毒素的防治中，产气菌株的开发 和应用研究仍然较少，到目前为止，仅有 1 株细菌 被证明可产挥发性气体物质，防治储藏期黄曲霉菌 及毒素。 Gong 等[28]以海洋微生物为筛选材料，筛选到 一株产气海藻希瓦氏菌 YM8。该菌株可产生挥发性 抑菌物质，抑制黄曲霉菌的菌丝生长和孢子萌发， 抑菌效果显著。在花生和玉米的储藏试验中（3 种 水活度），YM8 菌株产生的挥发性物质，可抑制黄 曲霉菌的发病和毒素的产生，抑菌率均达到 100%。 经透射电镜试验表明，该菌株可作用于黄曲霉孢子 的细胞壁，导致细胞皱缩，丧失侵染和产毒能力。 进一步的验证表明，YM8 菌株产生的挥发性气体具 有广谱抑菌效果，可抑制 9 种不同的病原真菌生长。 采用 SPME-GC-MS 鉴定产生的挥发性物质，确定 YM8 菌株可产生多种物质，以二甲基三硫的丰度最 高。经验证表明，二甲基三硫抑菌效果显著， 200 µg·L-1（物质重量/储藏空间）浓度下，可完全 抑制黄曲霉菌侵染花生，对产毒的抑制率达到 100%。YM8 菌株及产生的二甲基三硫均体现出显

44卷3期 宫安东等：微生物在防治黄曲霉菌及毒素中的应用 505 著的生防效果，不仅对于储藏期植物病害，而且对 程菌，提高了该酶的表达效率和毒素降解能力。为 于田间土传病害，均具有很好的应用前景。 进一步增强酶活力，研究人员运用易错PC℉技术， 1.4毒素吸附和降解 构建ADTZ突变体，检测突变体解毒酶活性及其对 田间和储藏期作物污染的AFT危害人类健康 高温和低pH值的耐受性。经过多轮筛选，获得了 且难于清楚，毒素的减持始终是生防领域研究的热 可耐70℃高温的突变酶A1773,在酸性(pH4.0) 点。通过微生物脱毒作用，可降低毒素污染、保障 条件下活力稳定的突变酶A1476,提高了ADTZ酶 粮食品质、减少经济损失，到目前为止多种脱毒微 的耐受性和稳定性。分析表明，突变子的酶活力与 生物已被筛选应用，如假密环菌(Armillariella 野生菌相比，分别提高了6.5倍和21倍，脱毒活性 tabescens)[B,酿酒酵母菌(Saccharomyces cere- 明显提高4。 visiae)[B6,芽孢杆菌(Bacillus spp)B7和干酪乳杆 菌(Lactobacillus casei)B8等，为AFT的减持提供 2讨论 重要资源。 生物资源的开发和利用，极大地丰富了黄曲霉 酵母菌作为高效的生防菌株，在AFT的减持研 病害控制的可用资源，为AFT的减持提供了有利的 究中作用显著。刘畅等9研究发现，酿酒酵母菌 保障。部分生防菌株已经成功的运用到田间作物黄 Y1可通过物理结合的方式吸附AFB1,进而减少食 曲霉及毒素的防控研究，成果显著。如非产毒黄曲 品中AFB1含量，菌株Y1对AFB1的吸附率可达 霉菌株，目前已加工成商品化制剂，在全球范围内 81.16%,且该结合反应是可逆性，脱附后可重复应 使用。但微生物制剂的生防研究尚处于起步阶段， 用，提升了菌株Y1的应用性。除简单的吸附作用 尚有部分暂时无法解决的应用和研究难题，需要不 外，Biernasiak等4o证明，酿酒酵母具有降解AFB 断的尝试创新，如非产毒黄曲霉菌的对生物多样性 的能力，在大麦、小麦和玉米粉的混合发酵试验中， 的影响，对作物品质的潜在作用等。另外，微生物 酿酒酵母菌能有效地降低AFB1、B2、G1和G2的 的生防效果受环境因素影响严重，多数菌剂仅在温 含量，降解率达到30%以上，减少粮食和饲料中毒 和或可控环境条件下对黄曲霉菌或毒素具有显著效 素残留。 果，当田间环境变化较大时（多雨、干旱），生防效 乳酸杆菌为人体肠道中常见的有益微生物，可 果愈加难以保证。随着生物技术的不断发展，尤其 调节人体微环境，促进人体代谢平衡，对人类健康 是新一代高通量测序技术的推广普及，基因组学、 具有重要意义。Hamidi等分别从人体粪便和鲜 转录组学、蛋白组学和代谢组学以及多组学关联分 奶中分离得到乳酸菌Lactobacillus pentosus和 析等为研究微生物抑菌作用以及彼此之间的互作关 Lactobacillus beveris,与AFB1共培养后，使用 系提供了重要途径，确定了生防菌的抑菌和应用机 ELISA法检测溶液中毒素残留量，Lactobacillus 理，为优势生防资源的开发和利用提供了重要手段， pentosus和Lactobacillus beveris对PBS溶液 极大的促进了生物防治技术的研究和推广。 (AFB1初始质量浓度为2mgL)中的AFB1结 从粮食长期储藏而言，储藏期黄曲霉菌及毒素 合率分别为17.4%和34.7%，证实这2株乳酸菌均 的危害被人类所忽视，造成了严重的粮食污染和健 具有一定的毒素结合能力。此外，AFB1-乳酸菌可 康损伤。近年来，随人类对健康重视程度的不断增 形成复合物，降低了AFB1对人体的危害，且复合 强，以及储藏期AFT的危害逐渐加大，储藏期作物 物比AFB1更容易排出体外，减少AFB1在人体内 黄曲霉菌及AFT的防控开始被人们所重视4阿。黄曲 的累积量2。Roger等3l筛选功能乳酸杆菌并分析 霉菌孢子小、易传播，AFT危害严重，在今后很长 其在发酵玉米面团上对黄曲霉菌及AFB1的抑制效 的一段时间内，储藏期粮油黄曲霉菌及毒素的安全 果。证明有3株乳酸杆菌可抑制面团上黄曲霉菌的 防控将是生防领域研究的重点。多种新技术的研究 生长，抑制率达到100%，且该3株菌株兼具备降 和推广，促进了病害的安全防控和本领域的快速发 解AFB1作用，降解效率可高达64.2%，具有很好 展。生物药剂的研发满足了绿色环保的生物需求， 的应用前景。 为生物资源的发展提供了有利的保障。 刘大岭教授课题组从假密环菌(Armillariella 参考文献： sp.)获取了AFT脱毒酶(Aflatoxin--detoxiczyme, ADTZ),将样品中的AFB1含量降低80%B。目前 [1]AMAIKE S,KELLER N P.Aspergillus flavus [J].Annu Rev Phytopathol,2011,49:107-133. 课题组已克隆该酶的编码基因，并转化毕赤酵母工 2]林强，方黎剑，陈伟，等。个体榨油作坊花生油产品黄

44 卷 3 期 宫安东等: 微生物在防治黄曲霉菌及毒素中的应用 505 著的生防效果，不仅对于储藏期植物病害，而且对 于田间土传病害，均具有很好的应用前景。 1.4 毒素吸附和降解 田间和储藏期作物污染的 AFT 危害人类健康 且难于清楚，毒素的减持始终是生防领域研究的热 点。通过微生物脱毒作用，可降低毒素污染、保障 粮食品质、减少经济损失，到目前为止多种脱毒微 生物已被筛选应用，如假密环菌（Armillariella tabescens）[35]，酿酒酵母菌（Saccharomyces cere￾visiae）[36]，芽孢杆菌（Bacillus spp）[37]和干酪乳杆 菌（Lactobacillus casei）[38]等，为 AFT 的减持提供 重要资源。 酵母菌作为高效的生防菌株，在 AFT 的减持研 究中作用显著。刘畅等[39]研究发现，酿酒酵母菌 Y1 可通过物理结合的方式吸附 AFB1，进而减少食 品中 AFB1 含量，菌株 Y1 对 AFB1 的吸附率可达 81.16%，且该结合反应是可逆性，脱附后可重复应 用，提升了菌株 Y1 的应用性。除简单的吸附作用 外，Biernasiak 等[40]证明，酿酒酵母具有降解 AFB 的能力，在大麦、小麦和玉米粉的混合发酵试验中， 酿酒酵母菌能有效地降低 AFB1、B2、G1 和 G2 的 含量，降解率达到 30%以上，减少粮食和饲料中毒 素残留。 乳酸杆菌为人体肠道中常见的有益微生物，可 调节人体微环境，促进人体代谢平衡，对人类健康 具有重要意义。Hamidi 等 [41]分别从人体粪便和鲜 奶中分离得到乳酸菌 Lactobacillus pentosus 和 Lactobacillus beveris，与 AFB1 共培养后，使用 ELISA 法检测溶液中毒素残留量，Lactobacillus pentosus 和 Lactobacillus beveris 对 PBS 溶 液 （AFB1 初始质量浓度为 2 mg·L-1）中的 AFB1 结 合率分别为 17.4%和 34.7%，证实这 2 株乳酸菌均 具有一定的毒素结合能力。此外，AFB1-乳酸菌可 形成复合物，降低了 AFB1 对人体的危害，且复合 物比 AFB1 更容易排出体外，减少 AFB1 在人体内 的累积量[42]。Roger 等 [43]筛选功能乳酸杆菌并分析 其在发酵玉米面团上对黄曲霉菌及 AFB1 的抑制效 果。证明有 3 株乳酸杆菌可抑制面团上黄曲霉菌的 生长，抑制率达到 100%，且该 3 株菌株兼具备降 解 AFB1 作用，降解效率可高达 64.2%，具有很好 的应用前景。 刘大岭教授课题组从假密环菌（Armillariella sp.）获取了 AFT 脱毒酶（Aflatoxin-detoxiczyme， ADTZ），将样品中的 AFB1 含量降低 80%[35]。目前 课题组已克隆该酶的编码基因，并转化毕赤酵母工 程菌，提高了该酶的表达效率和毒素降解能力。为 进一步增强酶活力，研究人员运用易错 PCR 技术， 构建 ADTZ 突变体，检测突变体解毒酶活性及其对 高温和低 pH 值的耐受性。经过多轮筛选，获得了 可耐 70℃高温的突变酶 A1773，在酸性（pH 4.0） 条件下活力稳定的突变酶 A1476，提高了 ADTZ 酶 的耐受性和稳定性。分析表明，突变子的酶活力与 野生菌相比，分别提高了 6.5 倍和 21 倍，脱毒活性 明显提高[44]。 2 讨论 生物资源的开发和利用，极大地丰富了黄曲霉 病害控制的可用资源，为 AFT 的减持提供了有利的 保障。部分生防菌株已经成功的运用到田间作物黄 曲霉及毒素的防控研究，成果显著。如非产毒黄曲 霉菌株，目前已加工成商品化制剂，在全球范围内 使用。但微生物制剂的生防研究尚处于起步阶段， 尚有部分暂时无法解决的应用和研究难题，需要不 断的尝试创新，如非产毒黄曲霉菌的对生物多样性 的影响，对作物品质的潜在作用等。另外，微生物 的生防效果受环境因素影响严重，多数菌剂仅在温 和或可控环境条件下对黄曲霉菌或毒素具有显著效 果，当田间环境变化较大时（多雨、干旱），生防效 果愈加难以保证。随着生物技术的不断发展，尤其 是新一代高通量测序技术的推广普及，基因组学、 转录组学、蛋白组学和代谢组学以及多组学关联分 析等为研究微生物抑菌作用以及彼此之间的互作关 系提供了重要途径，确定了生防菌的抑菌和应用机 理，为优势生防资源的开发和利用提供了重要手段， 极大的促进了生物防治技术的研究和推广。 从粮食长期储藏而言，储藏期黄曲霉菌及毒素 的危害被人类所忽视，造成了严重的粮食污染和健 康损伤。近年来，随人类对健康重视程度的不断增 强，以及储藏期 AFT 的危害逐渐加大，储藏期作物 黄曲霉菌及 AFT 的防控开始被人们所重视[45]。黄曲 霉菌孢子小、易传播，AFT 危害严重，在今后很长 的一段时间内，储藏期粮油黄曲霉菌及毒素的安全 防控将是生防领域研究的重点。多种新技术的研究 和推广，促进了病害的安全防控和本领域的快速发 展。生物药剂的研发满足了绿色环保的生物需求， 为生物资源的发展提供了有利的保障。 参考文献： [1] AMAIKE S, KELLER N P. Aspergillus flavus [J]. Annu Rev Phytopathol, 2011, 49: 107-133. [2] 林强, 方黎剑, 陈伟, 等. 个体榨油作坊花生油产品黄

506 安徽农业大学学报 2017年 曲霉毒素B1污染情况分析.华南预防医学，2004， toxigenic strains of Aspergillus flavus and A.parasiticus 30(5):38-38 on subsequent aflatoxin contamination of peanuts in stor- [3】李静，廖爱玲.蒙牛纯牛奶被检出强致癌物黄曲霉毒素 age [J].J Stored Prod Res,2002,38:329-339. [N/OL].新京报，201l-l2-26.http:/hews.sciencenet.cn/ [19]CARDWELL K F,HENRY S H.Risk of exposure to and htmlnews/2011/12/257542.shtm. mitigation of effect of aflatoxin on human health:A West [4蓝宇.中粮进口花生仁黄曲霉毒素超标已作退货处理 African example [J].J Toxicol Toxin Rev,2004,23(2/3): 217-247. [EB/OLl.2012-02-10.http://money.163.com/12/0210/10/ [20]DONNER M.ATEHNKENG J.SIKORA R A.et al.Mo- 7PT5CSKO00253BOH.html#from=keyscan. [⑤]施诗，李能忠.广东三食用油厂因黄曲霉毒素超标停 lecular characterization of atoxigenic strains for biological control of aflatoxins in Nigeria [J].Food Addit Contam 产N/OLJ.金融时报，2011-12-29.http:/money.163.com 2010,27(5):576-590. 11/1229/07/7ME3VOAE00252603.html#from=keyscan. [21]ABBAS H K,ZABLOTOWICZ R M,HORN B W,et al. 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