净水技术WATERPURIFICATIONTECHNOLOGY42分析监测用R2A培养基提高饮用水中细菌总数检出率顾孔珍！钱纯罗岳平”（1.中南大学湘雅医学院检验系，湖北武汉430013；2.湖南省中医学院附属第一医院，湖南长沙410007；3.湖南省长沙市自来水公司，湖南长沙410015)摘要对饮用水中细菌总数的检测方法进行评价，提出了R2A培养基的营养组成。对比检测表明，使用R2A培养基可显著提高饮用水中细菌总数的检出率。关键词饮用水细菌总数培养基To Improve the DetectionRateof Tatal Bacteria Count UsingR2ACultural MediumGu Kongzhen' Qian Chun?Luo Yueping(1.XiangYa Medicine School,Mid southUniversisty,Wuhan430013,China;2HumanProruincial Chinese Medicine SchoolAffliatedNo.1Hospital,Changsha410007,China;3.ChangshaMhuicipalWaterutprksCo.,Changsha410015,China)AbstractEvaluation of the method of total bacteria count in the drinking water was made,and thecomposition of the R2A Cultural medium was recommended. With this R2A,Cultural medium,the rate oftotal bacteria Count may be improved obviously.Keywords drinking water total bacteria count cultural medium平板计数琼酯（PlateCountAgar，PCA)是用来了这些细菌，造成结果报告偏低。这也可用来解释发检测饮用水中异养菌（HeterotrophicPlateCount，生军团菌流行病时，往往不能从水样中检出侵肺军团HPC)的常用培养基，其营养含量高，历史上应用最菌（Legionellapneumophila）等致病菌的现象。广泛。但从20世纪70年代末开始，越来越多的检1.2培养基的选择性测证实，采用PCA将明显低估了异养菌的真实数由于细菌生理、生化特征的多样性、没有哪种培量，根据PCA计数结果来评价水处理的有效性及管养基可将水样中的存活细菌全部检出，每种培养基网的清洁、卫生程度并不可靠，饮用水的致病风险很都趋向于只计数适应该种营养条件的一类细菌。如可能较预期高得多。提高检测技术的灵敏度，获得果某种培养基的选择性弱，则其可检出更大量的细尽可能高的计数仍应视为饮用水微生物学研究的重菌。要内容。用目前可利用的几种培养基检测相同水样，计1HPC结果偏低的原因分析数结果往往有显著差异，表明这些培养基都具有较PCA等培养基可能只检出了水样细菌总数中强的选择性。此外，由于对出厂水或管网水进行了很少的一部分，其他未检出细菌根本就不能在检测消毒处理，只有少数优势种才能存活、繁殖，培养基环境中生长，或者生长相对缓慢，在设定时间内不能选择对其能否被检出影响相当大，有的培养基可能形成可见菌落。根本就不支持这些优势种的生长，有的则比较正常。1.1细菌存活但不能被检出1.3培养方法的固有缺陷弧菌（Vibrio）、埃希氏菌（Eschericha）、沙门氏菌用倾倒平皿检测法，培养基平板上生长起来的（Salmonella）、气单胞菌（Aeromonas）、弯曲杆菌菌落可能起源于单个或多个细菌。如果是多个细菌（Campylobacter）、志贺氏菌（Shigella）等都被证实存团聚在一起，或者多个细菌同时粘附到某个无机或在具有生命活性但不能被培养检出。在培养基平板有机颗粒物表面，而水样前处理，主要是人工或机械上，这些细菌不能形成可见菌落，但存活直接培养表混匀，不能使团聚或粘附细菌彼此分离，则最终只能明它们具有代谢活力。显而易见，常规检测技术遗漏形成一个菌落，必然导致对总数量的低估。?1994-2014ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouse.All rightsreserved.http:/www.cnki.net
净 水 技 术 WA T E R P U R IF I C A T I ON T E C H N O L O G Y {{{舞折拿舞{ 舞! 用 R Z A 培 养 基提 高饮用 水 中细菌总数 检 出率 顾 孔珍 ’ 钱 纯 , 罗 岳平 , ( 1 . 中南大 学湘 推 医 学院 检验 系 , 湖 北 武 汉 43 0 13 ; 2 . 湖 南省 中医 学 院 附 属 第一 医 院 , 湖南 长 沙 41 0 07 3 . 湖 南省 长 沙市 自来水 公 司 , 湖 南长 沙 41 0 15 ) 摘要 对饮用水 中细 菌总数的 检测方法进行评价 , 提出 了 R Z A 培养基 的营养组成 。 对 比 检测 表 明 , 使用 R Z A 培养基 可 显著提高饮 用 水中细菌 总数 的 检 出率 。 关键词 饮用 水 细菌总数 培养基 肠 加p vor e ht e D et ce t i o n R at e o f 肠七d B a c te r i a C o un t sU ign RZ A C ul t aur l M de i um G u K o n g z h e n , Qi a n C h u n , L u o Y u e p i n g , (1 . 爪“ gn ya 八血才i ic en & 丙仪 , l ,随扮 so hut 以万 ~ i syt 刃阮功“ n 43 1〕13 , 以i似 .i2 月必砚 n P加 2龙cn ia Z以i ~ 叼狱艺ic 攫 丘人伏元 幻界艺“ 倪d 产孟〕 . 1 1」乙俩at Z刀饭刀 g 劝a 41 X( 刀7 , 以艺。 ; 3 . 0 “ 刀 名百从z 八五刀 i c i扣Z V咬J t 〔, 戈 L U kr , 汤 . , 〔关“ 刀g s h a 41 m 巧 , 以i、 ) A b s t r a e t E v a l u a t i o n o f t h e m e t h o d o f t o t a l b a e t e r i a e o u n t i n t h e d r i n k i n g w a t e r w a s m a d e , a n d t h e e o m p o s i t i o n o f t h e R Z A C u l t u r a l m e d i u m w a s r e e o m m e n d e d . W i t h t h i s R Z A C u l t u r a l m e d i u m , t h e r a t e o f t o t a l b a e t e r i a · K e y w o r d s C o u n t m a y b e im p r o v e d o b v i o u s l y . d r i n k i n g w a t e r t o t a l b a e t e r i a e o u n t e u l t u r a l m e d i u m 平 板计数 琼醋 ( P l a t e C o u n t A g a r , P C A ) 是 用来 检测饮 用 水 中 异 养 菌 ( H e t e r o t r o p h i e p l a t e C o u n t , H P )C 的常用 培养 基 , 其营 养 含量 高 , 历 史 上应 用 最 广 泛 。 但 从 20 世纪 70 年 代末 开 始 , 越 来 越 多 的检 测证 实 , 采用 P C A 将 明显 低 估 了异 养 菌 的 真 实 数 量 , 根据 P C A 计数 结果 来评 价水 处理 的 有效性 及管 网的清 洁 、 卫 生程 度并 不可 靠 , 饮 用水 的致 病风险很 可能较 预期高 得 多 。 提 高 检 测 技术 的灵 敏 度 , 获 得 尽 可能 高的计数仍应 视 为饮 用水 微生 物学 研究 的重 要 内容 。 1 H P C 结 果偏低 的原 因分析 P C A 等培 养基 可 能 只检 出 了 水 样 细 菌 总 数 中 很少 的一 部分 , 其他 未 检 出细 菌 根 本 就不 能 在 检 测 环境 中生长 , 或 者生 长相 对缓 慢 , 在设定 时间 内不能 形成 可见 菌落 。 1 . 1 细菌存 活但 不 能被检 出 弧菌 ( iV br i 。 ) 、 埃 希 氏菌 ( sE ht e ir hc a) 、 沙 门 氏菌 ( S a l、 n e l l a ) 、 气 单 胞 菌 ( A e or mo an : ) 、 弯 曲 杆 菌 ( 山 m P贝砧“ ct er ) 、 志贺 氏菌 ( S h i ge l l a) 等都 被证 实 存 在具有生命活性 但不 能被 培 养检 出 。 在 培 养基 平 板 上 , 这些细菌不 能形 成 可见 菌落 , 但 存活 直 接培 养 表 明它们具有代谢活力 。 显而 易见 , 常规 检测 技术遗 漏 了这些细菌 , 造成结果 报告偏低 。 这也 可用来解 释发 生军团 菌流行病 时 , 往往不能从水 样 中检 出侵肺军团 菌让 e g i o n e zl a p n e u mo p h i l a ) 等致病菌的现象 。 1 . 2 培养基 的选 择性 由于细 菌生理 、 生 化特征 的 多样性 、 没 有哪种 培 养基 可将水 样 中的 存活 细 菌 全 部检 出 , 每种 培 养基 都趋 向于 只计数适 应 该种 营养条 件 的一类 细菌 。 如 果 某种 培养基 的选 择 性 弱 , 则 其 可检 出更 大 量 的 细 菌 。 用 目前 可利用 的几 种 培 养基 检 测相 同水样 , 计 数 结果 往往有 显著 差 异 , 表 明这 些 培养 基 都 具 有较 强 的选 择性 。 此外 , 由 于对 出厂水 或 管 网水 进行 了 消毒 处理 , 只有 少 数优 势种 才 能 存 活 、 繁 殖 , 培养 基 选择 对 其能 否被检 出影 响 相 当大 , 有 的培 养 基可 能 根本 就 不支持 这些 优势 种 的生 长 , 有 的则 比较 正常 。 1 . 3 培 养方法 的 固有缺 陷 用倾倒平皿 检 测 法 , 培 养基 平 板 上 生 长起 来 的 菌落 可能 起源 于单个 或 多个 细菌 。 如果是 多个 细菌 团聚在一 起 , 或 者 多个 细 菌 同 时粘 附 到 某 个无 机 或 有机 颗粒 物表 面 , 而水 样前 处理 , 主要 是人 工或机 械 混匀 , 不能 使 团聚或粘 附 细菌彼 此分 离 , 则 最终 只能 形成一 个菌 落 , 必 然 导致对 总数 量 的低估
Vol.23 No.1 2004净水技术431.4细菌的胁迫受损与再生长直接计数法获得的结果往往较标准平板法高出消毒不充分或样水保存不当都可能使细菌处于2个甚至更多个数量级。亚致死的受损状态。这些结构或代谢受损的细菌不2.2改进接种方法能在含有表面活性剂的选择性培养基上生长并形成倾倒平板法虽然简单，但缺点也非常明显：（1）尽管要求将培养基的倾倒温度控制在45-46℃，然菌落。然而，进人管网后，受损细菌可能完成恢复性生长，以致管网末梢水中细菌的检出量高于出厂水。而热冲击依然存在；（2）平板表层以下的菌落生长由于表面的物理保护作用，颗粒物，包括颗粒活慢，而且不便于转种培养；（3）水样体积的限制（<性碳（GAC)，往往成为受损菌的重要载体1。种源2mL)。菌在管网内繁殖再生长，带来的不利影响包括：（1）实践表明下述两种接种方法的应用效果良好。2.2.1均勾涂布接种产生异臭异味；（2）微生物腐蚀管道内壁：（3）干扰对大肠菌的检测；(4)消毒剂残余量低或失效期间的健首先是制备具有吸附能力的于燥培养基。将15mL已灭菌培养基倒人100mm×15mm或90mm康风险，如假单胞菌（Pseudomones）、莫拉氏菌（Morarella）或黄杆菌（Flavobacterium）等的致病×15mm平皿中，翻转，42℃恒温固化24h，使水分丧失2～3g后立即使用，或用塑料袋封好在4℃储作用。环境温度、水中可生物降解有机物的含量、水存，有效期不应超过2周。如果需要当日制备并使流速度、水体浊度、管网中消毒剂残余量等控制受损用，则将25mL培养基倒人平血中，不加盖，室温（24菌的再生长程度。～26℃）下在层流通风柜内干燥，同样使水分丧失2倾倒平血检测法使细菌遭受热冲击，受损菌可能不能在检测期内修复生长，导致少计。~3g.将0.1~0.5mL水样均匀涂布到培养基表面的有机物组成广泛但含量低的培养基有利于受损方法有两种：（1）使用长200mm，直径4mm，一端菌修复生长。为更真实地检出水中细菌的数量，适45°弯曲的玻璃棒，人工将样水推开；（2）使用转台，当调整培养基组成是必要的。2提高HPC计数结果的途径将平血固定在转台上，启动旋转，前后摆动移液管（止于距边缘0.5cm处），将水样缓慢释放出来。不使用PCA培养基，用倾倒法检测水中细菌总数论采用何种方法，都要保证水样被完全吸收。的技术稳定，但由于PCA具有选择性，而且不能检均匀涂布接种法获得的结果总是不同程度地高出产色素菌，因此降低了反映真实结果的价值，需要出倾倒平皿法。尤其计数海洋细菌时，均匀涂布的改进现行方法，提高检测灵敏度。平均计数几乎为倾倒法的3倍。2.1直接计数法2.2.2滤膜计数法2.1.1扫描电镜观察计数由Taylor和Geldreich提出了用滤膜计数水中用扫描电镜计数水生细菌是有效的2，其技术细菌总数的方法4}，使用培养基命名为m-SPC,已关键有2点：（1)要能将水样中的细菌全部分离出商业化生产，可在市场上购买到。来；(2)具备区分细菌与非细菌成分的熟练技术。滤膜法的优势在于可检测大量低浊度水样，尤2.1.2荧光显微镜观察计数其适合分析洁净水（<1-10CFU/mL）。事实上，如荧光显微镜观察计数法快捷，从取样到检出只果将水样量由100mL增至300mL，细菌的检出率要20-30分钟，而且灵敏性好。操作程序是先固定明显增加。在对722个水样的检测中，若只取水样，然后用化学荧光物染色，再真空过滤到不产生100mL水样，则有259例不能检出，但将水样量增荧光的聚碳酸酯膜上，最后在荧光显微镜下观察。至300mL，则其中32%的水样有细菌有检出。吖啶橙色染料（AcridineOrange，AO）是常用在大多数情况下，滤膜法获得的计数结果高于染色物质，能与RNA和DNA反应而产生荧光。与倾倒平皿法。此外，产色素菌在滤膜上生长速度快，其他直接计数技术一样，荧光显微镜观察法不能区而且易挑出单菌落进行种类鉴定及生化分析。但分细菌种类，分析代谢活性或判断是否处于存活状是，滤膜法检测可能受滤膜质量等因素影响。态。如果由于工作经验不足，将死亡细菌、碎屑物混2.3调整培养温度和时间计在内，则会过高估计活细菌总数。有些研究将出于肠道卫生学考虑，历史上将培养细菌总数AO染色与测代谢活性的方法结合起来，如AO的环境温度控制在37℃，后来确定为35℃培养INT，提高了检测准确性。?1994-2014ChinaAcademic Journal Electronic Publishing House.All rights reserved.http:/www.cnki.net
V o l . 2 3 N o . 1 2 0 0 4 净 水 技 术 1 . 4 细菌 的胁 迫受 损与再 生 长 消毒不充 分或样 水保存 不 当都可 能使 细菌处 于 亚致死 的受损状 态 。 这些结构 或代谢受 损 的细菌不 能在含 有表 面活性剂 的选 择性 培养基 上生 长并形成 菌落 。 然而 , 进 人管 网后 , 受 损 细菌可 能完成恢复性 生长 , 以 致 管网末梢 水 中细菌 的检 出量 高 于出厂水 。 由于表面 的物理 保护作 用 , 颗粒物 , 包括 颗粒活 性碳 ( G A C ) , 往 往成 为 受损 菌 的重 要 载 体〔 ’ 〕 。 种 源 菌在管网 内繁 殖再生长 , 带 来 的 不 利影 响 包括 : ( 1) 产生异 臭异 味 ; ( 2) 微 生物腐 蚀 管道 内壁 ; (3 ) 干扰对 大肠菌 的检测 ; (4 ) 消毒剂 残余量低或 失效期 间 的健 康风 险 , 如 假 单 胞 菌 ( 尸 se u d o m on es ) 、 莫 拉 氏 菌 (M 〔 Jr a x e ll a ) 或 黄 杆 菌 ( F l a v o b a e t e r i u m ) 等 的 致 病 作用 。 环境温度 、 水 中可 生物 降解有机 物 的含量 、 水 流速度 、 水体浊度 、 管 网中消毒 剂残余量等控 制受损 菌 的再 生长程 度 。 倾倒平皿 检测 法使 细菌 遭 受 热 冲击 , 受 损 菌可 能不 能在检测期 内修复生 长 , 导致少计 。 有 机物组 成广泛 但含 量低 的培养基有 利于受损 菌修复生长 。 为更真 实地 检 出水 中 细菌 的数 量 , 适 当调 整培养基 组成是必要 的 。 2 提 高 H P C 计 数 结果的途 径 使用 P C A 培 养基 , 用倾倒 法检测 水 中细菌 总数 的技术 稳定 , 但 由于 P C A 具 有 选 择 性 , 而且 不 能检 出产色素 菌 , 因此 降低 了反 映真实结 果 的价值 , 需 要 改进现行方法 , 提 高检测 灵敏 度 。 2 . 1 直接 计数法 2 . 1 . 1 扫 描电镜 观察计 数 用扫 描 电镜 计 数水 生 细 菌 是有 效 的川 , 其技 术 关键 有 2 点 : ( 1) 要 能 将 水 样 中的 细菌 全部 分 离 出 来 ; ( 2) 具 备区分细菌 与非细 菌成 分的熟 练技 术 。 2 . 1 . 2 荧 光显微 镜观 察计数 荧光 显微镜 观察 计数法 快 捷 , 从 取样 到 检 出 只 要 20 一 30 分钟 , 而 且 灵 敏 性 好 。 操 作 程 序 是先 固定 水样 , 然后 用 化学荧光 物染 色 , 再真空 过滤 到不产生 荧光 的聚碳酸 醋膜上 , 最后 在荧光显微 镜下 观察 。 叮健橙 色染 料 ( A e r i d i n e O r a n g e , A O ) 是 常用 染 色物质 , 能与 R N A 和 D N A 反 应而 产生荧 光 。 与 其他 直接计数 技术 一 样 , 荧光显 微 镜 观 察法 不 能 区 分细菌种类 , 分析代 谢 活性 或 判断是 否 处 于存 活 状 态 。 如果 由于工作经验 不足 , 将死 亡细 菌 、 碎 屑物混 计在 内 , 则会 过 高估计 活 细 菌 总 数 。 有 些 研 究将 A O 染 色 与 测 代谢 活 性 的 方 法 结 合 起 来 , 如 A O - IN T 3j[ , 提高 了检测 准确性 。 直接 计数法获 得 的结果往 往较标 准平 板法高 出 2 个甚 至更多 个数量 级 。 2 . 2 改进 接种方 法 倾倒平 板法虽 然 简单 , 但 缺 点 也 非 常 明显 : ( 1) 尽 管要 求 将 培 养基 的倾 倒 温 度 控制 在 4 5 一 4 6 ℃ , 然 而 热冲击 依 然 存 在 ; ( 2) 平 板 表 层 以 下 的 菌 落生 长 慢 , 而且不 便 于 转 种 培 养 ; ( 3) 水 样 体 积 的 限制 ( < Z m L ) 。 实践表 明下述 两种接 种方 法 的应 用效果 良好 。 2 . 2 . 1 均 匀徐布 接种 首先是 制 备 具 有 吸 附 能 力 的干 燥 培 养 基 。 将 1 5 m L 已 灭菌培 养基 倒人 1 0 0 m m X 1 5 m m 或 9 0 m m 火 15 m m 平皿 中 , 翻转 , 4 2 ℃ 恒 温 固化 2 4 h , 使水 分 丧 失 2 ~ 3 9 后立 即使 用 , 或 用 塑料 袋 封好 在 4 ℃ 储 存 , 有效期 不应超 过 2 周 。 如果 需要 当 日制 备并使 用 , 则 将 25 m L 培养基 倒人 平皿 中 , 不 加盖 , 室 温 ( 24 ~ 2 6 ℃ ) 下 在层流 通风 柜 内干 燥 , 同样 使 水分 丧 失 2 ~ 3 9 。 将 0 . 1 ~ 0 . s m L 水样 均匀涂 布到 培养基 表面 的 方 法有 两 种 : ( 1) 使用 长 2 0 m m , 直 径 4 m m , 一 端 45 “ 弯 曲的玻璃 棒 , 人 工 将样 水 推 开 ; ( 2) 使用 转 台 , 将 平皿 固定 在 转 台上 , 启 动旋 转 , 前 后 摆 动 移 液 管 ( 止于距 边缘 0 . 5 。m 处 ) , 将水 样 缓慢 释放 出来 。 不 论 采用何 种方法 , 都要 保证水 样被 完全 吸收 。 均 匀涂布 接种法 获得 的结果 总是 不同程 度地高 出倾倒 平皿法 。 尤 其计 数 海 洋 细 菌 时 , 均 匀 涂布 的 平均计 数几乎 为倾倒 法 的 3 倍 。 2 . 2 . 2 滤膜计 数法 由 T a y lo r 和 G el d er ic h 提 出了用 滤膜计数 水 中 细菌 总数 的方 法 闭 , 使 用 培 养 基 命名 为 m 一 S P C , 已 商业 化生产 , 可在市 场上 购买 到 。 滤膜法 的优势 在 于 可 检测 大 量 低浊 度 水样 , 尤 其适 合分 析 洁 净 水 ( < 1 一 10 C F U / m L ) 。 事 实上 , 如 果将 水 样 量 由 1 0 m L 增 至 30 O m L , 细 菌 的 检 出 率 明显 增 加 。 在 对 72 2 个 水 样 的 检 测 中 , 若 只 取 10 m L 水 样 , 则 有 2 59 例 不 能 检 出 , 但 将 水 样 量 增 至 3 0 O m L , 则其 中 犯 % 的水样 有细 菌有检 出 。 在 大多数情况 下 , 滤 膜法 获 得 的计 数 结 果高 于 倾倒平 皿法 。 此外 , 产色 素菌在 滤膜上 生长速 度快 , 而且 易挑 出单 菌 落进 行 种 类 鉴 定 及 生 化 分 析 。 但 是 , 滤膜 法检测 可 能受滤膜 质量 等因素影响 。 2 . 3 调整 培养温度 和 时间 出于肠道 卫生 学 考 虑 , 历史 上 将 培 养细 菌 总数 的环 境 温 度 控 制 在 37 ℃ , 后 来 确 定 为 35 ℃ 培 养
用R2A培养基提高饮用水中细菌总数检出率4448h。大量对比实验表明，35℃肯定是最不适宜获R2A培养基适合产色素菌生长。在3～5d内，得最高菌落数的温度，计数结果不及28℃时的产色素菌可形成明显的菌落。均匀涂布法计数产色14%，20℃时的20%。鉴于细菌总数用作评价净水素菌所获得的结果比较理想。效率的价值高于其卫生学意义，很多学者费同降低表1不同培养基检测相同水样获得的结果培养温度（20℃或28℃），延长培养时间（5～7d），以细菌总数（CFU/mL)培养基/方法2d3d7d1此促使最大数量的菌落出现在计数平板或滤膜上35120400PCA/倾倒平血时细菌总数会随培养时间延长而增加。一般情况390400430PCA/均匀涂布法下，12～14d可达到最高计数，而在前6天，增长速709401700m-SPC/滤膜法34003800R2A/均匀涂布法1500率最快。对平板计数技术，最快增长发生在前2～44010002300R2A/燃膜法4d。温度越高，达到50%最高菌落数所需时间越耐氯菌在R2A培养基上生长良好。28℃培养短。如以12~14d最高值为标准，则达到50%数5～7d后，生长缓慢的耐氯菌菌落开始出现，其对量，35℃需4d，28℃带6d，20℃需8d。1.0mg/L的游离余氯的抵抗力很强。长期培养不适合开展常规检测。建议在尽可能将PCA上生长的菌落挑出，转培养到新配短的时间内完成计数，必要情况下，将已计数平板继PCA上，则有很多不能再生长。但如果将丙酮酸钠续培养，定期观察，记录最大值。以外的R2A其他组成成分双倍配制，则新的培养基2.4选用替代培养基适合分离菌株的转培养，从而有利于进行种类鉴定目前可利用的替代培养基有高、低营养成分两和生化特征研究。大类。高营养成分培养基有m-SPC培养基：低营养R2A培养基已成功地用来检测饮用水样、成分培养基有NWR1琼酯、R2A培养基、CPS培养GAC、管道内壁生物膜、污损反渗透膜内异养菌的基、DP琼脂培养基，Henrici改良培养基等。数量，在可比培养条件下，R2A计数结果总是最高3R2A培养基及其应用的，但也不排除由于地理区域差异，水中细菌种群不3.1R2A培养基的组成及配制同，R2A培养基上生成菌落数反而减少的情况。R2A培养基属于低营养类培养基，其营养成分4提高饮用水中细菌检出率的技术细节考虑较PCA广泛而含量低。组成如下：细菌总数是评价饮用水水质的常规检测项目，酵母没出物0. 5g脉陈3号或多陈0. 5gCasamino酸0. 5g葡萄粉0.5g一些技术细节的规范化处理或改进有助于提高计数可溶性淀粉0.5gK2HPO.0.38准确性，应严格按规程操作，本文不一一赞述。MgSO..7H200. 05丙酮酸钠0.3g琼酯15g1L蒸馏水参考文献配制方法：将除琼酯以外的其他成分加热溶解，LChevallierMW.et al.Disinfection ofbacteriaattached1再用固体K，HPO.或KH,PO.调节pH至7.2，然后granular activated carbon,Appl. Environ. Microbiol,,1984,48:加人琼酯煮沸至溶，分装后121℃灭菌15分钟。9183.2R2A培养基的应用2Bowden W. B,,Comparison of two direct-count techniques forR2A培养基可用于倾倒平板、均勾涂布和滤膜enumerating aquatic bacteria,Appl. Environ. Microbiol.,197739;1229检测法。由于R2A培养基能促进受损细菌的恢复3Herson D, S. and K.H. Baker,New approaches to measuring to性再生长，其在20℃下培养7d获得的最高菌落数tal bacterial populations inwater supplies,AWWA,1982,74总是高于PCA和m-SPC(表1）。从表中还可看出，537R2A均勾涂布法计数结果更高。4Taylor R. H. and E, E. Geldreich,A new membrane filter procedure for bacterial counts in potable water and swimming pool相对于PCA，细菌在R2A培养基上的生长速samples,AWWA,1979,71.402度要慢，形成的菌落要小，在48h内，准确计数困难，因而需要延长培养时间，使菌落生长得足够大，但不收稿日期：2003~3-28会或少融合生长。第一作者简介，顾孔珍，1975年11月出生，大学本科毕业，助教，主要从事医学教学与研究工作。?1994-2014China Academic Journal ElectronicPublishing House.All rights reserved.htip://www.cnki.net
用 R Z A 培养 基提 高饮用 水 中细菌 总数检 出率 48 h 。 大 量 对 比 实 验 表 明 , 3S ℃ 肯 定 是 最 不适 宜 获 得 最 高 菌 落 数 的 温 度 , 计 数 结 果 不 及 28 ℃ 时 的 14 写 , 20 ℃ 时 的 2 0 % 。 鉴 于细 菌总 数 用 作评价 净水 效率 的价值高 于其 卫生 学意 义 , 很 多学 者 赞 同降低 培养 温度 (2 0 ℃ 或 28 ℃ ) , 延 长 培养时 间 (5 一 7 d) , 以 此促 使最 大数量 的菌 落 出现 在计数 平板 或滤 膜上 。 细菌 总数会 随培 养 时间延 长而 增加 。 一 般情况 下 , 12 ~ 1 4 d 可 达 到 最 高计数 , 而在 前 6 天 , 增 长 速 率最 快 。 对 平 板 计数 技 术 , 最 快 增 长 发 生 在 前 2 一 4 d 。 温度 越 高 , 达 到 50 % 最 高 菌 落 数 所 需 时 间越 短 。 如 以 12 ~ 14 d 最 高 值 为 标 准 , 则 达 到 50 % 数 量 , 3 5 oC 需 4 d , 2 8 ℃ 需 6 d , 2 0 ℃ 需 s d 。 长期培 养不 适合 开展 常规 检测 。 建 议在 尽可 能 短 的时间 内完成 计数 , 必要 情 况下 , 将 已 计数 平板继 续培 养 , 定期 观察 , 记 录最 大值 。 2 . 4 选用替代培 养基 目前可 利用 的 替代 培养 基有 高 、 低 营养 成 分两 大类 。 高 营养成 分培 养基 有 m 一 S P C 培 养基 ; 低 营养 成分 培养基 有 N W R I 琼 醋 、 R Z A 培 养基 、 C P S 培养 基 、 D P 琼 脂培 养基 , H en ir ic 改 良培 养基 等 。 3 R ZA 培 养基及 其 应用 3 . 1 RZ A 培养基 的组 成及 配 制 R Z A 培 养基 属于 低 营养类 培养基 , 其营 养成分 较 P C A 广 泛而含 量低 。 组 成 如下 : 酵母浸 出物 0 . 5 9 脉陈 3 号或多脉 0 ` 59 C a s a m i n o 酸 0 . 5 9 葡萄糖 0 . 5 9 可溶性淀粉 0 . 5 9 K Z H P O ; 0 . 3 9 M g S O ; · 7 H Z O 0 . 0 5 丙酮酸钠 0 . 3 9 琼醋 15 9 蒸馏水 I L 配制方 法 : 将除 琼酷 以 外 的其 他成 分加 热溶解 , 再用 固体 K : H P O ` 或 K H Z P q 调节 p H 至 7 . 2 , 然 后 加人 琼醋 煮沸至 溶 , 分装后 1 21 ℃ 灭 菌 15 分钟 。 3 . 2 R ZA 培养 基 的应用 R ZA 培养基 可用 于倾倒 平 板 、 均 匀 涂 布和 滤膜 检测法 。 由于 R Z A 培 养 基 能 促 进 受 损 细 菌 的恢 复 性再 生 长 , 其在 20 ℃ 下 培 养 7 d 获得 的最 高 菌 落数 总是高 于 P C A 和 m 一 S P C ( 表 1 ) 。 从表 中还 可看 出 , R Z A 均匀 徐 布法计数结 果更高 。 相对 于 P C A , 细 菌 在 R Z A 培养 基 上 的 生 长 速 度要慢 , 形 成的 菌落要 小 , 在 4 8 h 内 , 准 确计数 困难 , 因而需 要延 长培 养时 间 , 使菌 落生 长得 足够大 , 但 不 会或少 融合生长 。 R Z A 培养 基适 合产 色素菌生 长 。 在 3 一 s d 内 , 产色 素菌 可形成 明显 的菌 落 。 均匀涂 布法 计数产 色 素菌所 获得 的结果 比较理想 。 表 1 不 同培 养基检 刚 相 同 水样获 得 的 结 果 培养基 / 方法 细 菌总数 ( C F U / m )L } 3 d { 洲溯403230 120409ō10 39(5070[4 P C A / 倾倒平皿时 P C A / 均匀涂布法 m 一 S P C /滤 膜法 R Z A / 均 匀涂布法 R Z A / 滤 膜法 些3 5 耐氯 菌在 R Z A 培 养 基 上 生 长 良好 。 2S ℃ 培 养 5一 7 d 后 , 生 长 缓 慢 的耐 氯 菌 菌 落 开 始 出 现 , 其 对 1 . o m g / L 的游离 余氯 的抵 抗力很 强 。 将 P C A 上 生 长 的 菌 落 挑 出 , 转 培 养 到 新 配 P C A 上 , 则 有很 多不能再生 长 。 但如 果 将 丙酮 酸钠 以外 的 R Z A 其他 组成成 分双 倍配 制 , 则新 的培养基 适合分 离 菌株 的转 培养 , 从 而 有 利 于进 行 种 类 鉴定 和 生化 特征 研究 。 R Z A 培 养 基 已 成 功 地 用 来 检 测 饮 用 水 样 、 G A C 、 管 道 内壁 生 物 膜 、 污 损 反 渗 透 膜 内异养 菌 的 数量 , 在可 比培 养 条 件 下 , R Z A 计 数 结果 总是 最 高 的 , 但 也不 排除 由于地理 区域 差异 , 水 中细 菌种 群不 同 , R Z A 培 养基 上生成 菌落 数反 而减少 的情 况 。 4 提 高饮 用 水 中细菌 检 出率的技 术细 节考 虑 细 菌总数是评 价 饮 用 水水 质 的常 规 检测 项 目 , 一 些技 术细节 的规 范化处 理或 改进 有助 于提高计 数 准 确性 , 应严 格按 规程操 作 , 本 文不 一一 赘述 。 参 考文 献 L e C h e v a lli e r M . W . , e t a l . , D i s i n f e e t i o n o f b a e t e r i a a t t a e h e d t o g r a n u l a r a e t i v a t e d e a r b o n , A p p l . E n v i r o n . M i e r o b i o l . , 29 8 4 , 4 8 : 9 1 8 B o w d e n W . B . , C o m p a r i s o n o f t w o d i r e e t 一 e o u n t t e e h n i q u e s f o r e n u m e r a t i n g a q u a t i e b a e t e r i a , A p p l . E n v i r o n . M i e r o b i o l . , 29 7 7 , 3 9 : 1 22 9 H e r s o n D . 5 . a n d K . H . B a k e r , N e w a p p r o a e h e s t o m e a s u r i n g t o - t a l b a e t e r i a l p o p u l a t i o n s i n w a t e r s u p p li e s , A WW A , 19 8 2 , 74 : 53 7 T a y l o r R . H . a n d E . E . G e ld r e i e h , A n e w m e m b r a n e fil t e r p r o e e - d u r e f o r b a e t e r i a l e o u n t s i n p o t a b l e w a t e r a n d s w im m i n g p o o l s a m p l e s , A W W A , 1 9 79 , 7 1 : 4 0 2 收稿 日期 : 2 0 0 3 一 3 一 2 8 第一 作者简介 : 顾孔珍 , 1 9 7 5 年 1 月 出生 , 大学本科毕业 , 助 教 , 主 要从 事医学 教学 与研究工作