生物医学工程研究bumla BiodielEgimeig Reeanch 209 28(1): 60-62基于滤膜上细菌直接计数法的细菌总数快速检测刘弋青，吕维敏，刘魁武一，陈仙明（浙江省医疗器械研究所，杭州310009）摘要：细菌总数快速检测在质量监测中具有重要的意义，目前除了经典的平板培养法以外，还有微菌落法、阻抗法等快速检测方法，这些方法或者需要较长的检测时间，或者需要较高的检测成本。本研究提出一种不需要培养而在滤膜上直接计数的细菌总数的快速检测方法，它主要分为过滤、染色、显微镜计数和计算四个步骤。计算细菌总数时，根据细菌在滤膜上的分布特点，对传统公式进行改进，提出按区域计算细菌总数的计算方法，提高了检测精度。研究结果表明，该方法与传统的平板培养法无显著性差异（t=0.847.P一0.436>0.05），是一种低成本、快速的细菌总数检测方法。关键词：细菌总数；检测；直接计数；滤膜；染色中图分类号：R318文献标识码：A文章编号：1672-6278（2009)01-0060-03Rapid Detection of Total BacteriaNumberby ObservingDirectly on FilterLIU Yiqing, LU Weimin, LIU Kuiwu, CHEN Xianming(Zhgjiang Melical Davice hnstitute,Hanghou 310009 China)Abstract: Rapid detection df total bacteria number is very important in qiality contiol. Nows there are many rapid detection methods oftdtal bacteria number such as microclony method bioelectrical impedance method and so on, besides the plate counting method. But thesemethods need more time or higher ost. So we presented a new method, observing directly on the filter without gemculture it induded foursteps filtration coloratian, observation and calaulation. Based on the point f distributing a new fomula was put forward other than formefomula, so it improved the detection precision. The lesults reveal that there are no significant differences between the new method and theplate countirg method (-0.847,P=0. 436> 0. 05 ), and it is a lower cost and faster detectian method of total bacteria number.Key word,Total bacteria number; Detection; Observing directly; Filter; Coloration法[6-刀等检测方法，取得了一定的成果，但检测时间1引言仍在4h以上。细菌总数计数的研究已有很多，目前国标规定本研究在分析了已有研究成果的基础上，提出的方法为平板计数法，该方法是将样品加入琼脂营了在滤膜上染色后，直接计数的细菌总数检测方法养基，在37℃下培养24~48h后计数。这种方法精具体步骤为：用集菌仪进行细菌收集一→在膜上进行度高，但耗时长，难以满足实际工作需要。为了简化染色→在油镜下计数→按公式计算出菌液浓度。实检测程序、缩短检测时间，国内外学者进行了大量的验结果表明，该方法与传统的平板培养法无显著性快速检测方法的研究。提出了阻抗检测法、差异，检测时间约1h，是一种快速的细菌总数检测SimplateTM全平器计数法[2]、微菌落技术3-5]、纸片方法。*浙江省医用水处理与检测技术重点科研项目（2007F10026）通信作者Email.LKW200sohu.com?1994-2014ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouse.Allrightsreserved.http://www.cnki.net
＊浙江省医用水处理与检测技术重点科研项目(2007F10026) ■通信作者 Email:LKW200@sohu.com 基于滤膜上细菌直接计数法的细菌总数快速检测 ＊ 刘弋青 ,吕维敏 ,刘魁武 ■ ,陈仙明 (浙江省医疗器械研究所, 杭州 310009) 摘要:细菌总数快速检测在质量监测中具有重要的意义, 目前除了经典的平板培养法以外 ,还有微菌落 法、阻抗法等快速检测方法,这些方法或者需要较长的检测时间, 或者需要较高的检测成本 。本研究提出一 种不需要培养而在滤膜上直接计数的细菌总数的快速检测方法, 它主要分为过滤、染色、显微镜计数和计算 四个步骤 。计算细菌总数时, 根据细菌在滤膜上的分布特点, 对传统公式进行改进 ,提出按区域计算细菌总 数的计算方法, 提高了检测精度。研究结果表明, 该方法与传统的平板培养法无显著性差异(t =0 .847 , P = 0 .436 >0 .05),是一种低成本 、快速的细菌总数检测方法。 关键词:细菌总数;检测;直接计数 ;滤膜 ;染色 中图分类号 :R318 文献标识码 :A 文章编号 :1672-6278 (2009)01-0060-03 Rapid Detection of Total Bacteria Number by Observing Directly on Filter LIU Yiqing , L¨U Weimin,LIU Kuiwu, CHEN Xianming (Zhejiang Medical Device Institute , Hangzhou 310009, China) Abstract:Rapid detection of total bacteria number is very important in quality control.Now, there are many rapid detection methods of total bacteria number, such as microclony method, bioelectrical impedance method and so on , besides the plate counting method.But these methods need more time or higher cost .So we presented a new method , observing directly on the filter without germculture , it included four steps, filtration, coloration , observation and calculation.Based on the point of distributing , a new formula was put forward other than former formula , so it improved the detection precision .The results reveal that there are no significant differences between the new method and the plate counting method (t =0.847 , P =0.436 >0.05 ), and it is a lower cost and faster detection method of total bacteria number. Key words:Total bacteria number;Detection;Observing directly;Filter;Coloration 1 引 言 细菌总数计数的研究已有很多, 目前国标规定 的方法为平板计数法, 该方法是将样品加入琼脂营 养基 ,在37 ℃下培养24 ～ 48 h 后计数。这种方法精 度高 ,但耗时长 ,难以满足实际工作需要 。为了简化 检测程序 、缩短检测时间 ,国内外学者进行了大量的 快速检 测 方法 的研 究, 提 出 了阻 抗检 测 法 [ 1] 、 Simplate TM 全平器计数法 [ 2] 、微菌落技术 [ 3 -5] 、纸片 法 [ 6 -7] 等检测方法, 取得了一定的成果 ,但检测时间 仍在4 h 以上 。 本研究在分析了已有研究成果的基础上 ,提出 了在滤膜上染色后 ,直接计数的细菌总数检测方法, 具体步骤为 :用集菌仪进行细菌收集 ※在膜上进行 染色※在油镜下计数※按公式计算出菌液浓度 。实 验结果表明, 该方法与传统的平板培养法无显著性 差异 ,检测时间约 1 h , 是一种快速的细菌总数检测 方法。 生 物 医 学 工 程 研 究 Journal of Biomedical Engineering Research 2009, 28(1):60 ～ 62
61第1期刘代青，等：基于滤膜上细菌直接计数法的细菌总数快速检测2材料与方法2.1材料本研究中用的试验材料有集菌仪（杭州泰林生物技术设备有限公司），染色剂，生物显微镜（宁波永新光学股份有限公司），聚碳酸脂膜（直径47mm）。2.2实验方法2.2.1准备工作卸下集菌仪的滤网（见图1），统计滤网上小孔总数，为计算菌液浓度做准备。另外，还需对集菌仪中的集菌器进行高压灭菌，以防止过图2膜上细菌的区域分布滤过程中引入外源细菌。Fig 2 The distributing region of bacteria on the filter( 100 倍)图1集菌仪滤网图3膜上细菌的区域间隔Fig1:Sieve of bacteria collectionFig 3 The space among the distributing regions( 100 倍)2.2.2细菌收集取一定浓度的霉菌菌液300~500ml装在集菌仪上，集菌仪采用蠕动加压方式对菌液施加一定的压力，使菌液流过孔径为0.45um的聚碳酸脂膜。采用过滤方法是因为它可以使细菌相对均匀地分布在滤膜上，而选用聚碳酸脂膜是因为这种膜具有良好的透光性，便手用显微镜观察。2.2.3染色集菌后取下滤膜，切下一部分放在载玻片上，进行染色、固定。染色的目的是增大细菌与背景的对比度，便于观察。2.2.4显微镜计数与计算菌液经集菌仪过滤后，细菌在滤膜上的分布见图2、图3，由图可以看出细图4膜上细菌染色后图像Fig 4Figure of bacteria after coloration(1 000 倍）菌分布具有以下两个特点：一是细菌集中在一个个的圆形区域内，这些圆形区域和挡板的小孔相对应；式中：X表示待检菌液浓度（CFUml）二是各个圆形区域之间细菌很少。根据膜上细菌分A表示10个圆形区域内细菌总数布的这种特点，提出以圆形区域为单位进行计数，统N表示滤网上小孔总数计出圆形区域内细菌的平均个数，从而计算出菌液V表示集菌时所用待检菌液体积（ml)中细菌总数。具体步骤如下：随机选择10个圆形区3结果与讨论域在油镜下，调节焦距以获得较清晰的图像（见图4)，统计每个圆形区域内的细菌个数，然后按公式3.1实验结果(1)计算出菌液的浓度。按上述方法计算得到的结果与平板培养法得到AXNlV格的结果见表1。(1)?1994-2014ChinaAc1enieJournalElectronicPublishing House.Allrightsreservedhttp://www.cnki.net
2 材料与方法 2 .1 材料 本研究中用的试验材料有集菌仪(杭州泰林生 物技术设备有限公司),染色剂 ,生物显微镜(宁波永 新光学股份有限公司),聚碳酸脂膜(直径47 mm)。 2 .2 实验方法 2 .2 .1 准备工作 卸下集菌仪的滤网(见图 1), 统 计滤网上小孔总数, 为计算菌液浓度做准备。另外 , 还需对集菌仪中的集菌器进行高压灭菌, 以防止过 滤过程中引入外源细菌。 图 1 集菌仪滤网 Fig 1 Sieve of bacteria collection 2 .2 .2 细菌收集 取一定浓度的霉菌菌液 300 ～ 500 ml, 装在集菌仪上 ,集菌仪采用蠕动加压方式对 菌液施加一定的压力, 使菌液流过孔径为 0 .45 um 的聚碳酸脂膜。采用过滤方法是因为它可以使细菌 相对均匀地分布在滤膜上, 而选用聚碳酸脂膜是因 为这种膜具有良好的透光性, 便于用显微镜观察。 2 .2 .3 染色 集菌后取下滤膜 ,切下一部分放在载 玻片上,进行染色、固定。染色的目的是增大细菌与 背景的对比度, 便于观察 。 2 .2 .4 显微镜计数与计算 菌液经集菌仪过滤后 , 细菌在滤膜上的分布见图 2 、图 3 , 由图可以看出细 菌分布具有以下两个特点:一是细菌集中在一个个 的圆形区域内, 这些圆形区域和挡板的小孔相对应 ; 二是各个圆形区域之间细菌很少。根据膜上细菌分 布的这种特点, 提出以圆形区域为单位进行计数, 统 计出圆形区域内细菌的平均个数 ,从而计算出菌液 中细菌总数。具体步骤如下:随机选择 10 个圆形区 域,在油镜下,调节焦距以获得较清晰的图像(见图 4), 统计每个圆形区域内的细菌个数 , 然后按公式 (1)计算出菌液的浓度 。 X = A 10 ×N V (1) 图2 膜上细菌的区域分布 Fig 2 The distributing region of bacteria on the filter(100 倍) 图3 膜上细菌的区域间隔 Fig 3 The space among the distributing regions(100 倍) 图4 膜上细菌染色后图像 Fig 4 Figure of bacteria after coloration(1 000 倍) 式中:X 表示待检菌液浓度(CFU ml) A 表示 10 个圆形区域内细菌总数 N 表示滤网上小孔总数 V 表示集菌时所用待检菌液体积(ml) 3 结果与讨论 3 .1 实验结果 按上述方法计算得到的结果与平板培养法得到 的结果见表 1 。 第1 期 刘弋青, 等:基于滤膜上细菌直接计数法的细菌总数快速检测 61
62生物医学工程研究第28卷表1两种方法得到的细菌总数行培养，而是在膜上染色后直接用显微镜计数。最大Table 1Total bacteria number by two different methods限度地缩短了检测时间，使整个检测时间在1h左样本1样本4样本5样本6样本2样本3右。染色镜检1851711661681571654结论(cfulml)平板培养本研究用集菌仪将菌液过滤后，取滤膜一部分176155165158183152(cfulml)进行染色、制片，然后在油镜下统计细菌个数。根据细菌在滤膜上的分布特点，提出将圆形区域作为统对表1中两组数据进行配对t检验，在α0计单位，得到圆形区域内细菌的平均个数，从而计算05时，双尾检验结果如下：t=0.847P=0.436>0出菌液浓度。实验结果表明，按照该方法得到的结05，说明两种方法得到的结果无显著性差异。果与平板培养法的结果无显著性差异。与平板培养3.2讨论法和微菌落法相比，该方法不需要细菌培养，检测时3.2.1计算公式的改进用集菌仪对样本菌液进间只需要1h左右，明显缩短了检测时间，是一种快行过滤时，由于滤网挡板的作用，使得细菌不是均匀速、有效的细菌总数检测方法地分布在整个滤膜上，而是集中分布在滤网的小孔AY处，所以，计算细菌总数时，不能采用公式X=%>参考文献：【赵国俊，范放。电阻抗法检测食品中的细菌总数与平板计数法2/v(其中Φ.Φ分别为滤膜直径和视野直的比较[』：食品工业科技。1998.14（2)：63-65.[ 2] HaHane D J M, Damn M A S Anderson J D. Improwed hiochemical径），该公式是微菌落方法检测细菌总数中的常用计sreening pmcedure far small clinical labonabries for Vero (Shigaike)算公式。在本实验中，根据细菌分布的特点，提出以 toxin- proddurirg strains of Escherichia Col O157; H7[J] - J GirMicrobinl 1986. 24 (4): 652-654.圆形区域为单位计算细菌总数的思路，使计算结果[ 3] Fg J Zia T. A method foredimating viability of aquatic bacteria by shide更接近真实值，从而提高了检测精度。cdltum[J] . J Arpl Bact eria. 1982. 53 189- 198]3.2.2细菌大小的影响细菌大小对本实验的影【4杨国武叶晓莲张海煊。微菌落定量测定技术方法探讨[』．中响主要体现在镜检时，如果细菌太小，显微镜计数时国卫生检验杂志。1999,9（1)：55-56不能将细菌从背景中分辨出来，我们的实验结果显【习许欣。装晓方，赵亮。等。微菌落技术快速定量测定矿泉水中细菌总数的初步研究[』．预防医学情报杂志200117（3)：137-示，不能分辨大肠杆菌和葡萄球菌，而较大的霉菌可138以清晰地分辨。【6王新为。水和食品中卫生细菌的快速检测研究进展[』：中国公3.2.3检测时间进一步缩短细菌总数的经典检共卫生。200016（8)：747—748测方法是平板培养法，得到的结果精度高，但是它所【7方加灼，黄秀美。林丽卿。水质细菌检测两种方法的比较』·海用时间长，为了缩短检测时间，出现了微菌落法，将峡预防医学杂志。2002.8（3)：60-61检测时间缩短为4h左右13-。本研究不对细菌进（收稿日期：2008-11-20）线粒体糖尿病基因诊断芯片问世近日从武汉大学中南医院了解到，该院周新教授率领的课题组新近发明的糖尿病基因诊断芯片，可以通过基因检测在一天之内确诊线粒体型糖尿病。据周新介绍，线粒体糖尿病是一种母性基因遗传疾病，携带者发病的可能性接近100%。课题组经过4年时间研究出的该芯片，对糖尿病现症者、高危人群和健康者进行筛查，有助于临床的正确诊断和分类。如果检查发现携带了突变的基因，受检者可以通过加强锻炼、合理饮食提前预防，避免接触诱发因素，减少或延缓个体发病，预防慢性并发症的发生据悉，通常确诊糖尿病，从尿检到查胰岛素，一般需要近两个月的时间。?1994-2014China AcademicJournalElectronicPublishingHouse.All rightsreserved.http://www.cnki.net
表 1 两种方法得到的细菌总数 Table 1 Total bacteria number by two different methods 样本 1 样本 2 样本 3 样本 4 样本5 样本6 染色镜检 (cfu ml) 185 168 157 165 171 166 平板培养 (cfu ml) 176 155 165 158 183 152 对表 1 中两组数据进行配对 t 检验, 在 α=0 . 05 时, 双尾检验结果如下:t =0 .847 , P =0 .436 >0 . 05 , 说明两种方法得到的结果无显著性差异 。 3 .2 讨论 3 .2 .1 计算公式的改进 用集菌仪对样本菌液进 行过滤时 ,由于滤网挡板的作用,使得细菌不是均匀 地分布在整个滤膜上, 而是集中分布在滤网的小孔 处,所以,计算细菌总数时 ,不能采用公式 X = A 40 × Υ1 Υ2 2 V(其中 Υ1 , Υ2 分别为滤膜直径和视野直 径), 该公式是微菌落方法检测细菌总数中的常用计 算公式。在本实验中 ,根据细菌分布的特点, 提出以 圆形区域为单位计算细菌总数的思路, 使计算结果 更接近真实值, 从而提高了检测精度。 3 .2 .2 细菌大小的影响 细菌大小对本实验的影 响主要体现在镜检时 ,如果细菌太小,显微镜计数时 不能将细菌从背景中分辨出来 , 我们的实验结果显 示,不能分辨大肠杆菌和葡萄球菌 ,而较大的霉菌可 以清晰地分辨。 3 .2 .3 检测时间进一步缩短 细菌总数的经典检 测方法是平板培养法 ,得到的结果精度高,但是它所 用时间长 ,为了缩短检测时间 ,出现了微菌落法 , 将 检测时间缩短为 4 h 左右 [ 3 -5] 。本研究不对细菌进 行培养 ,而是在膜上染色后直接用显微镜计数, 最大 限度地缩短了检测时间 ,使整个检测时间在 1 h 左 右 。 4 结论 本研究用集菌仪将菌液过滤后 ,取滤膜一部分 进行染色、制片,然后在油镜下统计细菌个数。根据 细菌在滤膜上的分布特点 ,提出将圆形区域作为统 计单位 ,得到圆形区域内细菌的平均个数 ,从而计算 出菌液浓度。实验结果表明 ,按照该方法得到的结 果与平板培养法的结果无显著性差异 。与平板培养 法和微菌落法相比 ,该方法不需要细菌培养,检测时 间只需要1 h 左右 ,明显缩短了检测时间, 是一种快 速 、有效的细菌总数检测方法。 参考文献: [ 1] 赵国俊, 范放.电阻抗法检测食品中的细菌总数与平板计数法 的比较[ J] .食品工业科技, 1998 , 14(2):63-65. [ 2] Haldane D J M , Damn M A S , Anderson J D.Improved biochemical screening procedure f or small clinical laboratories for Vero (Shiga -like) -toxin -procducing strains of Escherichia Coli O157:H7[ J] .J Gin Microbiol, 1986 , 24 (4):652-654. [ 3] Fig J, Zia T .A method for estimating viability of aquatic bacteria by slide culture[ J] .J Appl Bact eria , 1982 , 53:189-198. [ 4] 杨国武, 叶晓莲, 张海煊.微菌落定量测定技术方法探讨[ J] .中 国卫生检验杂志, 1999 , 9(1):55-56. [ 5] 许欣, 裴晓方, 赵亮, 等.微菌落技术快速定量测定矿泉水中细 菌总数的初步研究[ J] .预防医学情报杂志, 2001, 17 (3):137- 138. [ 6] 王新为.水和食品中卫生细菌的快速检测研究进展[ J] .中国公 共卫生, 2000, 16 (8):747-748. [ 7] 方加灼, 黄秀美, 林丽卿.水质细菌检测两种方法的比较[ J] .海 峡预防医学杂志, 2002 , 8(3):60-61. (收稿日期:2008-11-20) 线粒体糖尿病基因诊断芯片问世 近日从武汉大学中南医院了解到, 该院周新教授率领的课题组新近发明的糖尿病基因诊断芯片,可以通 过基因检测在一天之内确诊线粒体型糖尿病 。 据周新介绍 ,线粒体糖尿病是一种母性基因遗传疾病 ,携带者发病的可能性接近 100 %。课题组经过 4 年时间研究出的该芯片, 对糖尿病现症者 、高危人群和健康者进行筛查, 有助于临床的正确诊断和分类 。如 果检查发现携带了突变的基因 ,受检者可以通过加强锻炼、合理饮食提前预防, 避免接触诱发因素 ,减少或延 缓个体发病,预防慢性并发症的发生。 据悉 ,通常确诊糖尿病,从尿检到查胰岛素,一般需要近两个月的时间 。 62 生 物 医 学 工 程 研 究 第 28 卷