实验一 动物细胞培养 细胞培养是用无菌操作的方法将动物体内的组织(或器官)取出，模拟动物体内的生理条 件，在体外进行培养．使其不断地生长、繁殖，人们借以观察细胞的生长、繁殖、细胞分化 以及细胞衰老等过程的生命现象。 细胞培养的突出优点，一是便于研究各种物理、化学等外界因素对细胞生长发育和分化 等的影响；二是细胞培养便于人们对细胞内结构(如细胞骨架等)、细胞生长及发育等过程的 观察。因而细胞培养是探索和指示细胞生命活动规律的—种简便易行的实验技术，同时我们 也不可忽略的另一个因素，那就是它脱离乐生物机体后的—些变化。 细胞培养技术目前已广泛地被应用于生物学的各个领域。如分子生物学、细胞生物学、 遗传学、免疫学、肿痛学及病毒学等 为此有必要使学生在细胞培养方面得到一些初步的感性知识，了解动物细胞培养的基本 操作过程，观察体外培养细胞的生长特征，对原代细胞与传代细胞有一个基本概念。 本实验分两次进行．即清洗与消毒和传代细胞的培养与观察。 Ⅰ清洗与灭菌 一、实验目的 能独立地进行用于细胞培养的各种器皿的清洗与消毒，掌握干热灭菌法、湿热灭菌法和 滤过除菌法的操作，了解化学消毒法的使用方法。 二、实验原理 清洗与消毒是组织培养实验的第一步，是组织培养中工作量最大，也是最基本的步骤。 体外培养细胞所使用的各种玻璃或塑料器皿对清洁和无菌的要求程度很高。细胞养不好与清 洗不彻底有很大关系。清洗后的玻璃器皿，不仅要求干净透明，无油迹，而且不能残留任何 物质。如有毒的化学物质，哪怕残留 0．1 个，也可能影响细胞生长。灭菌手段的选择十分 重要，对不同的物品需采用不同的灭菌方法。假如选用的方法不对，即使达到了无菌却使被 灭菌药品丧失了营养价值、生物学特性或其他使用价值也不行。以下在每种灭菌步骤中都介 绍其使用范围。 三、实验材料、用品
实验一 动物细胞培养 细胞培养是用无菌操作的方法将动物体内的组织(或器官)取出，模拟动物体内的生理条 件，在体外进行培养．使其不断地生长、繁殖，人们借以观察细胞的生长、繁殖、细胞分化 以及细胞衰老等过程的生命现象。 细胞培养的突出优点，一是便于研究各种物理、化学等外界因素对细胞生长发育和分化 等的影响；二是细胞培养便于人们对细胞内结构(如细胞骨架等)、细胞生长及发育等过程的 观察。因而细胞培养是探索和指示细胞生命活动规律的—种简便易行的实验技术，同时我们 也不可忽略的另一个因素，那就是它脱离乐生物机体后的—些变化。 细胞培养技术目前已广泛地被应用于生物学的各个领域。如分子生物学、细胞生物学、 遗传学、免疫学、肿痛学及病毒学等 为此有必要使学生在细胞培养方面得到一些初步的感性知识，了解动物细胞培养的基本 操作过程，观察体外培养细胞的生长特征，对原代细胞与传代细胞有一个基本概念。 本实验分两次进行．即清洗与消毒和传代细胞的培养与观察。 Ⅰ清洗与灭菌 一、实验目的 能独立地进行用于细胞培养的各种器皿的清洗与消毒，掌握干热灭菌法、湿热灭菌法和 滤过除菌法的操作，了解化学消毒法的使用方法。 二、实验原理 清洗与消毒是组织培养实验的第一步，是组织培养中工作量最大，也是最基本的步骤。 体外培养细胞所使用的各种玻璃或塑料器皿对清洁和无菌的要求程度很高。细胞养不好与清 洗不彻底有很大关系。清洗后的玻璃器皿，不仅要求干净透明，无油迹，而且不能残留任何 物质。如有毒的化学物质，哪怕残留 0．1 个，也可能影响细胞生长。灭菌手段的选择十分 重要，对不同的物品需采用不同的灭菌方法。假如选用的方法不对，即使达到了无菌却使被 灭菌药品丧失了营养价值、生物学特性或其他使用价值也不行。以下在每种灭菌步骤中都介 绍其使用范围。 三、实验材料、用品
材料：无臭氧型紫外灯，微孔滤膜(直径 25)：孔径为 0．22μm，微孔滤膜(直径 90)：孔径 为 0．22 μm，过滤器(直径 25)。 药品：70％或 75％酒精，0．1％新洁尔灭，煤酚皂溶液(来苏儿水)，0．5％过氧乙酸，乳 酸，37％甲醛，高锰酸钾，NaOH，盐酸，重铬酸钾，浓硫酸(工业)，DEPC 水[体积分数 0．1％ 的焦炭酸二乙酯(diethylpyroearbonate)]。 仪器：超净台，干燥箱，高压锅，过滤器，过滤泵。 四、实验步骤 (一)清洗 1．新玻璃器皿的清洗先用自来水刷洗，再浸泡 5％稀盐酸以中和玻璃表面的碱性物质和其 他有害物质。 2．使用过的玻璃器皿的清洗 (1)使用过的培养用品应立即浸入清水，避免干涸难洗。 (2)用洗涤剂清洗玻璃器皿，自来水清洗数遍，倒置自然干燥。 (3)浸酸性洗液过夜。 (4)从酸性洗液捞出后自来水冲洗 10．15 次去除残余酸液，蒸馏水涮洗 3 次，倒置烘干。 (5)包装(牛皮纸或一般纸)。 (6)高压(15 磅 20 min)或干热(170℃2 h)灭菌。 (7)贮存备用。 3．胶塞的处理 (1)新胶塞应先用清水清洗之后再用 0．2％NaOH 煮沸 lO-20 min。 (2)自来水清洗 10 次。 (3)再用 1％稀盐酸浸泡 30 min
材料：无臭氧型紫外灯，微孔滤膜(直径 25)：孔径为 0．22μm，微孔滤膜(直径 90)：孔径 为 0．22 μm，过滤器(直径 25)。 药品：70％或 75％酒精，0．1％新洁尔灭，煤酚皂溶液(来苏儿水)，0．5％过氧乙酸，乳 酸，37％甲醛，高锰酸钾，NaOH，盐酸，重铬酸钾，浓硫酸(工业)，DEPC 水[体积分数 0．1％ 的焦炭酸二乙酯(diethylpyroearbonate)]。 仪器：超净台，干燥箱，高压锅，过滤器，过滤泵。 四、实验步骤 (一)清洗 1．新玻璃器皿的清洗先用自来水刷洗，再浸泡 5％稀盐酸以中和玻璃表面的碱性物质和其 他有害物质。 2．使用过的玻璃器皿的清洗 (1)使用过的培养用品应立即浸入清水，避免干涸难洗。 (2)用洗涤剂清洗玻璃器皿，自来水清洗数遍，倒置自然干燥。 (3)浸酸性洗液过夜。 (4)从酸性洗液捞出后自来水冲洗 10．15 次去除残余酸液，蒸馏水涮洗 3 次，倒置烘干。 (5)包装(牛皮纸或一般纸)。 (6)高压(15 磅 20 min)或干热(170℃2 h)灭菌。 (7)贮存备用。 3．胶塞的处理 (1)新胶塞应先用清水清洗之后再用 0．2％NaOH 煮沸 lO-20 min。 (2)自来水清洗 10 次。 (3)再用 1％稀盐酸浸泡 30 min
(4)自来水清洗 10 次，蒸馏水涮洗 3 次。晾干，高压灭菌(见(二)消毒与灭菌)。旧胶塞不必 用酸碱处理可直接用洗涤剂煮沸和清洗数次，过蒸馏水，晾干，包装并高压灭菌后，便可使 用。 （二）消毒 1．物理消毒法 (1)紫外线消毒 用于消毒空气、操作台面和一些不能用干热、湿热灭菌的培养器皿，如塑料 培养皿、培养板等。这是常使用的消毒方法之一。 (2)干热灭菌 主要用于玻璃器皿的灭菌。将用于细胞培养的器皿放人干燥箱内，加热至 160℃，保温 90－120 min。用于 RNA 提取实验的用品则需 180℃，保温 5－8 h。 (3)湿热灭菌 此方法也称为高压蒸汽灭菌，是最有效的一种灭菌方法。主要应用范围是布类、 橡胶制品(如胶塞)、金属器械、玻璃器皿、某些塑料制品以及加热后不发生沉淀的无机溶液 (如 Hanks 液、PBS、20×SSC 等)。手动高压灭菌锅操作如下： ①首先查看高压锅内的水是否充足，放人物品盖好盖。 ②加热高压锅。将放气阀打开，放气 5—10 min，以排除锅内的冷空气。 ③待锅内水沸腾后，落下放气阀继续升温升压，玻璃器皿等用 15 磅(121℃)30 min，胶塞、 塑料制品、溶液等可用 10 磅(115 ℃)20 min。调节火力大小保持该压力。 ④停止加热，待压力自然下降至 0 再打开放气阀排汽，开盖，取出高压灭菌的物品烘干。 电热自动灭菌锅使用说明(型号：SANYO Autoclave MLS-3020)： ①放气筒加水至 LOW 水平线处，将与高压锅相连的导气管插入放气筒里，然后将放气筒归于 原位。 ②打开高压锅盖，加入蒸馏水至高压锅底的水位线，水位线位于 V 型凹槽的 1／3－2／3 处。 ③打开电源。 ④设定高压温度及时间，高压锅的温度范围为 105－121℃，高压灭菌一般采用 121℃20—30 min。 ⑤把待高压的物品置于高压锅内，顺时针方向将 exhaust 钮旋至 close 位置
(4)自来水清洗 10 次，蒸馏水涮洗 3 次。晾干，高压灭菌(见(二)消毒与灭菌)。旧胶塞不必 用酸碱处理可直接用洗涤剂煮沸和清洗数次，过蒸馏水，晾干，包装并高压灭菌后，便可使 用。 （二）消毒 1．物理消毒法 (1)紫外线消毒 用于消毒空气、操作台面和一些不能用干热、湿热灭菌的培养器皿，如塑料 培养皿、培养板等。这是常使用的消毒方法之一。 (2)干热灭菌 主要用于玻璃器皿的灭菌。将用于细胞培养的器皿放人干燥箱内，加热至 160℃，保温 90－120 min。用于 RNA 提取实验的用品则需 180℃，保温 5－8 h。 (3)湿热灭菌 此方法也称为高压蒸汽灭菌，是最有效的一种灭菌方法。主要应用范围是布类、 橡胶制品(如胶塞)、金属器械、玻璃器皿、某些塑料制品以及加热后不发生沉淀的无机溶液 (如 Hanks 液、PBS、20×SSC 等)。手动高压灭菌锅操作如下： ①首先查看高压锅内的水是否充足，放人物品盖好盖。 ②加热高压锅。将放气阀打开，放气 5—10 min，以排除锅内的冷空气。 ③待锅内水沸腾后，落下放气阀继续升温升压，玻璃器皿等用 15 磅(121℃)30 min，胶塞、 塑料制品、溶液等可用 10 磅(115 ℃)20 min。调节火力大小保持该压力。 ④停止加热，待压力自然下降至 0 再打开放气阀排汽，开盖，取出高压灭菌的物品烘干。 电热自动灭菌锅使用说明(型号：SANYO Autoclave MLS-3020)： ①放气筒加水至 LOW 水平线处，将与高压锅相连的导气管插入放气筒里，然后将放气筒归于 原位。 ②打开高压锅盖，加入蒸馏水至高压锅底的水位线，水位线位于 V 型凹槽的 1／3－2／3 处。 ③打开电源。 ④设定高压温度及时间，高压锅的温度范围为 105－121℃，高压灭菌一般采用 121℃20—30 min。 ⑤把待高压的物品置于高压锅内，顺时针方向将 exhaust 钮旋至 close 位置
⑥关闭高压锅盖，旋至显示屏上左上角的红亮点刚出现为止。 ⑦按 start 钮，开始高压，在温度达 80℃时显示器开始显示温度，当温度达到所需的设定 温度时，在显示屏的左下角有一长形的指示灯闪亮，直到高压时间结束后指示灯灭，此时蜂 鸣器报警一声。当压力降至 0 MPa 时，蜂鸣器再报警一声。温度降至 80℃时，蜂鸣器报警 10 次。显示屏温度指示消失，此时才可打开锅盖。 ⑧关电源，开高压锅盖，取出已灭菌的物品，烘干。 (4)滤过除菌 用于培养用液和各种不能高压灭菌的溶液的灭菌。采用金属滤器和小型的塑料 滤器，配上可以更换的微孔滤膜，极大地方便了操作。滤器型号按直径大小划分。如过滤量 大的培养用液常用较大型号的金属滤器(直径 90 mm、100 mm、142 mm.等)，配以过滤泵 使用。过滤量较小的液体常用注射器推动的塑料小滤器(直径 20 mm、25 mm 等)。滤膜孔径 有 0．60 μm、0．45 μm、0．35 μm、0．22 μm、0．10μm 等，以 0．22 μm 除菌最为 保险，但对于较粘稠难滤过的液体，仍需选用孔径较大的滤膜。 ①在过滤器上装上微孔滤膜，孔径为 0．22μm。 ②用布包好，湿热灭菌后使用。 2．化学消毒法 常用的消毒液有如下几种： (1)70％(或 75％)酒精：超净台里常备 70％酒精棉球(卫生级酒精)，用于手和一些金属器械 或工作台面的消毒。 (2)0．1％新洁尔灭：主要用于手和前臂的清洗以及工作后超净台面的清洁。超净台旁应常 备盛有 0．1％新洁尔灭溶液的容器及纱布。 (3)来苏儿水(煤酚皂溶液)：主要用于无菌室桌椅、墙壁、地面的消毒和清洗，以及空气喷 撒消毒，特别是污染细胞的消毒处理。使用浓度请按瓶上说明。 (4)0．5％过氧乙酸：是强效消毒剂，10 min 即可将芽孢菌杀死。用于各种物品的表面消毒， 用喷撒和擦拭方式进行。 (5)乳酸蒸气：将乳酸放入坩锅内用酒精灯或电炉加热至沸腾为止。将门窗紧闭 1—3 d。可 将空气中漂浮的微生物杀死
⑥关闭高压锅盖，旋至显示屏上左上角的红亮点刚出现为止。 ⑦按 start 钮，开始高压，在温度达 80℃时显示器开始显示温度，当温度达到所需的设定 温度时，在显示屏的左下角有一长形的指示灯闪亮，直到高压时间结束后指示灯灭，此时蜂 鸣器报警一声。当压力降至 0 MPa 时，蜂鸣器再报警一声。温度降至 80℃时，蜂鸣器报警 10 次。显示屏温度指示消失，此时才可打开锅盖。 ⑧关电源，开高压锅盖，取出已灭菌的物品，烘干。 (4)滤过除菌 用于培养用液和各种不能高压灭菌的溶液的灭菌。采用金属滤器和小型的塑料 滤器，配上可以更换的微孔滤膜，极大地方便了操作。滤器型号按直径大小划分。如过滤量 大的培养用液常用较大型号的金属滤器(直径 90 mm、100 mm、142 mm.等)，配以过滤泵 使用。过滤量较小的液体常用注射器推动的塑料小滤器(直径 20 mm、25 mm 等)。滤膜孔径 有 0．60 μm、0．45 μm、0．35 μm、0．22 μm、0．10μm 等，以 0．22 μm 除菌最为 保险，但对于较粘稠难滤过的液体，仍需选用孔径较大的滤膜。 ①在过滤器上装上微孔滤膜，孔径为 0．22μm。 ②用布包好，湿热灭菌后使用。 2．化学消毒法 常用的消毒液有如下几种： (1)70％(或 75％)酒精：超净台里常备 70％酒精棉球(卫生级酒精)，用于手和一些金属器械 或工作台面的消毒。 (2)0．1％新洁尔灭：主要用于手和前臂的清洗以及工作后超净台面的清洁。超净台旁应常 备盛有 0．1％新洁尔灭溶液的容器及纱布。 (3)来苏儿水(煤酚皂溶液)：主要用于无菌室桌椅、墙壁、地面的消毒和清洗，以及空气喷 撒消毒，特别是污染细胞的消毒处理。使用浓度请按瓶上说明。 (4)0．5％过氧乙酸：是强效消毒剂，10 min 即可将芽孢菌杀死。用于各种物品的表面消毒， 用喷撒和擦拭方式进行。 (5)乳酸蒸气：将乳酸放入坩锅内用酒精灯或电炉加热至沸腾为止。将门窗紧闭 1—3 d。可 将空气中漂浮的微生物杀死
(6)37％甲醛加高锰酸钾：使用前先紧闭门窗。将 37％甲醛用酒精灯或电炉加热至沸腾后断 电或灭火。用一张纸盛好适量的高锰酸钾，迅速放人已加热好的甲醛中形成蒸气。1—3 d 后方可达到消毒空气的目的。 3．煮沸消毒 急性消毒可用煮沸法，器械等煮沸 15 min 后使用。 五、注意事项 1．清洗玻璃制品时，浸酸之后一定要用自来水冲洗 10—15 次。因为残存的洗液对细胞粘附 有很大影响。清洗塑料制品时要用棉花或柔软纱布擦洗。千万不要用硬毛刷，否则损害塑料 表面后细胞不易贴壁。Tip 和 Tube 一定要用超声清洗处理后逐个清洗。如没有洗净会影响 下一次使用的效果。 2．干热灭菌时，应在白天使用烤箱，并不断观察，以免发生意外。当温度超过 100℃时， 不能再打开烤箱门。器皿烤完后，待温度降至 100℃之下才能开烤箱门。金属器械和橡胶、 塑料制品不能使用干热灭菌方法。． 3．高压灭菌后器皿务必晾干或烘干，以防包装纸潮湿发霉。 4．牛血清、大部分培养基、胰酶和一些生物制剂是有机溶液，均不能高压(如 TdR，秋水仙 素，谷氨酰胺，异硫氰酸胍，MOPS 等)。 5．滤过除菌时，滤器在使用前先装好滤膜(有时可在上面加一层定性滤纸)，包好，经高压 灭菌后才能使用。滤过酶类制剂时应待滤器温度降至室温下再进行。过滤时压力不宜过大， 压力数字以 2 为宜。压力太大时微孔滤膜可能破裂，或使某些微生物变形而通过滤膜。装滤 膜时位置要准确。另外滤器包装时，螺钉不要拧得太紧，以防高压蒸汽不能进入，待高压灭 菌之后，再拧紧使用。 6．使用化学消毒法时，配制 75％酒精应用卫生级，不要用化学纯、分析纯和优质纯酒精。 来苏儿水不能用于皮肤消毒，它对皮肤有刺激性。空气消毒时，所有的物品要事先准备齐全 并使消毒者有较方便的退出途径。因为甲醛或乳酸加热后放出的蒸气对人的角膜和呼吸道上 皮有严重的刺激和伤害作用。 六、思考题 1．哪些物品适合于高压灭菌，并说明理由。 2．紫外线消毒的适用范围和目的是什么?
(6)37％甲醛加高锰酸钾：使用前先紧闭门窗。将 37％甲醛用酒精灯或电炉加热至沸腾后断 电或灭火。用一张纸盛好适量的高锰酸钾，迅速放人已加热好的甲醛中形成蒸气。1—3 d 后方可达到消毒空气的目的。 3．煮沸消毒 急性消毒可用煮沸法，器械等煮沸 15 min 后使用。 五、注意事项 1．清洗玻璃制品时，浸酸之后一定要用自来水冲洗 10—15 次。因为残存的洗液对细胞粘附 有很大影响。清洗塑料制品时要用棉花或柔软纱布擦洗。千万不要用硬毛刷，否则损害塑料 表面后细胞不易贴壁。Tip 和 Tube 一定要用超声清洗处理后逐个清洗。如没有洗净会影响 下一次使用的效果。 2．干热灭菌时，应在白天使用烤箱，并不断观察，以免发生意外。当温度超过 100℃时， 不能再打开烤箱门。器皿烤完后，待温度降至 100℃之下才能开烤箱门。金属器械和橡胶、 塑料制品不能使用干热灭菌方法。． 3．高压灭菌后器皿务必晾干或烘干，以防包装纸潮湿发霉。 4．牛血清、大部分培养基、胰酶和一些生物制剂是有机溶液，均不能高压(如 TdR，秋水仙 素，谷氨酰胺，异硫氰酸胍，MOPS 等)。 5．滤过除菌时，滤器在使用前先装好滤膜(有时可在上面加一层定性滤纸)，包好，经高压 灭菌后才能使用。滤过酶类制剂时应待滤器温度降至室温下再进行。过滤时压力不宜过大， 压力数字以 2 为宜。压力太大时微孔滤膜可能破裂，或使某些微生物变形而通过滤膜。装滤 膜时位置要准确。另外滤器包装时，螺钉不要拧得太紧，以防高压蒸汽不能进入，待高压灭 菌之后，再拧紧使用。 6．使用化学消毒法时，配制 75％酒精应用卫生级，不要用化学纯、分析纯和优质纯酒精。 来苏儿水不能用于皮肤消毒，它对皮肤有刺激性。空气消毒时，所有的物品要事先准备齐全 并使消毒者有较方便的退出途径。因为甲醛或乳酸加热后放出的蒸气对人的角膜和呼吸道上 皮有严重的刺激和伤害作用。 六、思考题 1．哪些物品适合于高压灭菌，并说明理由。 2．紫外线消毒的适用范围和目的是什么?