中国给水排水第27卷第22期Vol. 27 No. 22Nov.20112011年11月CHINAWATER&WASTEWATER分析与监测中e测试瓶法用于景观水细菌总数检测杜鹃，陆柱（华东理工大学资源与环境工程学院，上海200237）摘要：探讨了采用测试瓶法检测景观水中细菌总数的可行性和操作方法，细菌培养条件为37℃下恒温1~2d。平血计数法和测试瓶法对照试验的数据显示，二者相对误差在10%左右，在景观水的细菌总数测定中可以用测试瓶法代替或者部分代替平血计数法。测试瓶法可在水体现场进行操作，无需采样保存，检测及时，且能够缩短检测时间、简化操作条件和步骤，节省资源和人工工作量。关键词：测试瓶法；细菌总数；景观水中图分类号：X52文献标识码：C文章编号：1000-4602（2011)22-0103-03Determination of Total Bacterial Count in Landscape Water byTest-bottleMethodDUJuan,LU Zhu(College of Resources and Enwvironmental Engineering,East China University of Science andTechnology,Shanghai200237,China)Abstract:The feasibility and operational approach of test-bottle method in determination of totalbacterial count in landscape water are discussed.The bacteria are cultured for 1 to 2 d at 37 C. Thecomparison test results of plate count method and test-bottle method show that the relative error betweenthe two methods is about 10%. So the test-bottle method can either replace plate count method or a partof it in determination of total bacterial count in landscape water. This method can be used on site withoutsample preservation, and it has characteristics of timely determination, short time, simple operationalconditions, saving resources and workload.Key words:test-bottle method;total bacterial count;landscape water景观水常规水质检测指标主要包括COD、NH应用于水中细菌总数测定的为平血计数法和MPN-N、TP、BODs、叶绿素-a、浊度、透明度、水温、细法。平皿计数法操作繁琐，全程需无菌条件，环境及菌总数等。微生物指标能够显示水体的不同污染程人为因素对测定结果影响较大：MPN法操作相对简度，在水体修复过程中有重要参考价值。本试验以便，二者对于现场取样的景观水体均存在不能在野景观河道等水样为主要检测对象，选取合适的分析外现场进行快速检测的缺点。而同样采用绝迹稀释方法考察细菌总数指标，并在一定程度上反映受污法原理制备的测试瓶法制作简单，携带方便，能够于染水体在生物修复过程中微生物的含量变化。取样现场操作。测试瓶可提前数天大量制备，随时目前细菌总数的主要测定方法有平血计数法、取用，避免了一般测试方法亢长的准备时间。该法MPN法、光学显微镜计数法、荧光显微镜计数法、浑原用于石油天然气行业标准中的油田注入水细菌分浊度计数法、电阻抗法等！，其中成本较低且广泛析（SY/T0532一93），已经有文献报道，采用不同培?1994-2014 China Academic Journal Electronic Publishing H1Q3e: All rights reserved.http://www.cnki.net
檲檲檲檲檲檲檲檲檲 檲 檲 檲 檲檲檲檲檲檲檲檲檲 檲 殘 殘 殘 殘 分析与监测 测试瓶法用于景观水细菌总数检测 杜 鹃， 陆 柱 ( 华东理工大学 资源与环境工程学院，上海 200237) 摘 要: 探讨了采用测试瓶法检测景观水中细菌总数的可行性和操作方法，细菌培养条件为 37 ℃下恒温 1 ～ 2 d。平皿计数法和测试瓶法对照试验的数据显示，二者相对误差在 10% 左右，在 景观水的细菌总数测定中可以用测试瓶法代替或者部分代替平皿计数法。测试瓶法可在水体现场 进行操作，无需采样保存，检测及时，且能够缩短检测时间、简化操作条件和步骤，节省资源和人工 工作量。 关键词: 测试瓶法; 细菌总数; 景观水 中图分类号: X52 文献标识码: C 文章编号: 1000 － 4602( 2011) 22 － 0103 － 03 Determination of Total Bacterial Count in Landscape Water by Test-bottle Method DU Juan， LU Zhu ( College of Resources and Environmental Engineering，East China University of Science and Technology，Shanghai 200237，China) Abstract: The feasibility and operational approach of test-bottle method in determination of total bacterial count in landscape water are discussed． The bacteria are cultured for 1 to 2 d at 37 ℃ ． The comparison test results of plate count method and test-bottle method show that the relative error between the two methods is about 10% ． So the test-bottle method can either replace plate count method or a part of it in determination of total bacterial count in landscape water． This method can be used on site without sample preservation，and it has characteristics of timely determination，short time，simple operational conditions，saving resources and workload． Key words: test-bottle method; total bacterial count; landscape water 景观水常规水质检测指标主要包括 COD、NH3 － N、TP、BOD5、叶绿素 － a、浊度、透明度、水温、细 菌总数等。微生物指标能够显示水体的不同污染程 度，在水体修复过程中有重要参考价值。本试验以 景观河道等水样为主要检测对象，选取合适的分析 方法考察细菌总数指标，并在一定程度上反映受污 染水体在生物修复过程中微生物的含量变化。 目前细菌总数的主要测定方法有平皿计数法、 MPN 法、光学显微镜计数法、荧光显微镜计数法、浑 浊度计数法、电阻抗法等［1］，其中成本较低且广泛 应用于水中细菌总数测定的为平皿计数法和 MPN 法。平皿计数法操作繁琐，全程需无菌条件，环境及 人为因素对测定结果影响较大; MPN 法操作相对简 便，二者对于现场取样的景观水体均存在不能在野 外现场进行快速检测的缺点。而同样采用绝迹稀释 法原理制备的测试瓶法制作简单，携带方便，能够于 取样现场操作。测试瓶可提前数天大量制备，随时 取用，避免了一般测试方法冗长的准备时间。该法 原用于石油天然气行业标准中的油田注入水细菌分 析( SY/T 0532—93) ，已经有文献报道，采用不同培 ·103· 第 27 卷 第 22 期 2011 年 11 月 中 国 给 水 排 水 CHINA WATER ＆ WASTEWATER Vol． 27 No． 22 Nov． 2011
中国给水排水第27卷第22期www.watergasheat.com养基制成的针对冷却水中硫酸盐还原菌贝、铁细个/mL;2号瓶有细菌生成则细菌总数为10~10菌，以及产表面活性剂菌、黄原胶降解菌等个/mL。直至第n个测试瓶出现浑浊，而第n+1个不同菌种的测试瓶，经验证与MPN法测定结果完全测试瓶中培养基仍保持澄清状态，则细菌总数为或接近一致。10″-1~10*个/mL，由此可得样品中最大可能细菌1试验方法总数。若要得到更准确的结果，可进行平行试验，以相应的数量指标查计数统计表得到细菌总数的1.1测试瓶的制备在水体表层光线穿透的地方存活有藻类和光合近似值。细菌，制造氧气，因此有氧浅水层生活着大量的好氧2测试结果分析细菌，氧气浓度较低的水层主要是兼氧细菌，只有在2.1测试瓶法培养时间的确定深水层和底泥中有各种厌氧细菌。河道、湖泊等景平皿计数法中细菌培养时间为37℃恒温下24观水取样时一般在表层深约0.3~0.5m处，主要含h，MPN法及文献报道的测试瓶法中根据测试菌种好氧细菌，培养基的选择以培养好氧菌为主。的不同而确定7~15d的培养时间。选取4组不同参考平血计数法中培养细菌所用的牛肉音蛋白水样，每组6个不同稀释度，每天观察每组样品中出陈培养基图，除去起固化作用的琼脂组分制成液态现浑浊的测试瓶个数，直至结果保持稳定。测定结培养基。由于没有一种单独的培养基能够满足某一果见表1。水样中所有种类细菌生长所需的生理条件，因此该表1培养时间分析结果培养基培养所测得的细菌总数实际上要小于被测水Tab.1Culture time analysis样中真正存在的细菌数目，且培养获得的应为活菌出现浑浊的测试瓶数/个稳定期项目总数。Id1d2d3d4d|5d6d7d532水样1X1555取牛肉膏3g，蛋白陈10g，NaCl5g，用10%S45532水样2S155Na0H调整pH值至7.0~7.2，溶于1000mL水中水样324444244若有浑浊可过滤。选取容量约12mL的细菌培养水样433331313131瓶，用定量加液器注入9mL液体培养基，橡胶盖铝由表1可知，接种后的1~2d，细菌处于生长阶箔密封后在（121±1）℃下灭菌半小时。段，第3天直至第7天内不再有新的测试瓶出现浑1.2测试方法浊现象，即细菌总数不再发生变化，故可认为培养时粗略估计待测样的细菌总数，选取合适的测试间为1~2d。在实际操作中，相比于其他需要数天瓶数量并编号，可同时测定平行样。用无菌注射器长期培养观察的方法大幅度缩短时间，更适宜于实取1mL待测样，注入1号瓶，摇匀得1：10稀释浓际应用，可更好地针对现象及时采取处理措施，获得度：另取一支无菌注射器从1号瓶内取1m液体注最佳效果。入2号瓶，摇匀得1：100稀释浓度：取第三支无菌2.2两种方法测试结果比较注射器从2号瓶内取1mL液体注入3号瓶，摇匀得本试验同时采用平血计数法和测试瓶法对不同1：1000稀释浓度，依此类推，根据需要而重复取样取样点的校园景观河道河水进行测试。一般景观水稀释过程（见图1）。将培养瓶置于37℃恒温培养中的细菌总数含量均较高，基本上大于100个/mL，箱内培养。故采用多个稀释度，两种方法的测试结果见表2，1mL待测样浑浊10-表2中数量指标的确定可参考MPN法测定细澄清10-澄清10+浑浊10军浊10100-0-菌总数时的计数统计表7.8。0-0-01号2号3号n号+1号m号两种测试方法在数量级上保持一致，水样1、2、3、4的相对误差分别为-11.76%、0%、-6.25%、图1测试瓶法示意图-7.41%，平皿计数法所测得的细菌总数相对测试Fig.1 Schematic diagram of test-bottle method瓶法的测试结果要高，相对误差基本上可控制在培养完毕后观察，培养液成云状浑浊则表示有细菌生成。1号瓶有细菌生成则细菌总数为1~1010%左右。细菌总数的测定受外界影响因素较大，?1994-2014 China Academic Journal Electronic Publishing Hd04c: All rights reserved.http://www.cnki.net
养基制成的针对冷却水中硫酸盐还原菌［2］、铁细 菌［3］，以及产表面活性剂菌［4］、黄原胶降解菌［5］等 不同菌种的测试瓶，经验证与 MPN 法测定结果完全 或接近一致。 1 试验方法 1. 1 测试瓶的制备 在水体表层光线穿透的地方存活有藻类和光合 细菌，制造氧气，因此有氧浅水层生活着大量的好氧 细菌，氧气浓度较低的水层主要是兼氧细菌，只有在 深水层和底泥中有各种厌氧细菌。河道、湖泊等景 观水取样时一般在表层深约 0． 3 ～ 0． 5 m 处，主要含 好氧细菌，培养基的选择以培养好氧菌为主。 参考平皿计数法中培养细菌所用的牛肉膏蛋白 胨培养基［6］，除去起固化作用的琼脂组分制成液态 培养基。由于没有一种单独的培养基能够满足某一 水样中所有种类细菌生长所需的生理条件，因此该 培养基培养所测得的细菌总数实际上要小于被测水 样中真正存在的细菌数目，且培养获得的应为活菌 总数。 取牛肉膏 3 g，蛋白胨 10 g，NaCl 5 g，用 10% NaOH 调整 pH 值至 7． 0 ～ 7． 2，溶于 1 000 mL 水中， 若有浑浊可过滤。选取容量约 12 mL 的细菌培养 瓶，用定量加液器注入 9 mL 液体培养基，橡胶盖铝 箔密封后在( 121 ± 1) ℃下灭菌半小时。 1. 2 测试方法 粗略估计待测样的细菌总数，选取合适的测试 瓶数量并编号，可同时测定平行样。用无菌注射器 取 1 mL 待测样，注入 1 号瓶，摇匀得 1 ∶ 10 稀释浓 度; 另取一支无菌注射器从 1 号瓶内取 1 mL 液体注 入 2 号瓶，摇匀得 1 ∶ 100 稀释浓度; 取第三支无菌 注射器从 2 号瓶内取 1 mL 液体注入 3 号瓶，摇匀得 1 ∶ 1 000 稀释浓度，依此类推，根据需要而重复取样 稀释过程( 见图 1) 。将培养瓶置于 37 ℃ 恒温培养 箱内培养。 图 1 测试瓶法示意图 Fig． 1 Schematic diagram of test-bottle method 培养完毕后观察，培养液成云状浑浊则表示有 细菌生成。1 号瓶有细菌生成则细菌总数为 1 ～ 10 个/mL; 2 号瓶有细菌生成则细菌总数为 10 ～ 102 个/mL。直至第 n 个测试瓶出现浑浊，而第 n + 1 个 测试瓶中培养基仍保持澄清状态，则细菌总数为 10n － 1 ～ 10n 个/mL，由此可得样品中最大可能细菌 总数。若要得到更准确的结果，可进行平行试验，以 相应的数量指标查计数统计表［7，8］得到细菌总数的 近似值。 2 测试结果分析 2. 1 测试瓶法培养时间的确定 平皿计数法中细菌培养时间为 37 ℃ 恒温下 24 h，MPN 法及文献报道的测试瓶法中根据测试菌种 的不同而确定 7 ～ 15 d 的培养时间。选取 4 组不同 水样，每组 6 个不同稀释度，每天观察每组样品中出 现浑浊的测试瓶个数，直至结果保持稳定。测定结 果见表 1。 表 1 培养时间分析结果 Tab． 1 Culture time analysis 项目 出现浑浊的测试瓶数/个 1 d 2 d 3 d 4 d 5 d 6 d 7 d 稳定期 /d 水样 1 4 5 5 5 5 5 5 2 水样 2 4 5 5 5 5 5 5 2 水样 3 2 4 4 4 4 4 4 2 水样 4 3 3 3 3 3 3 3 1 由表 1 可知，接种后的 1 ～ 2 d，细菌处于生长阶 段，第 3 天直至第 7 天内不再有新的测试瓶出现浑 浊现象，即细菌总数不再发生变化，故可认为培养时 间为 1 ～ 2 d。在实际操作中，相比于其他需要数天 长期培养观察的方法大幅度缩短时间，更适宜于实 际应用，可更好地针对现象及时采取处理措施，获得 最佳效果。 2. 2 两种方法测试结果比较 本试验同时采用平皿计数法和测试瓶法对不同 取样点的校园景观河道河水进行测试。一般景观水 中的细菌总数含量均较高，基本上大于 100 个/mL， 故采用多个稀释度，两种方法的测试结果见表 2。 表 2 中数量指标的确定可参考 MPN 法测定细 菌总数时的计数统计表［7，8］。 两种测试方法在数量级上保持一致，水样 1、2、 3、4 的相对误差分别为 － 11． 76% 、0% 、－ 6． 25% 、 － 7． 41% ，平皿计数法所测得的细菌总数相对测试 瓶法的测试结果要高，相对误差基本上可控制在 10% 左右。细菌总数的测定受外界影响因素较大， ·104· 第 27 卷 第 22 期 中 国 给 水 排 水 www． watergasheat． com
杜鹃，等：测试瓶法用于景观水细菌总数检测第27卷第22期www.watergasheat.com人为操作不当或器血灭菌不彻底等皆可导致检测结3结论果有出入。因此，测试瓶法可代替或部分代替平血采用牛肉膏蛋白陈培养基制成的测试瓶，可提计数法在野外现场快速检测水体中的细菌总数：前大量制备，测试时无需全程保持无菌，能够缩短试表2平血计数法与测试瓶法试验结果对比验时间、简化操作条件和步骤，节省检测消耗的资源Tab.2Results of plate count method and test-bottle method和人工工作量。可在水体野外现场进行操作，无需不同稀释度的平均菌落数/个数量细菌总数/采样保存，避免水样的污染和变质，检测及时，达到项目(个·mL-")10-10-210-10-10-h0-指标现场检测快速、简化、低耗等效果。细菌培养条件为-水样127741173.4×1031平37℃下恒温1~2d。一般景观水细菌含量较高，经无法Il水样239320新2.0×10*n实验室试验比较发现平血计数法与测试瓶法相对误计数计数差在10%左右，测试瓶法所得数值相对较低，基本水样3164201.6 ×10*1水样4215332.7 ×1033可用测试瓶法代替或部分代替平血计数法检测景观水样13303232213.0×10l水体中细菌总数。在对测试结果的精确度要求不高32233220试水样232.0×104的情况下，可直接采用一组测试瓶测定，获得最大可瓶3300321水样321.5×103能的细菌总数，并可连续观察其数量级的变化。法水样400031331313002.5×1032.3测试实例参考文献：用测试瓶法对某采用生物激活剂修复中的受污[]王婷婷，邓天龙，廖梦霞，水生细菌计数方法研究进展染水体进行连续测定，考察细菌总数在一定时间范及展望D：世界科技研究与发展，2008，30（2）：138围内的变化，侧面反映水体水质情况。生物激活剂142.为一种生物制剂，在促进受污染水体中土著微生[2]何世梅，田剑临，余伟民，等，测试瓶法快速检测循环物的生长，进而加快降解污染物的进程，改善水体水水中硫酸盐还原菌，工业水处理，2004，24（1）：52质。在投加药剂的初期，微生物受到刺激数量会相 53.[3]对增长，有效降解有机物，从生物修复的角度改善水何世梅，曹立群，田剑临，等，测试瓶法测定循环水中的铁细菌：中国给水排水，2003，19（11）：98-99体水质和环境。考虑到在水体修复过程中主要考察[4]易绍金，邓勇：细菌瓶法用于产表面活性剂菌菌数测的是微生物数量上的大致变化和检测的及时性，对定，油田化学，2005，22（3）：262-264.其准确性要求一般，故均为单瓶测定，所得为最大可[S]易绍金，熊汉辉。细菌瓶法用于黄原胶降解菌菌数测能细菌总数值。结果见表3。定.油田化学，2005，22（2）：192-194.表3水体细菌总数变化[6]苑宝玲，李云琴.环境工程微生物学实验[MI，北京：Tab.3Variation of total bacterial count in water化学工业出版社，2006个·mL-![郑平环境微生物学实验指导LMJ：杭州：浙江大学水样3项目水样1水样2出版社，2005104103103修复前[8] 俞毓馨.环境工程微生物检验手册[M].北京：中国10510*105修复中环境科学出版社，1990.由表3可见，在水体修复过程中微生物数量级上有不同程度的增加，可能有利于对水体中污染物电话：(021)64252901的降解和消除，在水体修复后期可恢复正常。若需E - mail : juandu@ mail. ecust. edu. cn获得更准确的数值则可采用多组试验。测试瓶法亦zhulu@ecust.edu.cn收稿日期：2011-03-16可用于其他药剂（如杀菌剂等）的快速评价等。?1994-2014 China Academic Journal Electronic Publishing H405e: All rights reserved.http://www.cnki.net
人为操作不当或器皿灭菌不彻底等皆可导致检测结 果有出入。因此，测试瓶法可代替或部分代替平皿 计数法在野外现场快速检测水体中的细菌总数。 表 2 平皿计数法与测试瓶法试验结果对比 Tab． 2 Results of plate count method and test-bottle method 项 目 不同稀释度的平均菌落数/个 10 － 1 10 － 2 10 － 3 10 － 4 10 － 5 10 － 6 数量 指标 细菌总数/ ( 个·mL － 1 ) 平 皿 计 数 法 水样 1 277 41 17 1 — 3． 4 × 103 水样 2 无法 计数 393 20 6 — 2． 0 × 104 水样 3 164 20 1 — — 1． 6 × 103 水样 4 215 33 3 — — 2． 7 × 103 测 试 瓶 法 水样 1 3 3 2 2 1 0 323 3． 0 × 103 水样 2 3 3 3 2 2 0 322 2． 0 × 104 水样 3 3 3 2 1 0 0 321 1． 5 × 103 水样 4 3 3 3 0 0 0 300 2． 5 × 103 2. 3 测试实例 用测试瓶法对某采用生物激活剂修复中的受污 染水体进行连续测定，考察细菌总数在一定时间范 围内的变化，侧面反映水体水质情况。生物激活剂 为一种生物制剂，旨在促进受污染水体中土著微生 物的生长，进而加快降解污染物的进程，改善水体水 质。在投加药剂的初期，微生物受到刺激数量会相 对增长，有效降解有机物，从生物修复的角度改善水 体水质和环境。考虑到在水体修复过程中主要考察 的是微生物数量上的大致变化和检测的及时性，对 其准确性要求一般，故均为单瓶测定，所得为最大可 能细菌总数值。结果见表 3。 表 3 水体细菌总数变化 Tab． 3 Variation of total bacterial count in water 个·mL － 1 项目 水样 1 水样 2 水样 3 修复前 104 103 103 修复中 105 104 105 由表 3 可见，在水体修复过程中微生物数量级 上有不同程度的增加，可能有利于对水体中污染物 的降解和消除，在水体修复后期可恢复正常。若需 获得更准确的数值则可采用多组试验。测试瓶法亦 可用于其他药剂( 如杀菌剂等) 的快速评价等。 3 结论 采用牛肉膏蛋白胨培养基制成的测试瓶，可提 前大量制备，测试时无需全程保持无菌，能够缩短试 验时间、简化操作条件和步骤，节省检测消耗的资源 和人工工作量。可在水体野外现场进行操作，无需 采样保存，避免水样的污染和变质，检测及时，达到 现场检测快速、简化、低耗等效果。细菌培养条件为 37 ℃下恒温 1 ～ 2 d。一般景观水细菌含量较高，经 实验室试验比较发现平皿计数法与测试瓶法相对误 差在 10% 左右，测试瓶法所得数值相对较低，基本 可用测试瓶法代替或部分代替平皿计数法检测景观 水体中细菌总数。在对测试结果的精确度要求不高 的情况下，可直接采用一组测试瓶测定，获得最大可 能的细菌总数，并可连续观察其数量级的变化。 参考文献: ［1］ 王婷婷，邓天龙，廖梦霞． 水生细菌计数方法研究进展 及展望［J］． 世界科技研究与发展，2008，30( 2) : 138 － 142． ［2］ 何世梅，田剑临，余伟民，等． 测试瓶法快速检测循环 水中硫酸盐还原菌［J］． 工业水处理，2004，24( 1) : 52 － 53． ［3］ 何世梅，曹立群，田剑临，等． 测试瓶法测定循环水中 的铁细菌［J］． 中国给水排水，2003，19( 11) : 98 － 99． ［4］ 易绍金，邓勇． 细菌瓶法用于产表面活性剂菌菌数测 定［J］． 油田化学，2005，22( 3) : 262 － 264． ［5］ 易绍金，熊汉辉． 细菌瓶法用于黄原胶降解菌菌数测 定［J］． 油田化学，2005，22( 2) : 192 － 194． ［6］ 苑宝玲，李云琴． 环境工程微生物学实验［M］． 北京: 化学工业出版社，2006． ［7］ 郑平． 环境微生物学实验指导［M］． 杭州: 浙江大学 出版社，2005． ［8］ 俞毓馨． 环境工程微生物检验手册［M］． 北京: 中国 环境科学出版社，1990． 电话: ( 021) 64252901 E － mail: juandu@ mail． ecust． edu． cn zhulu@ ecust． edu． cn 收稿日期: 2011 － 03 － 16 ·105· www． watergasheat． com 杜 鹃，等: 测试瓶法用于景观水细菌总数检测 第 27 卷 第 22 期