香料香精化妆品2011年12月第6期综述与专论FLAVOURFRDecemher,2011,NQNCOSMETICS细菌总数快速检测技术的研究现状作者作者简介1.北京工商大学，北京市植物资源研究开发重点实验室，北京牛玉倩（1987-），女（汉），硕士，研究方100048;向：微生物检测。2.北京工商大学，化学与环境工程学院，北京100048联系电话：15210921892牛玉倩！孙宇梅？何聪芬E-mail:niuyuqian1987@163.com摘要化妆品安全问题越来越受到人们关注，化妆品微生物的快速检测显得尤为重要，但传统检测方法主要是需氧平板计数法，其操作繁项、检测周期长且灵敏度低。着重介绍几种主要应用在食品行业的细菌总数快速检测技术，包括快速测试片技术、实时定量PCR技术、酶联免疫吸附技术、传感器技术、代谢技术、色谱法等，以期为化妆品微生物的快速检测提供一些参考。关键词化妆品食品细菌总数快速检测技术微生物Research Status of Rapid Detection Technology of Total BacteriaNIUYuqian! SUNYumei?HECongfen!(1.BeijingKeyLaboratoryof PlantResourcesResearchand Development,Beijing TechnologyandBusiness University, Beijing 100048, China; 2.School of Chemical Engineering, Beijing Technology &.Busi-nessUniversity,Beijing100048,China)AbstractWith more and more people concerning about the safety of cosmetics,rapid microbial detection is becoming particu-larly important.However, the traditional method is aerobic plate count,it has the characteristics of tedious operation, long de-tection cycle and low sensitivity. Several rapid detection technologies of total bacteria which were mainly applied in the food in-dustry were introduced, such as petrifilm, rea-time quantitative PCR, enzyme-linked fluorescent immunoassay, biosensor.metabology technique, chromatographic method and so on.And the prospect of detection technology was looked forward.Keywords:cosmeticsfoodtotalbacteria rapiddetectiontechnologymicrobe化妆品是人们日常生活中的常用品，因为其成近年来，随着生物技术的快速发展，一些新技分中含有丰富的蛋白质、脂肪、多种维生素、无机盐术、新方法在食品微生物检测领域得到了广泛应和水分等，所以极利于微生物的生长和繁殖。2007用，有效地提高了检测效率和检验速度。这些方法包括快速测试片技术、分子生物学技术、免疫学技版《化妆品卫生规范》中规定：化妆品的微生物学质术、传感器技术、代谢技术、SimplateTM全平器计数量应符合下列规定，眼部化妆品及口唇等粘膜用化法、色谱法等，与平板计数法相比，这些方法在精确妆品以及婴儿和儿童用化妆品菌落总数不得大于度、敏感性、检测速度等方面都有了较大的提高。500CFU/mL或500CFU/g，其它化妆品菌落总数本文对目前现有的微生物检测技术进行综述，旨在不得大于1000CFU/mL或1000CFU/g。目前，为化妆品微生物的快速检测提供一些参考。化妆品中菌落总数的检测普遍采用需氧平板计数快速测试片技术1法，这种方法整个过程操作繁琐，检测周期长而且快速测试片是指以纸片、纸膜、胶片等作为培灵敏度相对较低，这就需要建立一些快速、稳定、灵养基载体，将特定的培养基和显色物质附着在上敏的化妆品微生物检测方法。面，通过微生物在上面的生长、显色来测定食品中收稿日期：2011-06-22微生物的方法]。www.ffc-journal.com 51 -21994-2014 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved.http:/www.cnki.net
香料香精化妆品 ２０１１年１２月第６期 ＦＬＡＶＯＵＲＦＲＡＧＲＡＮＣＥＣＯＳＭＥＴＩＣＳ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ，２０１１，ＮＯ．６ 综述与专论 ｗｗｗ．ｆｆｃ－ｊｏｕｒｎａｌ．ｃｏｍ 细菌总数快速检测技术的研究现状 作 者 １．北京工商大学，北京市植物资源研究开发重点实验室，北京 １０００４８； ２．北京工商大学，化学与环境工程学院，北京 １０００４８ . 牛玉倩１ 孙宇梅２ 何聪芬１ 作 者 简 介 牛玉倩 （１９８７－），女 （汉），硕 士，研 究 方 向：微生物检测。 联系电话：１５２１０９２１８９２ Ｅ－ｍａｉｌ：ｎｉｕｙｕｑｉａｎ１９８７＠１６３．ｃｏｍ 摘 要 化妆品安全问题越来越受到人们关注，化妆品微生物的快速检测显得尤为重要，但传统检测方法主要是需氧平板计数法，其 操作繁琐、检测周期长且灵敏度低。着重介绍几种主要应用在食品行业的细菌总数快速检测技术，包括快速测试片技术、实时定 量ＰＣＲ技术、酶联免疫吸附技术、传感器技术、代谢技术、色谱法等，以期为化妆品微生物的快速检测提供一些参考。 关键词 化妆品 食品 细菌总数 快速检测技术 微生物 ＲｅｓｅａｒｃｈＳｔａｔｕｓｏｆＲａｐｉｄＤｅｔｅｃｔｉｏｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙｏｆＴｏｔａｌＢａｃｔｅｒｉａ ＮＩＵＹｕｑｉａｎ１ ＳＵＮＹｕｍｅｉ２ ＨＥＣｏｎｇｆｅｎ１ （１．ＢｅｉｊｉｎｇＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＰｌａｎｔＲｅｓｏｕｒｃｅｓＲｅｓｅａｒｃｈａｎｄＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ＢｅｉｊｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙａｎｄＢｕｓｉ－ ｎｅｓｓＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００４８，Ｃｈｉｎａ；２．ＳｃｈｏｏｌｏｆＣｈｅｍｉｃａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＢｅｉｊｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ＆ Ｂｕｓｉ－ ｎｅｓｓＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００４８，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｗｉｔｈｍｏｒｅａｎｄｍｏｒｅｐｅｏｐｌｅｃｏｎｃｅｒｎｉｎｇａｂｏｕｔｔｈｅｓａｆｅｔｙｏｆｃｏｓｍｅｔｉｃｓ，ｒａｐｉｄｍｉｃｒｏｂｉａｌｄｅｔｅｃｔｉｏｎｉｓｂｅｃｏｍｉｎｇｐａｒｔｉｃｕ－ ｌａｒｌｙｉｍｐｏｒｔａｎｔ．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｔｈｅｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌｍｅｔｈｏｄｉｓａｅｒｏｂｉｃｐｌａｔｅｃｏｕｎｔ，ｉｔｈａｓｔｈｅｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆｔｅｄｉｏｕｓｏｐｅｒａｔｉｏｎ，ｌｏｎｇｄｅ－ ｔｅｃｔｉｏｎｃｙｃｌｅａｎｄｌｏｗｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ．Ｓｅｖｅｒａｌｒａｐｉｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓｏｆｔｏｔａｌｂａｃｔｅｒｉａｗｈｉｃｈｗｅｒｅｍａｉｎｌｙａｐｐｌｉｅｄｉｎｔｈｅｆｏｏｄｉｎ－ ｄｕｓｔｒｙｗｅｒｅｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ，ｓｕｃｈａｓｐｅｔｒｉｆｉｌｍ，ｒｅａｌ－ｔｉｍｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲ，ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ， ｍｅｔａｂｏｌｏｇｙｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃｍｅｔｈｏｄａｎｄｓｏｏｎ．Ａｎｄｔｈｅｐｒｏｓｐｅｃｔｏｆｄｅｔｅｃｔｉｏｎｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｗａｓｌｏｏｋｅｄｆｏｒｗａｒｄ． Ｋｅｙｗｏｒｄｓ： ｃｏｓｍｅｔｉｃｓ ｆｏｏｄ ｔｏｔａｌｂａｃｔｅｒｉａ ｒａｐｉｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｍｉｃｒｏｂｅ 收稿日期：２０１１－０６－２２ 化妆品是人们日常生活中的常用品，因为其成 分中含有丰富的蛋白质、脂肪、多种维生素、无机盐 和水分等，所以极利于微生物的生长和繁殖。２００７ 版《化妆品卫生规范》中规定：化妆品的微生物学质 量应符合下列规定，眼部化妆品及口唇等粘膜用化 妆品以及婴儿和儿童用化妆品菌落总数不得大于 ５００ＣＦＵ／ｍＬ或５００ＣＦＵ／ｇ，其它化妆品菌落总数 不得大于１０００ＣＦＵ／ｍＬ 或１０００ＣＦＵ／ｇ。目前， 化妆品中菌落总数的检测普遍采用需氧平板计数 法，这种方法 整 个 过 程 操 作 繁 琐，检 测 周 期 长 而 且 灵敏度相对较低，这就需要建立一些快速、稳定、灵 敏的化妆品微生物检测方法。 近年来，随 着 生 物 技 术 的 快 速 发 展，一 些 新 技 术、新方 法 在 食 品 微 生 物 检 测 领 域 得 到 了 广 泛 应 用，有效地提高了检测效率和检验速度。这些方法 包括快速测 试 片 技 术、分 子 生 物 学 技 术、免 疫 学 技 术、传感器 技 术、代 谢 技 术、ＳｉｍｐｌａｔｅＴＭ 全 平 器 计 数 法、色谱法等，与平板计数法相比，这些方法在精确 度、敏感 性、检测速度等方 面都有了较大的提高。 本文对目前现有的微生物检测技术进行综述，旨在 为化妆品微生物的快速检测提供一些参考。 １ 快速测试片技术 快速测试 片 是 指 以 纸 片、纸 膜、胶 片 等 作 为 培 养基载 体，将 特 定 的 培 养 基 和 显 色 物 质 附 着 在 上 面，通过微生 物 在 上 面 的 生 长、显 色 来 测 定 食 品 中 微生物的方法［１］。 — １５ —
香料香精化妆品2011年12月第6期综述与专论FLAVOUR FRAGRANCE COSMETICSDecember,2011,NO 61.1以滤纸为载体的测试片反应，生成抗体（抗原）-待测抗原（抗体）酶标记抗其原理是细菌代谢过程中，在脱氢酶的催化下，体（抗原）的复合物，最后再与该酶的底物反应生成通过生物氧化获得能量，并将供氢体的氢脱下传递至有色产物，通过定性或定量分析有色产物量即可确受氢体，以2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC)作为受氢定样品中待测物质含量。由于酶的催化效率很高，体，TTC接受氢后生成红色非溶解性产物一三苯间接地放大了免疫反应的结果，使测定具有极高的甲酯，指示菌落存在。实验时，以与TTC结合的滤纸灵敏度。抗体抗原反应所特有的专一性和敏感性为载体，TTC用于菌落纸片计数，纪淑娟、曹杨]通使得样品在未经分离提取的情况下即可进行检测过研究和对纸片制备工艺条件的优化，制得可直接用分析，对于被检细菌而言则不需要纯培养，只要存于检测牛奶中菌落总数的测试片，该测试片能在18h在于增菌培养基中即可检出，而一般的化学分析都必须经过分离提取、纯培养等复杂过程。杨静等测得菌落总数，检测结果与国家标准方法相符。1.2以Petrifilm为载体的测试片人用沙门氏菌的特异性单克隆抗体CB8和de7建美国3M公司的Petrifilm系列测试片，由上下立了检测沙门氏菌的直接ELISA方法，目前已成功两层薄膜组成，下层的聚乙烯薄膜上印有网格并且应用于蛋品、鲜奶、肉制品中沙门氏菌的检测，其与覆盖有细菌繁殖所需的培养基，其中加入染色剂、传统方法相比较，敏感性和特异性均达到理想效果。4传感器技术显色剂，增强菌落的目视效果；上层是聚丙烯薄膜并加入冷水可溶凝胶。其使用方法为：揭起覆盖的生物传感器是利用生物活性物质（即生物元胶片，将1mL样品滴加于纸片中央后盖回，用压板件）做敏感器件，配以适当的换能器（即信号传导轻轻压下，使样品均匀地覆盖于培养基上。静置约器）所构成的分析检测工具。根据生物活性物质不1min使培养基中的凝胶固化。然后37℃培养同，可分为酶生物传感器、微生物生物传感器、DNA（48土3）h，阳性菌落在测试片上为红色或粉红色，生物传感器和免疫生物传感器。4.1酶生物传感器与测试片底色有较大反差，容易判别计数，最适宜酶生物传感器是生物传感器的先驱，其特点是计数范围是每张测试片25～250个菌落。采用纸片法对消毒奶、酸奶、乳酸饮品、黄油、冰淇淋、脱脂奶高度专一性，但价格昂贵，稳定性差。在检测病原粉、奶酪、生奶等十余种奶制品进行检测，统计学微生物方面，AHoszowski8以碱性磷酸酶为标记数据表明与国标法相比无显著差异，纸片法检出率酶，以苯磷酸酯为底物，对沙门氏菌的检测限可达较国标法高。到1CFU/mL~5CFU/mL。2实时定量PCR(reatimePCR，RT-PCR）技术4.2微生物传感器RT-PCR是近年来发展起来的新技术，这种方用全活细胞，如细菌、酵母和真菌等这些微生法既保持了PCR技术灵敏、快速的特点，又克服了物制成的传感器称为微生物传感器。利用活微生以往PCR技术中存在的假阳性污染和不能进行准物的代谢功能检测污染物，其特点是能适应宽范围确定量的缺点[5]，还有重复性好、省力、低费用等优的pH值和温度，寿命长，价格低，但选择性差。微生物传感器最适合对发酵工业产品的测定9（如啤点。RT-PCR应用了荧光染料和探针来保证扩增的特异性，并且荧光信号的强弱同扩增产物的量成正酒中乙醇的测定），其原理基本上都是用适合的微生物电极与氧电极组成，利用膜上的微生物同化作比，从而准确定量。该技术在基因突变的检测、基因表达的研究、微生物的检测等领域均有重要的应用耗氧，通过测量氧电极电流的变化量来测量氧气用价值。刘仲敏等[6]根据GenBank数据库单增李的减少量，从而达到测量底物浓度的目的。在病原斯特菌的O基因序列（AF253320）设计引物，建立微生物的检测中，蔡豪斌等10将微生物活细胞新陈了一种快速检测食源性单增李斯特菌的RT-PCR代谢产生的电子转移转换为传感器的电流输出，研方法，该法灵敏度高，从加样到得到结果只需要2h究了传感器对大肠杆菌、啤酒酵母、霍乱弧菌及卡左右，大大缩短了检出时间。介菌苗的响应，并实际测量了发酵罐中啤酒酵母菌3酶联免疫吸附技术（ELISA)总数及鲜牛奶中的细菌总数，取得较好的结果。4.3免疫传感器ELISA技术（enzyme-linkedfluorescentimmurnoassay，全称荧光酶标免疫分析）的原理是用固相免疫传感器是利用生物体内抗体和抗原专一载体吸附抗体（抗原），加待测抗原（抗体），再与相性结合从而导致电化学变化的新型传感器。其工应的酶标记抗体（抗原）进行抗原抗体的特异免疫作原理是：在固相载体上固定抗体，再通过夹心法www.ffc-journal.com—52—21994-2014 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved.http:/www.cnki.net
综述与专论 香料香精化妆品 ２０１１年１２月第６期 ＦＬＡＶＯＵＲＦＲＡＧＲＡＮＣＥＣＯＳＭＥＴＩＣＳ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ，２０１１，ＮＯ．６ ｗｗｗ．ｆｆｃ－ｊｏｕｒｎａｌ．ｃｏｍ １．１ 以滤纸为载体的测试片 其原理是细菌代谢过程中，在脱氢酶的催化下， 通过生物氧化获得能量，并将供氢体的氢脱下传递至 受氢体，以２，３，５－氯化三苯基四氮唑（ＴＴＣ）作为受氢 体，ＴＴＣ接受氢后生成红色非溶解性产物———三苯 甲酯，指示菌落存在。实验时，以与 ＴＴＣ结合的滤纸 为载体，ＴＴＣ 用于菌落纸片计数，纪淑娟、曹杨［２］通 过研究和对纸片制备工艺条件的优化，制得可直接用 于检测牛奶中菌落总数的测试片，该测试片能在１８ｈ 测得菌落总数，检测结果与国家标准方法相符。 １．２ 以 Ｐｅｔｒｉｆｉｌｍ 为载体的测试片 美国３Ｍ 公司的 Ｐｅｔｒｉｆｉｌｍ 系列测试片，由上下 两层薄膜组成，下层的聚乙烯薄膜上印有网格并且 覆盖有细菌 繁 殖 所 需 的 培 养 基，其 中 加 入 染 色 剂、 显色剂，增强 菌 落 的 目 视 效 果；上 层 是 聚 丙 烯 薄 膜 并加入冷水可溶凝胶。其使用方法为：揭起覆盖的 胶片，将１ｍＬ 样品滴加于纸片中央后盖回，用压板 轻轻压下，使样品均匀地覆盖于培养基上。静置约 １ｍｉｎ 使培养基中的凝胶固化［３］。然后３７ ℃培 养 （４８±３）ｈ，阳 性 菌 落 在 测 试 片 上 为 红 色 或 粉 红 色， 与测试片底 色 有 较 大 反 差，容 易 判 别 计 数，最 适 宜 计数范围是每张测试片２５～２５０个菌落。采用纸片 法对消毒奶、酸奶、乳酸饮品、黄油、冰淇淋、脱脂奶 粉、奶酪、生奶等十余种奶制品进行检测［４］，统计学 数据表明与国标法相比无显著差异，纸片法检出率 较国标法高。 ２ 实时定量ＰＣＲ（ｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲ，ＲＴ－ＰＣＲ）技术 ＲＴ－ＰＣＲ是近年来 发 展 起 来 的 新 技 术，这 种 方 法既保持了 ＰＣＲ 技术灵敏、快速的特点，又克服了 以往 ＰＣＲ 技术中存在的假阳性污染和不能进行准 确定量的缺点［５］，还有重复性好、省力、低费用等优 点。ＲＴ－ＰＣＲ应用了荧光染料和探针来保证扩增的 特异性，并且荧光信号的强弱同扩增产物的量成正 比，从而准 确 定 量。该 技 术 在 基 因 突 变 的 检 测、基 因表达的研究、微生物的检测等领域均有重要的应 用价值。刘仲 敏 等［６］根 据 ＧｅｎＢａｎｋ数 据 库 单 增 李 斯特菌的 Ｏ 基 因 序 列（ＡＦ２５３３２０）设 计 引 物，建 立 了一种快 速 检 测 食 源 性 单 增 李 斯 特 菌 的 ＲＴ－ＰＣＲ 方法，该法灵敏度高，从加样到得到结果只需要２ｈ 左右，大大缩短了检出时间。 ３ 酶联免疫吸附技术（ＥＬＩＳＡ） ＥＬＩＳＡ 技术（ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｉｍｍｕ－ ｎｏａｓｓａｙ，全称荧光 酶 标 免 疫 分 析）的 原 理 是 用 固 相 载体吸附 抗 体（抗 原），加 待 测 抗 原（抗 体），再 与 相 应的酶标 记 抗 体（抗 原）进 行 抗 原 抗 体 的 特 异 免 疫 反应，生成抗体（抗原）－待测抗原（抗体）－酶标记抗 体（抗原）的复合物，最后再与该酶的底物反应生成 有色产物，通过定性或定量分析有色产物量即可确 定样品中待测物质含量。由于酶的催化效率很高， 间接地放大了免疫反应的结果，使测定具有极高的 灵敏度。抗 体 抗 原 反 应 所 特 有 的 专 一 性 和 敏 感 性 使得样品在 未 经 分 离 提 取 的 情 况 下 即 可 进 行 检 测 分析，对于被 检 细 菌 而 言 则 不 需 要 纯 培 养，只 要 存 在于增菌培养基中即可检出，而一般的化学分析都 必须经过分离提取、纯培养等复杂过程。杨 静 等［７］ 人用沙门氏菌 的 特 异 性 单 克 隆 抗 体 ＣＢ８和 ｄｅ７建 立了检测沙门氏菌的直接 ＥＬＩＳＡ 方法，目前已成功 应用于蛋品、鲜奶、肉制品中沙门氏菌的检测，其与 传统方法相比较，敏感性和特异性均达到理想效果。 ４ 传感器技术 生物传感器是利用生物 活性物质 （即 生 物 元 件）做敏 感 器 件，配 以 适 当 的 换 能 器（即 信 号 传 导 器）所构成的分析检测工具。根据生物活性物质不 同，可分为酶生物传感器、微生物生物传感器、ＤＮＡ 生物传感器和免疫生物传感器。 ４．１ 酶生物传感器 酶生物传感器是生物传感器的先驱，其特点是 高度专一 性，但 价 格 昂 贵，稳 定 性 差。在 检 测 病 原 微生物方面，Ａ．Ｈｏｓｚｏｗｓｋｉ［８］以碱性磷酸酶为标记 酶，以苯磷酸 酯 为 底 物，对 沙 门 氏 菌 的 检 测 限 可 达 到１ＣＦＵ／ｍＬ～５ＣＦＵ／ｍＬ。 ４．２ 微生物传感器 用全活细 胞，如 细 菌、酵 母 和 真 菌 等 这 些 微 生 物制成的 传 感 器 称 为 微 生 物 传 感 器。利 用 活 微 生 物的代谢功能检测污染物，其特点是能适应宽范围 的ｐＨ 值和温度，寿 命 长，价 格 低，但 选 择 性 差。微 生物传感器最适合对发酵工业产品的测定［９］（如啤 酒中乙醇 的 测 定），其 原 理 基 本 上 都 是 用 适 合 的 微 生物电极与氧电极组成，利用膜上的微生物同化作 用耗氧，通过测量氧电极电流的变化量来测量氧气 的减少量，从而达到测量底物浓度的目的。在病原 微生物的检测中，蔡豪斌等［１０］将微生物活细胞新陈 代谢产生的电子转移转换为传感器的电流输出，研 究了传感器 对 大 肠 杆 菌、啤 酒 酵 母、霍 乱 弧 菌 及 卡 介菌苗的响应，并实际测量了发酵罐中啤酒酵母菌 总数及鲜牛奶中的细菌总数，取得较好的结果。 ４．３ 免疫传感器 免疫传感 器 是 利 用 生 物 体 内 抗 体 和 抗 原 专 一 性结合从 而 导 致 电 化 学 变 化 的 新 型 传 感 器。其 工 作原理是：在 固 相 载 体 上 固 定 抗 体，再 通 过 夹 心 法 — ２５ —
香料香精化妆品2011年12月第6期综述与专论FLAVOUR FRAGRANCE COSMETICSDecember,2011,NQ结合测定抗原与酶标抗体，由标记酶催化的化学反放射测量技术是利用细菌在生长繁殖过程中应，反应产物在电化学电极上再发生氧化还原，从代谢碳水化合物而产生CO2的原理。把微量的放射而形成可检测的电流信号。Byung-Keuntil等基于性"C标记引入碳水化合物分子中，在细菌生长时，表面等离子共振技术研制出相应的免疫传感器，利这些底物被利用并释放出含放射性的CO2，然后通用统基十一酸自组装单分子层之间的化学绑定将G过自动化放射测定仪Bactec测量14COz的含量，从蛋白固定到金表面，随后G蛋白依次与抗体和抗原而判断细菌的数量。这一方法已用于测定食品中结合，当采用G蛋白附加吐温-20时，对沙门氏菌的的细菌，具有快速、准确度高和自动化等优点[15]。检测范围可达到1×102CFU/mL~1×10%5.4微热量计技术CFU/mL。微热量计技术（Microcalorimetry）是通过测定5代谢技术细菌生长时热量的变化进行细菌的检出和鉴别。5.1ATP生物发光法[12]微生物在生长过程中产生热量，虽然产生的量很ATP生物发光技术的原理是荧光素酶（Firefly小，但仍能通过敏感的微热量计进行测量。用微热Luciferase）以D-荧光素（D-Luciferin）、三磷酸腺苷量计对微生物计数时，温谱图必须与绝对微生物细（ATP)和氧气为底物，在Mg2+存在时，将化学能转胞数呈相关性，一旦建立了参考温谱图，样品温谱化为光能，发出光量子。ATP既是荧光素酶催化发图便可与之相比较而得到微生物的绝对数量。刘永军等[16]采用该技术研究细菌的抑制作用。光的必需底物，又是所有生物生命活动的能量来源。在荧素酶催化的发光反应中，ATP在一定的浓5.5接触酶测定技术接触酶测定技术是通过计算一个含有接触酶度范围内，其浓度与发光强度呈线性关系。研究表明，各生长期的细菌均有较恒定的ATP含量水平，的纸盘在盛有HO2的试管中的漂浮时间来估计菌因此，提取细菌的ATP，利用生物发光法测出ATP数。接触酶与H，O，之间产生生化反应，放出氧气，含量后，即可推算出样品中的含菌量，整个过程仅使纸盘由试管底部浮到表面。当样品中接触酶含为十几分钟。由手生物发光法无需培养过程，操作量高时（表明接触酶阳性细菌含量高），纸盘上浮的简便、灵敏度高，在短时间内即可得到检测结果，因时间短（以秒计）。大多数腐败微生物是嗜冷性细此具有其它微生物检测方法无可比拟的优势。冯菌，而大多数嗜冷细菌接触酶呈阳性，故可以用接敏[13]用ATP发光技术测定脱水蔬菜和调味品的初触酶反应来估计样品中的嗜冷性菌群。始含菌量，发现脱水蔬菜和调味品中细菌ATP的6细菌直接计数法生物发光强度与其初始含菌量之间显著相关，从样主要包括流式细胞仪（flowcytometry，FCM）品的制备到获得ATP发光强度结果的检测过程仅和固相细胞计数（solidphasecytometry，SPC）法。需1~2h。FCM通常以激光作为发光源，经过聚焦整形后的光5.2电阻抗技术束垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光其原理是细菌在培养基内生长繁殖的过程中，束的照射下产生散射光和激发荧光。光散射信号将会使培养基中的大分子电情性物质如碳水化合基本上反映了细胞体积的大小荧光信号的强度则物、蛋白质和脂类等，代谢为具有电活性的小分子代表了所测细胞膜表面抗原的强度或其核内物质物质，如乳酸盐、醋酸盐等，这些离子态物质能增加的浓度，由此可通过仪器检测散射光信号和荧光信培养基的导电性，使培养基的阻抗发生变化，通过号来估计微生物的大小、形状和数量。流式细胞计检测培养基的电阻抗变化情况，判定细菌在培养基数具有高度的敏感性，可同时对目的菌进行定性和定量[17]。目前已经建立了细菌总数[18]、致病性沙中的生长繁殖特性，即可检测出相应的细菌。该法门菌、大肠埃希氏菌[19]等的FCM检验方法。固相目前已经用于细菌总数、霉菌、酵母菌大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等的检测。Pless等i4]分细胞计数可以在单个细胞水平上对细菌进行快速别用阻抗法和传统检测方法进行对照试验，对250检测L20]。滤过样品后，存留的微生物在滤膜上进行种食品样品进行了检测。在122种沙门氏菌阳性样荧光标记，采用激光扫描设备自动计数。每个荧光品中，用阻抗方法检出的有119种，传统的亚硒酸点可直观地由通过计算机驱动的流动台连接到盐-胱氨酸培养基检出106种，用RV培养基仅检出ChemScan上的落射荧光显微镜来检测，尤其对于92种。生长缓慢的微生物，检测用时短使该方法明显优于传统平板计数法[21]。5.3放射测量技术www.ffc-journal.com-53—21994-2014 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved.http:/www.cnki.net
香料香精化妆品 ２０１１年１２月第６期 ＦＬＡＶＯＵＲＦＲＡＧＲＡＮＣＥＣＯＳＭＥＴＩＣＳ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ，２０１１，ＮＯ．６ 综述与专论 ｗｗｗ．ｆｆｃ－ｊｏｕｒｎａｌ．ｃｏｍ 结合测定抗原与酶标抗体，由标记酶催化的化学反 应，反应产物 在 电 化 学 电 极 上 再 发 生 氧 化 还 原，从 而形成可检测的电流信号。Ｂｙｕｎｇ－Ｋｅｕｎ［１１］等基 于 表面等离子共振技术研制出相应的免疫传感器，利 用巯基十一酸自组装单分子层之间的化学绑定将 Ｇ 蛋白固定到金表面，随后 Ｇ 蛋白依次与抗体和抗原 结合，当采用 Ｇ 蛋白附加吐温－２０时，对沙门氏菌的 检 测 范 围 可 达 到 １×１０２ ＣＦＵ／ｍＬ ～１×１０９ ＣＦＵ／ｍＬ。 ５ 代谢技术 ５．１ ＡＴＰ生物发光法［１２］ ＡＴＰ生物发光技术的原理是荧光素酶（Ｆｉｒｅｆｌｙ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）以 Ｄ－荧光素（Ｄ－Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ）、三磷酸腺苷 （ＡＴＰ）和氧气为底物，在 Ｍｇ２＋ 存在时，将化学能转 化为光能，发出光量子。ＡＴＰ既是荧光素酶催化发 光的必 需 底 物，又是所有生物生命活动的 能量来 源。在荧素酶催化的发光反应中，ＡＴＰ在一定的浓 度范围内，其浓度与发光强度呈线性关系。研究表 明，各生长期的细菌均有较恒定的 ＡＴＰ含量水平， 因此，提取细菌的 ＡＴＰ，利用生物发光法测出 ＡＴＰ 含量后，即可 推 算 出 样 品 中 的 含 菌 量，整 个 过 程 仅 为十几分钟。由于生物发光法无需培养过程，操作 简便、灵敏度高，在短时间内即可得到检测结果，因 此具有其它微生物检测方法无可比拟的优势。冯 敏［１３］用 ＡＴＰ发光技术测定脱水蔬菜和调味品的初 始含菌量，发现脱水蔬菜和调味 品 中 细 菌 ＡＴＰ 的 生物发光强度与其初始含菌量之间显著相关，从样 品的制备到获得 ＡＴＰ 发光强度结果的检测过程仅 需１～２ｈ。 ５．２ 电阻抗技术 其原理是细菌在培养基内生长繁殖的过程中， 将会使培养基中的大分子电惰性物质如碳水化合 物、蛋白质和 脂 类 等，代 谢 为 具 有 电 活 性 的 小 分 子 物质，如乳酸盐、醋酸盐等，这些离子态物质能增加 培养基的导 电 性，使 培 养 基 的 阻 抗 发 生 变 化，通 过 检测培养基的电阻抗变化情况，判定细菌在培养基 中的生长繁殖特性，即可检测出相应的细菌。该法 目前已经用于细菌总数、霉菌、酵母菌大肠杆菌、沙 门氏菌、金 黄 色 葡 萄 球 菌 等 的 检 测。Ｐｌｅｓｓ等［１４］分 别用阻抗法和 传 统 检 测 方 法 进 行 对 照 试 验，对２５０ 种食品样品进行了检测。在１２２种沙门氏菌阳性样 品中，用阻抗方法检出的有１１９ 种，传 统 的 亚 硒 酸 盐－胱氨酸培养基检出１０６ 种，用 ＲＶ 培养基仅检出 ９２ 种。 ５．３ 放射测量技术 放射测量 技 术 是 利 用 细 菌 在 生 长 繁 殖 过 程 中 代谢碳水化合物而产生ＣＯ２的原理。把微量的放射 性１４Ｃ标记引入碳水化合物分子中，在细菌生长时， 这些底物被利用并释放出含放射性的 ＣＯ２，然后通 过自动 化 放 射 测 定 仪 Ｂａｃｔｅｃ测 量１４ＣＯ２的 含 量，从 而判断细 菌 的 数 量。这 一 方 法 已 用 于 测 定 食 品 中 的细菌，具有快速、准确度高和自动化等优点［１５］。 ５．４ 微热量计技术 微热量 计 技 术（Ｍｉｃｒｏｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｙ）是 通 过 测 定 细菌生 长 时 热 量 的 变 化 进 行 细 菌 的 检 出 和 鉴 别。 微生物 在 生 长 过 程 中 产 生 热 量，虽然产生的量很 小，但仍能通过敏感的微热量计进行测量。用微热 量计对微生物计数时，温谱图必须与绝对微生物细 胞数呈相关 性，一 旦 建 立 了 参 考 温 谱 图，样 品 温 谱 图便可与 之 相 比 较 而 得 到 微 生 物 的 绝 对 数 量。刘 永军等［１６］采用该技术研究细菌的抑制作用。 ５．５ 接触酶测定技术 接触酶测 定 技 术 是 通 过 计 算 一 个 含 有 接 触 酶 的纸盘在盛有 Ｈ２Ｏ２的试管中的漂浮时间来估计菌 数。接触酶与 Ｈ２Ｏ２之间产生生化反应，放出氧气， 使纸盘由 试 管 底 部 浮 到 表 面。当 样 品 中 接 触 酶 含 量高时（表明接触酶阳性细菌含量高），纸盘上浮的 时间短（以 秒 计）。大 多 数 腐 败 微 生 物 是 嗜 冷 性 细 菌，而大多数 嗜 冷 细 菌 接 触 酶 呈 阳 性，故 可 以 用 接 触酶反应来估计样品中的嗜冷性菌群。 ６ 细菌直接计数法 主要包 括 流 式 细 胞 仪（ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，ＦＣＭ） 和固相细 胞 计 数（ｓｏｌｉｄｐｈａｓｅｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，ＳＰＣ）法。 ＦＣＭ 通常以激光作为发光源，经过聚焦整形后的光 束垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光 束的照射 下 产 生 散 射 光 和 激 发 荧 光。光 散 射 信 号 基本上反映了细胞体积的大小；荧光信号的强度则 代表了所测 细 胞 膜 表 面 抗 原 的 强 度 或 其 核 内 物 质 的浓度，由此可通过仪器检测散射光信号和荧光信 号来估计微生物的大小、形状和数量。流式细胞计 数具有高度的敏感性，可同时对目的菌进行定性和 定量［１７］。目前 已 经 建 立 了 细 菌 总 数［１８］、致 病 性 沙 门菌、大肠埃希 氏 菌［１９］等 的 ＦＣＭ 检 验 方 法。固 相 细胞计数可 以 在 单 个 细 胞 水 平 上 对 细 菌 进 行 快 速 检测［２０］。滤过样品后，存留的微生物在滤膜上进行 荧光标记，采用激光扫描设备自动计数。每个荧光 点可直观地由通过计 算机驱动的流动台连接到 ＣｈｅｍＳｃａｎ上的落 射 荧 光 显 微 镜 来 检 测，尤 其 对 于 生长缓慢的微生物，检测用时短使该方法明显优于 传统平板计数法［２１］。 — ３５ —
香料香精化妆品品2011年12月第6期综述与专论FLAVOUR FRAGRANCE COSMETICSDecember,2011,N 67SimplateTM全平器计数法其中气相色谱应用较多，该方法简单快速。其原理SimplateTM全平器市售品有2种型号，普通型是将微生物细胞经过水解、甲醇分解、提取以及硅能计数至738（内含等分的84个培养小池），超大型烷化、甲基化等衍生化处理后，使之分离尽可能多能计数至1659（内含等分的198个培养小池）。此的化学组分供气相色谱仪进行分析。不同的微生方法最大特点是快速、准确，在24h内可完成检测。物所得到的色谱图中，通常大多数的峰是共性的，Townsend(22)用此法对奶、奶制品、肉制品、水果、蔬只有少数的峰具有特征性，可被用来进行微生物鉴定，分析检测各种常见细菌、酵母菌、霉菌等[24]。顶菜、甜食、调味品等进行检测，其结果与需氧平板计数法相比，相关系数为0.95，敏感性为96%；陈空气相色谱法也已广泛应用，通过检测培养基或食森[23]将此法用于脱脂奶、胡椒、消毒奶、婴儿奶粉、品密封系统顶部的微生物挥发性代谢产物CO2，来汉堡牛排、牛奶巧克力、苹果汁、罐头等15类不同的分析和鉴定微生物，特别是用于分析食品中的酵母加工食品和食品原材料，同时作对比试验。结果与菌、霉菌、大肠菌群和乳酸菌的污染程度，以及对沙国标法比较，相关系数为0.96，具有较高的符合率。门氏菌的筛选，这对评价食品品质和安全性具有非常重要的意义[25]。8色谱法气相色谱和高效液相色谱的分析应用到微生9讨论与展望物的检测中，主要是依据不同微生物的化学组成或随着现代科技的发展，可以预料在不远的将来，其产生的代谢产物各异，利用上述色谱检测可直接传统的化妆品微生物检测技术将逐渐被各种新型简分析各种体液中的细菌代谢产物、细胞中的脂肪便的微生物快速诊断技术所取代。现有的微生物快酸、蛋白质、氨基酸、多肽、多糖等，以确定病原微生速检测技术各自都表现出很多优点，但也还存在着不物的特异性化学标志成分，协助病原诊断和检测。足。表1对几种细菌总数检测技术进行了比较。表1几种细菌总数检测技术的比较细菌总数化妆品方面原理优点缺点应用领域检测技术的应用样品中的菌经过培养后在培养基成本低,准确性较高涉及的实验较多、操作有传统方法食品、环境、医学等领域上会长成可点数的菌落繁项、需要时间较长以纸片等作为培养基载体，将特减少试验前制备培养基等快速测试片定的培养基和显色物质附着在上无大量的准备工作，减少工作车检测时间较长食品检测领域技术面，通过微生物在上面的生长显量，提高工作效率色来测定应用荧光染料和探针来保证扩增实时定量的特异性，并且荧光信号的强弱操作简单，灵敏度高，检测结果容易出现假阳性、食品检测、环境监测、疾无PCR成本较高同扩增产物的量成正比，从而准时间短病诊断等领域确定量用固相载体吸附抗体（抗原），加待测抗原（抗体），再与相应的酶标记抗体（抗原）进行抗原抗体特可以迅速得到结果，同时可特异性还不够高，有时食品检测、医学诊断、环酶联免疫无异免疫反应，生成复合物，最后再以实现自动化、商品化，费会出现交叉反应，导致吸附技术境监测领域与该酶的底物反应生成有色产用相对较低假阳性物，通过分析有色产物的量即可确定待测物质含量样品通过扩散作用进入分子识别元件，经分子识别与分子识别元疾病诊断、环境监测、发传感器件发生特异性结合，反应产生的灵敏度不够、容易受杂无检测准确、操作简单酵工业、食品检测、医学技术质干扰生物学信息通过信号转换器转化保健等领城为光信号或电信号，再通过仪表的放大和输出，即达到检测的目的细菌在生长过程中会产生多种物操作简便、灵敏度高，在短成本较高，且实验结果有代谢技术质，通过检测这些物质的含量就食品、环境及化妆品领域时间内即可得到检测结果易受周围介质的影响能判断出细菌的数量将样品中的菌染色，通过激光照灵敏度高、检测用时短、准 检测仪器品贵，一般基细菌直接无射使其发射荧光，通过捕获荧光食品、医学等领域计数法确度高层单位不能采用计算细菌总数54www.ffc-journal.com21994-2014 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved.http://www.cnki.net
综述与专论 香料香精化妆品 ２０１１年１２月第６期 ＦＬＡＶＯＵＲＦＲＡＧＲＡＮＣＥＣＯＳＭＥＴＩＣＳ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ，２０１１，ＮＯ．６ ｗｗｗ．ｆｆｃ－ｊｏｕｒｎａｌ．ｃｏｍ ７ ＳｉｍｐｌａｔｅＴＭ全平器计数法 ＳｉｍｐｌａｔｅＴＭ全 平 器 市 售 品 有２种 型 号，普 通 型 能计数至７３８（内含等分的８４个培养小池），超大型 能计数至１６５９（内含等分的１９８个培养小池）。此 方法最大特点是快速、准确，在２４ｈ 内可完成检测。 Ｔｏｗｎｓｅｎｄ［２２］用此法对奶、奶制品、肉制品、水果、蔬 菜、甜食、调味品等进行检测，其结果与需氧平板计 数法 相 比，相 关 系 数 为 ０．９５，敏 感 性 为 ９６％；陈 森［２３］将此法用 于 脱 脂 奶、胡 椒、消 毒 奶、婴 儿 奶 粉、 汉堡牛排、牛奶巧克力、苹果汁、罐头等１５类不同的 加工食品和食品原材料，同时作对比试验。结果与 国标法比较，相关系数为０．９６，具有较高的符合率。 ８ 色谱法 气相色谱 和 高 效 液 相 色 谱 的 分 析 应 用 到 微 生 物的检测中，主要是依据不同微生物的化学组成或 其产生的代谢产物各异，利用上述色谱检测可直接 分析各 种 体 液 中 的 细 菌 代 谢 产 物、细 胞 中 的 脂 肪 酸、蛋白质、氨基酸、多肽、多糖等，以确定病原微生 物的特异性 化 学 标 志 成 分，协 助 病 原 诊 断 和 检 测。 其中气相色谱应用较多，该方法简单快速。其原理 是将微生物 细 胞 经 过 水 解、甲 醇 分 解、提 取 以 及 硅 烷化、甲基化 等 衍 生 化 处 理 后，使 之 分 离 尽 可 能 多 的化学组 分 供 气 相 色 谱 仪 进 行 分 析。不 同 的 微 生 物所得到的 色 谱 图 中，通 常 大 多 数 的 峰 是 共 性 的， 只有少数的峰具有特征性，可被用来进行微生物鉴 定，分析检测各种常见细菌、酵母菌、霉菌等［２４］。顶 空气相色谱法也已广泛应用，通过检测培养基或食 品密封系统顶部的微生物挥发性代谢产物 ＣＯ２，来 分析和鉴定微生物，特别是用于分析食品中的酵母 菌、霉菌、大肠菌群和乳酸菌的污染程度，以及对沙 门氏菌的筛选，这对评价食品品质和安全性具有非 常重要的意义［２５］。 ９ 讨论与展望 随着现代科技的发展，可以预料在不远的将来， 传统的化妆品微生物检测技术将逐渐被各种新型简 便的微生物快速诊断技术所取代。现有的微生物快 速检测技术各自都表现出很多优点，但也还存在着不 足。表１对几种细菌总数检测技术进行了比较。 表１ 几种细菌总数检测技术的比较 细菌总数 检测技术 原理 优点 缺点 应用领域 化妆品方面 的应用 传统方法 样品中的菌经过培养后在培养基 上会长成可点数的菌落 成本低，准确性较高 涉及的 实 验 较 多、操 作 繁琐、需要时间较长 食品、环境、医学等领域 有 快速测试片 技术 以纸片 等 作 为 培 养 基 载 体，将 特 定的培养基和显色物质附着在上 面，通过 微 生 物 在 上 面 的 生 长 显 色来测定 减少试验前制备培养 基 等 大量的准备工作，减少工作 量，提高工作效率 检测时间较长 食品检测领域 无 实时定量 ＰＣＲ 应用荧光染料和探针来保证扩增 的特异 性，并 且 荧 光 信 号 的 强 弱 同扩增 产 物 的 量 成 正 比，从 而 准 确定量 操作简 单，灵 敏 度 高，检 测 时间短 结果容 易 出 现 假 阳 性、 成本较高 食品检 测、环 境 监 测、疾 病诊断等领域 无 酶联免疫 吸附技术 用固相载体吸附抗体 （抗 原），加 待测 抗 原 （抗 体），再 与 相 应 的 酶 标记抗体（抗原）进行抗原抗体特 异免疫反 应，生 成 复 合 物，最 后 再 与该 酶 的 底 物 反 应 生 成 有 色 产 物，通过 分 析 有 色 产 物 的 量 即 可 确定待测物质含量 可以迅速得到结果，同时可 以实现 自 动 化、商 品 化，费 用相对较低 特异性 还 不 够 高，有 时 会出现 交 叉 反 应，导 致 假阳性 食品检 测、医 学 诊 断、环 境监测领域 无 传感器 技术 样品通过扩散作用进入分子识别 元件，经 分 子 识 别 与 分 子 识 别 元 件发生 特 异 性 结 合，反 应 产 生 的 生物学信息通过信号转换器转化 为光信 号 或 电 信 号，再 通 过 仪 表 的放大和输出，即达到检测的目的 检测准确、操作简单 灵敏度 不 够、容 易 受 杂 质干扰 疾病诊 断、环 境 监 测、发 酵工业、食 品 检 测、医 学 保健等领域 无 代谢技术 细菌在生长过程中会产生多种物 质，通过 检 测 这 些 物 质 的 含 量 就 能判断出细菌的数量 操作简便、灵 敏 度 高，在 短 时间内即可得到检测结果 成本较 高，且 实 验 结 果 易受周围介质的影响 食品、环境及化妆品领域 有 细菌直接 计数法 将样品 中 的 菌 染 色，通 过 激 光 照 射使其 发 射 荧 光，通 过 捕 获 荧 光 计算细菌总数 灵敏度 高、检 测 用 时 短、准 确度高 检测仪 器 昂 贵，一 般 基 层单位不能采用 食品、医学等领域 无 — ４５ —
香料香精化妆品2011年12月第6期综述与专论FLAVOUR FRAGRANCE COSMETICS December,2011,NQ[10]张晖，姚惠源，姜元荣，Y-氨基丁酸的功能性及其在稻米制品通过本文的简单介绍及表1可以看出，应用快中的富集利用[.粮食与饲料工业，2004(8)：41-43.速测试片技术检测菌落总数可减少工作量，提高工[11]程永强，明媚，石波.一种新型功能性食品一发芽糙米[J].食作效率，但检测时间并没有缩短；分子生物学技术品工业科技，2003（3）：84-85.灵敏度高，检测时间短，但结果易出现假阳性或假[12]张菊梅，吴清平，李程思，等.生物发光法微生物快速检测试阴性；免疫学技术的优势在于可以迅速得到结果，剂的性质及其影响因素研究[J.微生物学通报，2006，33(3); 36-41.同时可以实现自动化、商品化，费用相对较低，缺点[13]1冯敏，高岳，吕海燕，等。ATP发光技术测定辐照前脱水蔬菜是特异性还不够高，有时会出现交叉反应，导致假和调味品的含菌量[J].核农学报，2005.19（4)：282-285.阳性；放射测量法具有快速、准确度高和自动化等[14]Pless P,Futschik K,Schopf E.Rapid detection of salmonellae优点，但是由于需用加标1C底物作培养基，增加了by means of a new impedance splitting method [JJ.Journal of操作难度；SimplateTM全平器计数法进一步简化了FoodProtection.1994.57(5):369-376.[15]Fung D Y C. What's needed in rapid detection of food borne操作，但仍需24h，且由于该法成本较高，限制了其pathogensLJ.Food Technology,1995,49(6):49.64-67.使用范围；色谱法具有快速、敏感、精确等特点，但[16]刘永军，南昭东，孙海涛，等，限制性条件下药物对细菌抑制用于菌落总数检测仍有待进一步研究。这些不足作用微量量热法研究[JT.生物工程学报，1996.12（1)：60-64还需要国内外研究者不断地完善和改进。总之，建[17]Gunasekera TS,Veal DA, Atfield PV.Potential for broad立更灵敏、更有效、更可靠、更简便的微生物检测技app lications offlow cytometry and fluorescencetechniques inmicrobiological and somatic cell analyses of milk[J].Int.J.术不仅是保证化妆品安全的道切需求，而且是微生Food Microbiol.,2003,85(3):269-279.物快速检测技术的发展趋势。[18]Gumasekera TS, Atfield PV, VealDA. A flow cytometrymethodfor rap id detection and enumeration of total bacteria in milkLJJ.参考文献Appl. Environ. Microbiol., 2000, 66(3):1 228-1 232.［1］李文勇，刁伯民.国标法和纸片法对餐具大肠菌群检测比较[19]Fuchs BM, Wallner G, BeiskerW.et al. Flow cytometric a［JI.中国国境卫生检疫杂志，1994，17（6）：360-361nalysis of the in situ accessibility of Escherichia coli 16S[2]纪淑娟，曹杨.牛奶中菌落总数检测纸片研制及检测效果研究rRNAfor fluorescentlylabeledoligonucleotideprobesJ].[J.中国酿造，2009（2）：144-147Appl.Environ.Microbiol.1998,64(12):4973-4982.[3]吴清平，孙永，蔡芷荷，等.快速测试片在食品微生物检测中的[20]LisleJT,Hamilton MA,WillseAR,et al.Comparison of应用[J.中国卫生检验杂志，2006，16（5）：635-637fluorescence microscopy and solid2phase cytometry methods[4]唐滑灵，吴翊.Petrifilm纸片法和国标法检测奶制品细菌总forcounting bacteriain waterEJ.Appl.Environ.Microbi-数和大肠菌群数［J.中国卫生检验杂志，2000，10（3）ol.,2004,70(9):5343-5348.325-327.[21]王晓英，固相细胞计数法一种快速检测单细胞细菌的食品微[5]张立国，张琚。实时定量PCR技术的介绍[J].生物技术，生物新检测方法LJ].国外医学卫生学分册，2003，30（3）：2003,13(2);3940.183-186.[6]刘仲敏，郑鸣。单增李斯特菌的实时定量PCR检测LJJ.食品[22]王新为。水和食品中卫生细菌的快速检验研究进展J.中国与发酵工业，2007，33(5)：100-104.公共卫生，2000.16（8)：748.[7]杨静，焦新安，等.沙门氏菌属特异性单克隆抗体在快速检测[23]陈森.测定细菌总数的新方法一SimplateTM全平血计数法中的应用［J].中国卫生检验杂志，1997，7（3）：136-139[J7.中国卫生检验杂志，1999.9（6）：425-427A.Hoszowski.Rapid detection and enumeration of Salmonel-［8][24]唐春林，车振明.食品微生物快速检测技术研究进展[J.食品la in chicken carcass rinses using filtration, enrichment and科技，2007（9）：42-44colony blot immunoassayLJ.International Journal of Food[25]Gardinia F,Lanciottib R,Sinigagliab M, et al.A head spaceMicrobiology+1996,28(3):341-350gas chromatographic approach for the monitoring of the mi-[9]陈志刚，顾振新，汪志君，等，糙米的营养成分及其在发芽过crobial cellactivity and the cell viability evaluationLJ]. Journal程中的变化EJ门.南京农业大学学报，2003，26（3）：84-87of microbiological methods,1997,29(2):103-114.国内行业简讯2011年第四季度初，嘉兴中华化工公司最新研发的第三代香兰素生产技术，正从小试进入中试阶段，公司总工、上海香研所前所长毛海舫为此而奔忙、投入。为了这一工艺，中华化工累计投入了3亿元的费用。福建省唯一一家天然单体香料生产企业、将乐县科利达香料香精有限公司，自去年作技改后，通过技术创新，不断改进工艺，在节省原料的同时提高产品质量和产量，优质精油年产量自去年的1000吨增加至3000吨，产值达5000万元，产品全部向美国的香精公司出口。科利达公司主产杉木精油。浙江磐安县天蓝香料有限公司大量收购当地云山产特色香料鸢尾，浸提深、浅色鸢尾浸膏，已打入国际市场。www.ffc-journal.com 55 —21994-2014 China Academic Journal Electronic Publishing House, All rights reserved.http://www.cnki.net
香料香精化妆品 ２０１１年１２月第６期 ＦＬＡＶＯＵＲＦＲＡＧＲＡＮＣＥＣＯＳＭＥＴＩＣＳ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ，２０１１，ＮＯ．６ 综述与专论 ｗｗｗ．ｆｆｃ－ｊｏｕｒｎａｌ．ｃｏｍ 通过本文的简单介绍及表１可以看出，应用快 速测试片技术检测菌落总数可减少工作量，提高工 作效率，但检 测 时 间 并 没 有 缩 短；分 子 生 物 学 技 术 灵敏度高，检 测 时 间 短，但 结 果 易 出 现 假 阳 性 或 假 阴性；免疫 学 技 术 的 优 势 在 于 可 以 迅 速 得 到 结 果， 同时可以实现自动化、商品化，费用相对较低，缺点 是特异性还 不 够 高，有 时 会 出 现 交 叉 反 应，导 致 假 阳性；放射测 量 法 具 有 快 速、准 确 度 高 和 自 动 化 等 优点，但是由于需用加标１４Ｃ底物作培养基，增加了 操作难度；ＳｉｍｐｌａｔｅＴＭ 全 平 器 计 数 法 进 一 步 简 化 了 操作，但仍需２４ｈ，且由于该法成本较高，限制了其 使用范围；色 谱 法 具 有 快 速、敏 感、精 确 等 特 点，但 用于菌落总数检测仍有待进一步研究。这 些 不 足 还需要国内外研究者不断地完善和改进。总之，建 立更灵敏、更有效、更可靠、更简便的微生物检测技 术不仅是保证化妆品安全的迫切需求，而且是微生 物快速检测技术的发展趋势。 参考文献 ［１］ 李文勇，刁伯民．国标法和纸片法对餐具大肠菌群检测比较 ［Ｊ］．中国国境卫生检疫杂志，１９９４，１７（６）：３６０－３６１． ［２］ 纪淑娟，曹杨．牛奶中菌落总数检测纸片研制及检测效果研究 ［Ｊ］．中国酿造，２００９（２）：１４４－１４７． ［３］ 吴清平，孙永，蔡芷荷，等．快速测试片在食品微生物检测中的 应用［Ｊ］．中国卫生检验杂志，２００６，１６（５）：６３５－６３７． ［４］ 唐漪灵，吴翊．Ｐｅｔｒｉｆｉｌｍ 纸片法和国标法检测奶制品细菌总 数和 大 肠 菌 群 数 ［Ｊ］．中 国 卫 生 检 验 杂 志，２０００，１０（３）： ３２５－３２７． ［５］ 张立 国，张 琚．实 时 定 量 ＰＣＲ 技 术 的 介 绍［Ｊ］．生 物 技 术， ２００３，１３（２）：３９－４０． ［６］ 刘仲敏，郑鸣．单增李斯特菌的实时定量 ＰＣＲ 检测［Ｊ］．食品 与发酵工业，２００７，３３（５）：１００－１０４． ［７］ 杨静，焦新安，等．沙门氏菌属特异性单克隆抗体在快速检测 中的应用［Ｊ］．中国卫生检验杂志，１９９７，７（３）：１３６－１３９． ［８］ Ａ．Ｈｏｓｚｏｗｓｋｉ．ＲａｐｉｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎａｎｄｅｎｕｍｅｒａｔｉｏｎｏｆＳａｌｍｏｎｅｌ－ ｌａｉｎｃｈｉｃｋｅｎｃａｒｃａｓｓｒｉｎｓｅｓｕｓｉｎｇｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ，ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔａｎｄ ｃｏｌｏｎｙｂｌｏｔｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ［Ｊ］．ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＦｏｏｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９６，２８（３）：３４１－３５０． ［９］ 陈志刚，顾振新，汪志君，等．糙米的营养成分及其在发芽过 程中的变化［Ｊ］．南京农业大学学报，２００３，２６（３）：８４－８７． ［１０］ 张晖，姚惠源，姜元荣．γ－氨基丁酸的功能性及其在稻米制品 中的富集利用［Ｊ］．粮食与饲料工业，２００４（８）：４１－４３． ［１１］ 程永强，明媚，石波．一种新型功能性食品—发 芽 糙 米［Ｊ］．食 品工业科技，２００３（３）：８４－８５． ［１２］ 张 菊 梅，吴 清 平，李 程 思，等．生物发光法微生物快速检测 试 剂的性质及其影响因素研究［Ｊ］．微 生 物 学 通 报，２００６，３３ （３）：３６－４１． ［１３］ 冯敏，高岳，吕海燕，等．ＡＴＰ发光技术测定辐照前脱水 蔬 菜 和调味品的含菌量［Ｊ］．核农学报，２００５，１９（４）：２８２－２８５． ［１４］ ＰｌｅｓｓＰ，ＦｕｔｓｃｈｉｋＫ，ＳｃｈｏｐｆＥ．Ｒａｐｉｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｓａｌｍｏｎｅｌｌａｅ ｂｙｍｅａｎｓｏｆａｎｅｗｉｍｐｅｄａｎｃｅｓｐｌｉｔｔｉｎｇｍｅｔｈｏｄ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ ＦｏｏｄＰｒｏｔｅｃｔｉｏｎ，１９９４，５７（５）：３６９－３７６． ［１５］ ＦｕｎｇＤＹＣ．Ｗｈａｔ′ｓｎｅｅｄｅｄｉｎｒａｐｉｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｆｏｏｄｂｏｒｎｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ［Ｊ］．ＦｏｏｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９５，４９（６）：４９，６４－６７． ［１６］ 刘永军，南昭东，孙海涛，等．限制性条件下药物对细菌抑制 作用微量量热法研究［Ｊ］．生物工程学报，１９９６，１２（１）：６０－６４． ［１７］ ＧｕｎａｓｅｋｅｒａＴＳ，ＶｅａｌＤＡ，ＡｔｔｆｉｅｌｄＰＶ．Ｐｏｔｅｎｔｉａｌｆｏｒｂｒｏａｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｏｆｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙａｎｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓｉｎ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌａｎｄｓｏｍａｔｉｃｃｅｌｌａｎａｌｙｓｅｓｏｆｍｉｌｋ［Ｊ］．Ｉｎｔ．Ｊ． ＦｏｏｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２００３，８５（３）：２６９－２７９． ［１８］ ＧｕｎａｓｅｋｅｒａＴＳ，ＡｔｔｆｉｅｌｄＰＶ，ＶｅａｌＤＡ．Ａｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒｒａｐｉｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎａｎｄｅｎｕｍｅｒａｔｉｏｎｏｆｔｏｔａｌｂａｃｔｅｒｉａｉｎｍｉｌｋ［Ｊ］． Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２０００，６６（３）：１２２８－１２３２． ［１９］ ＦｕｃｈｓＢＭ，ＷａｌｌｎｅｒＧ，ＢｅｉｓｋｅｒＷ，ｅｔａｌ．Ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃａ－ ｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｉｎｓｉｔｕａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ ｏｆＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ１６Ｓ ｒＲＮＡｆｏｒｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｌｙｌａｂｅｌｅｄｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｒｏｂｅｓ［Ｊ］． Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９９８，６４（１２）：４９７３－４９８２． ［２０］ ＬｉｓｌｅＪＴ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ ＭＡ，ＷｉｌｌｓｅＡＲ，ｅｔａｌ．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙａｎｄｓｏｌｉｄ２ｐｈａｓｅｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒｃｏｕｎｔｉｎｇｂａｃｔｅｒｉａｉｎｗａｔｅｒ［Ｊ］．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉ－ ｏｌ．，２００４，７０（９）：５３４３－５３４８． ［２１］ 王晓英．固相细胞计数法一种快速检测单细胞细菌的食品微 生物新检测方法［Ｊ］．国外医学卫生学分册，２００３，３０ （３）： １８３－１８６． ［２２］ 王新为．水和食品中卫生细菌的快速检验研究进展［Ｊ］．中国 公共卫生，２０００，１６（８）：７４８． ［２３］ 陈 森．测定细菌总数的新方法—ＳｉｍｐｌａｔｅＴＭ 全 平 皿 计 数 法 ［Ｊ］．中国卫生检验杂志，１９９９，９（６）：４２５－４２７． ［２４］ 唐春林，车振明．食品微生物快速检测技术研究进展［Ｊ］．食品 科技，２００７（９）：４２－４４． ［２５］ ＧａｒｄｉｎｉａＦ，ＬａｎｃｉｏｔｔｉｂＲ，ＳｉｎｉｇａｇｌｉａｂＭ，ｅｔａｌ．Ａｈｅａｄｓｐａｃｅ ｇａｓｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃａｐｐｒｏａｃｈｆｏｒｔｈｅｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇｏｆｔｈｅｍｉ－ ｃｒｏｂｉａｌｃｅｌｌａｃｔｉｖｉｔｙａｎｄｔｈｅｃｅｌｌｖｉａｂｉｌｉｔｙｅｖａｌｕａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｍｅｔｈｏｄｓ，１９９７，２９（２）：１０３－１１４． 国内行业简讯 ●２０１１年第四季度初，嘉兴中华化工公司最新研发的第三代香兰素生产技术，正从小试进入中试阶段， 公司总工、上海香研所前所长毛海舫为此而奔忙、投入。为了这一工艺，中华化工累计投入了３亿元的费用。 ●福建省唯一一家天然单体香料生产企业、将乐县科利达香料香精有限公司，自去年作技改后，通过技 术创新，不断改进工艺，在节省原料的同时提高产品质量和产量，优质精油年产量自去年的１０００吨增加至 ３０００吨，产值达５０００万元，产品全部向美国的香精公司出口。科利达公司主产杉木精油。 ●浙江磐安县天蓝香料有限公司大量收购当地云山产特色香料鸢尾，浸提深、浅色鸢尾浸膏，已打入国 际市场。 — ５５ —