世界科技研究与发展Vo130N02第30卷第2期WORLDSCITECHR&DAPr2008PP138-1422008年4月138—142页水生细菌计数方法研究进展及展望王婷婷”邓天龙”**廖梦霞（1.成都理工大学材料与化学化工学院，成都6100592中国科学院盐湖研究所.西宁810008）摘要：水环境中细菌数量是水体质量评价研究的重要参数之一对于工程实践具有更加重要的意义。随着人们环保意识的加强，对水生细菌的计数方法提出了更高的要求，促使细菌检测方法不断改进，这对坏境评价以及工业生产非常重要，文章总结了几种常用的水生细菌计数方法，并进行比较和评价，提出了未来的发展趋势。关键调：水样品；水生细菌；细菌计数方法中图分类号：X853文献标识码：ADiscussjonson theMethodopgyofAquaticBacteriaCountingWANGTingtingDENG Tian pong2**:LIAOMengxia(1 Colkge ofMa terials Chm istry and ChemicalEngineering Chen&lu University ofTechnopgy Chen&lu 6100592 Qinghai hstitute of Salt Lakes Chinese Academy of Sc jences Xning 810008)AbstraThe numberofbactera in na tura]wa ter systm was one of themost mportint parameters in aqua tic env jiomenta] researchesA-pngwithPeope'sarisingconscausnessgradualyprenviomentalpotectiopthemethodbkgyofaquticbacteracountinghadbeen consanty put fpvard in a hiher equest In the paper sevem[commonly usedmethods for aquatic bac teria counting at presentwerediscussedin details Finaly the new trend in the futue was a jo briefly pointed autKeywords wa ter samples aquatic bacterig bacterialcounting称为倍比稀释法）等；而直接计数法是适时、快速、准确地测引言1定细菌总量，主要包括光学显微镜、荧光显微镜等技术、最可随着社会经济的高速发展，水体污染已成为全球面临的几率数一聚合酶链式反应法（cambinedthemCstprobabe重大问题。给人类的生产和生活带来极大危害。在天然水环numberwithpopmerasechanreactiopMPN-RCR法混浊境中，细菌在水体及其沉积物系统中的污染物的迁移、循环度（比浊）计数法、电阻抗法以及流式细胞仪测定法等。和生物转化及其生物成矿方面起看十分重要的作用。针对21平板菌落计数法水环境中细菌菌属、菌群、数量、分布规律及其微生物地球化平板菌落计数法是传统的细菌计数方法可分为稀释平学循环的研究。一直是国内外研究的热点。水体中细菌的菌板法和涂布平板法，是根据微生物在固体培养基上所形成的群、数量和分布主要受到营养水平、温度、光照、溶解氧、盐分菌落是由单细胞紧殖而成的，一个菌落即代表一个单细胞。等因素的影响，如港湾（河流入海口）具有较多的营养物质，计数时，先将待测样品准确地接比例进行一系列稀释，再取其水体中具有较高的细菌数！。目前，水体中细菌的分布是一定量的稀释液接种到培养血中，使其均匀分布于培养血中检测水体受污染程度的一个重要指标而研究细菌的分布情的培养基上，经培养后，由单个细胞生长繁殖形成菌落，从平况最重要的是对细菌数量的准确测定，这对环境评估以及实板上的菌落数及其稀释倍数就可换算出样品中的含菌数3]。平板菌落计数法测定的细菌数量是样品中可培养细菌的数际的工程应用有重要的意义。随时间、空间、地域的不同，水量，即活菌数，研究细菌各种生理生化特性常用该法，其具有体中的细菌菌群、数量和分布差异甚大，而不同的计数方法成本低廉、方法简单、操作方便的特点。值得指出的是：该法测定范围、测定速度和测定结果不尽相同，因此本文针对耗时较长（多为数天）无菌操作要求严格，手续繁琐。劳动强各种水生细菌计数方法的特点及其研究进展进行了总结，并度大。测定结果受培养条件等因素的影响；样品中含菌量过进行了对比和评价，指出未来的发展趋势少时并不能代表整个样品的含菌量情况！4：因培养法只能验2水生细菌计数方法测活菌，不适用于检测环境样品中细菌的总量，22最可几率法（MPN法）水生细菌计数方法可分为间接培养计数法、直接计数MPN法也是一种早期检测微生物数量的方法它是根据法。前者是通过选择性培养基，在适宜的培养条件下对样概率统计学的方法来推算水样中某种待测菌的数量15。品中的细菌进行培养进行活细菌的计数。主要包括平板菌落1959年Jannasch等用这种方法来推算水体细菌的数量[，计数法、最可几率计数法（mostprobablenumberMPN法亦其方法是：将待测水样进行一系列的梯度稀释后，分别吸取一定的体积于适量液体培养基试管中进行培养，记录有细菌生长的试管数，查MPN表来推算水样中活菌的数量。该法*基金项目：国家自然科学基金（40573044）、四川省杰出青年基金(05ZQ26-4)资助。成本低廉。方法简单，操作方便：但是耗时长，操作较为繁琐**通讯作者：邓天龙，博士生导师，E-mailtene@ilaccn劳动强度大，只能用于可培养的细菌进行的活菌计数，且基第138页wwwgpbescicam?1994-2014 China Academic Journal Electronic Publishing House.All rights reserved.http://www.cnki.net
第 30卷 2008年 4月 第 2期 138-142页 世界科技研究与发展 WORLDSCI-TECHR＆D Vol.30 Apr.2008 No.2 pp.138 -142 第 138页 www.globesci.com ＊基金项目:国家自然科学基金 (40573044)、四川省杰出青年基金 (05ZQ26-4)资助。 ＊＊通讯作者:邓天龙, 博士生导师, E-mail:tldeng@isl.ac.cn 水生细菌计数方法研究进展及展望 ＊ 王婷婷 1 邓天龙 1, 2＊＊ 廖梦霞 1 (1.成都理工大学材料与化学化工学院, 成都 610059;2.中国科学院盐湖研究所, 西宁 810008) 摘 要:水环境中细菌数量是水体质量评价研究的重要参数之一, 对于工程实践具有更加重要的意义。 随着人们环保意识的加 强, 对水生细菌的计数方法提出了更高的要求, 促使细菌检测方法不断改进, 这对环境评价以及工业生产非常重要, 文章总结了几 种常用的水生细菌计数方法, 并进行比较和评价, 提出了未来的发展趋势。 关键词:水样品;水生细菌;细菌计数方法 中图分类号:X853 文献标识码:A DiscussionsontheMethodologyofAquaticBacteriaCounting ＊ WANGTingting1 DENGTianlong1, 2＊＊ LIAOMengxia1 (1.CollegeofMaterials, ChemistryandChemicalEngineering, ChengduUniversityofTechnology, Chengdu610059; 2.QinghaiInstituteofSaltLakes, ChineseAcademyofSciences, Xining810008) Abstract:Thenumberofbacteriainnaturalwatersystemwasoneofthemostimportantparametersinaquaticenvironmentalresearches.Alongwithpeoplesarisingconsciousnessgraduallyforenvironmentalprotection, themethodologyofaquaticbacteriacountinghadbeenconstantlyputforwardinahigherrequest.Inthepaper, severalcommonlyusedmethodsforaquaticbacteriacountingatpresentwerediscussed indetails.Finally, thenewtrendinthefuturewasalsobrieflypointedout. Keywords:watersamples;aquaticbacteria;bacterialcounting 1 引言 随着社会经济的高速发展 , 水体污染已成为全球面临的 重大问题, 给人类的生产和生活带来极大危害。 在天然水环 境中, 细菌在水体及其沉积物系统中的污染物的迁移、循环 和生物转化及其生物成矿方面起着十分重要的作用。 针对 水环境中细菌菌属、菌群、数量 、分布规律及其微生物地球化 学循环的研究, 一直是国内外研究的热点。 水体中细菌的菌 群、数量和分布主要受到营养水平、温度、光照、溶解氧、盐分 等因素的影响, 如港湾(河流入海口)具有较多的营养物质, 其水体中具有较高的细菌数[ 1] 。 目前, 水体中细菌的分布是 检测水体受污染程度的一个重要指标, 而研究细菌的分布情 况最重要的是对细菌数量的准确测定, 这对环境评估以及实 际的工程应用有重要的意义。 随时间、空间、地域的不同, 水 体中的细菌菌群、数量和分布差异甚大, 而不同的计数方法 测定范围、测定速度和测定结果不尽相同。 因此, 本文针对 各种水生细菌计数方法的特点及其研究进展进行了总结, 并 进行了对比和评价, 指出未来的发展趋势。 2 水生细菌计数方法 水生细菌计数方法可分为间接培养计数法、直接计数 法 [ 2] 。 前者是通过选择性培养基, 在适宜的培养条件下对样 品中的细菌进行培养进行活细菌的计数, 主要包括平板菌落 计数法、最可几率计数法 (mostprobablenumber, MPN法, 亦 称为倍比稀释法)等;而直接计数法是适时、快速、准确地测 定细菌总量, 主要包括光学显微镜、荧光显微镜等技术、最可 几率数 -聚合 酶链式 反应法 (combinedthemostprobable numberwithpolymerasechainreaction, MPN-PCR法 )、混浊 度(比浊)计数法、电阻抗法以及流式细胞仪测定法等。 2.1 平板菌落计数法 平板菌落计数法是传统的细菌计数方法, 可分为稀释平 板法和涂布平板法, 是根据微生物在固体培养基上所形成的 菌落是由单细胞繁殖而成的, 一个菌落即代表一个单细胞。 计数时, 先将待测样品准确地按比例进行一系列稀释, 再取 一定量的稀释液接种到培养皿中 , 使其均匀分布于培养皿中 的培养基上, 经培养后, 由单个细胞生长繁殖形成菌落, 从平 板上的菌落数及其稀释倍数就可换算出样品中的含菌数[ 3] 。 平板菌落计数法测定的细菌数量是样品中可培养细菌的数 量, 即活菌数, 研究细菌各种生理生化特性常用该法, 其具有 成本低廉、方法简单、操作方便的特点。 值得指出的是:该法 耗时较长(多为数天), 无菌操作要求严格, 手续繁琐, 劳动强 度大, 测定结果受培养条件等因素的影响;样品中含菌量过 少时并不能代表整个样品的含菌量情况[ 4] ;因培养法只能验 测活菌, 不适用于检测环境样品中细菌的总量。 2.2 最可几率法(MPN法) MPN法也是一种早期检测微生物数量的方法, 它是根据 概率统计学的方法来推算水样中某种待 测菌的数量[ 5] 。 1959年 Jannasch等用这种方法来推算水体细菌的数量[ 2] , 其方法是:将待测水样进行一系列的梯度稀释后, 分别吸取 一定的体积于适量液体培养基试管中进行培养, 记录有细菌 生长的试管数, 查 MPN表来推算水样中活菌的数量。 该法 成本低廉, 方法简单, 操作方便;但是耗时长, 操作较为繁琐, 劳动强度大, 只能用于可培养的细菌进行的活菌计数, 且基
2008年4月化学化工世界科技研究与发展于统计学的计数准确度不高。242荧光原位杂交计数法荧光原位杂交（fluorescentin situhybridzationFEH)技23光学显微镜计数法光学显微镜计数法中最常见的是血球板计数法[，即用术是近年来生物学领域发展起来的一项新技术。该技术是用特殊的荧光素标记DNA探针，特异性地与互补核酸序列血球计数板在光学显微镜下进行细菌总量的直接计数（包括在完整的细胞内结合，用荧光显微镜等荧光检测技术进行观死菌与活菌）。该法是对血球板一定方格内细菌统计计数察和分析15l。1981年Roumam首次报道了荧光素标记的再计算出1mL菌液所含的菌体数。实验时，可直接蘸取少CDNA作原位杂交[16]。近年来随着FIFHI技术应用的探针种量菌悬液点在计数板上，用光学显微镜下观察计数。也可以类的不断增多，FIH技术在细胞遗传学和环境水体中各种在菌悬液中加入染色液（如美蓝染色液）数分钟后在光学显微镜下观察计数[37。该方法成熟、快速，且成本低廉。操作细菌的检测和分析等方面得到了广泛应用，其实验方法主要包括：（1）固定标本；（2)预处理样品；（3)用相应的探针进简单，但干扰较大。且无法区分活菌体和死菌体常在准确度要求不高时选用。行杂交：（4洗掉未结合的探针：（5）信号的仪器（普通荧光显微镜、共聚焦激光扫描显微镜或流式细胞仪）检测及结果24荧光显微镜计数法荧光显微镜技术的应用使细菌的观察、鉴定和分析进入分析[5]，1996年Wagne等17]较早将FISH技术应用于硝了一个新的时代具有快速、劳动强度小、结果稳定、准确度化细菌检测研究了一套较完善的对硝化细菌检测的技术从此FISH技术被广泛地应用于活性污泥系统、硝化流化床高等优点。目前，荧光显微镜计数法主要包括荧光染料直接反应器以及膜一生物反应器等污水处理系统中11。2003计数法、荧光原位杂交计数法和荧光免疫染色计数法等。年，Saph等19在旋转盘式生物膜法水处理装置中研究生物241荧光染料直接计数法在生物染色剂中，有一类可被激发而发射荧光的染料，膜对脱氮菌的处理机能时，采用NSO190.NII和CNIT等探针，应用FIH法对硝化菌进行了定量计数观测，结果快速准统称为荧光染料图。常见的荧光染料直接计数法有AO（acrodineorange吖啶橙）染色法和DAPI46-dimdino-2-确。同年，谢冰等[29成功应用该法研究了活性污泥中的亚硝化细菌和硝化细菌空间上的数量分布情况。取得了满意的Phenylndoe46-联臊一2-苯基吲哚)染色法。荧光染料AO和DAP可与细胞中的DNA和RNA特异结合，在特定波结果。FIH计数法具有安全、简便、灵敏、快速，可检测出环境长光的激发下发出荧光，便于染色后的细菌在荧光显微镜下观察。AO染色法最早由Fransise9于1973年使用于天然样品中大多数的细菌【2]，能对不同环境样品中的细菌从系统发育的角度进行鉴定，尤其对水生生态系统中微生物菌群水体中的细菌总数的计数，建立了AO染色法的基本体系和步骤。1977年Habbie等进行了改进，其操作方法是：取的系统发育、定性、定量检测方面有着独特的优越性124。但值得指出是：荧光探针价格昂贵，而且需要专业的分子生物水样加入甲醛固定后，以AO染色液染色，然后将细菌过滤到事先用Igalan黑染色的孔径为α2um的聚碳酸酯滤膜学知识在杂交效率、杂质的干扰、荧光淬灭、清洗过程中的脱落等方面都可能影响观测结果的可靠性1。上，冲洗后置载玻片上，于落射光荧光显微镜下计数，经测量视野面积及滤膜有效面积而换算出样品中所含细菌数量。243荧光免疫计数荧光免疫技术（imunofuoescmcetechnqueIFT)是一1980年Porer等叫进一步改进了细菌的染色方法，用DAPI对细菌进行染色。与AO相比。DAP的使用能够更好地排除种以荧光染料作为标记物的免疫分析技术，随着一系列新仪其它微粒的干扰。背景更清晰，使染色的效果更加专一且制器和新方法的建立，荧光免疫技术取得了快速发展，使荧光片后的保存时间更长久，DPA的这些优越性使它在荧光染免疫技术的标准化、定量化和自动化进入一个新的发展阶色中的应用得到推广，1986年，Velj等!针对采集的海水，段。荧光免疫计数法是利用抗原和抗体相互作用的原理，用荧光素的衍生物（如异硫氰酸荧光素，fuorescenjsohipcya沉积物中的细菌以及海藻样品，在Porer等的基础上首先采nateFIIG氨基荧光素dichprotrjaznylaninofluoresceinDTAF用了超声波对样品进行了前处理。使其从颗粒表面解脱下来，再应用DAP法对海洋细菌进行直接计数，得到较好效等）标记特异性抗体，检测微生物细胞上的抗原，在显微镜视果。1987年，Arend等也运用DAP法对浅海水界面沉积野下进行荧光点的检测即可得到样品中细菌的数量[232],Sanley等最早应用荧光免疫计数法直接测定细菌的数量121。物细菌总数进行了研究。得出了细菌数量在空间和时间上的分布及活动规律，该法用于细菌计数研究已经逐渐成熟起目前该技术主要用于沙门氏菌、李斯特菌、葡萄球菌毒素、Escherich迪ColiO157和单核细胞增生李斯特氏菌等的快速来.荧光染料直接计数法快速、准确、简便，且样品易于保检测1。1995年，朱罐使用该法快速检测肉类、蛋类等食品中的沙门氏菌，取得很好效果。2002年，Yu等[2]应用存，用于水体中细菌总数测定能较好反映样品中细菌的实际时间分辨荧光免疫法检测苹果酒中EscherichiaColiO157：数量。国家技术监督局已将吖啶橙染色荧光显微镜直接计数法（AODC)列入海洋细菌总数计数方法的国家标准[14，该H7建立了检测的实验方法具有较好的灵敏度和特异性。FT计数法操作快速、简便、特异性高、非特异性荧光干方法也广泛用于各种水环境细菌总数的测定，www globesci cam第13顶?1994-2014China AcademicJournalElectronicPublishingHouse.All rightsreserved.http://www.cnki.net
2008年 4月 世界科技研究与发展 化学化工 www.globesci.com 第 139页 于统计学的计数准确度不高。 2.3 光学显微镜计数法 光学显微镜计数法中最常见的是血球板计数法 [ 6] , 即用 血球计数板在光学显微镜下进行细菌总量的直接计数(包括 死菌与活菌)。 该法是对血球板一定方格内细菌统计计数, 再计算出 1 mL菌液所含的菌体数。 实验时, 可直接蘸取少 量菌悬液点在计数板上, 用光学显微镜下观察计数, 也可以 在菌悬液中加入染色液(如美蓝染色液), 数分钟后在光学显 微镜下观察计数 [ 3, 7] 。 该方法成熟、快速, 且成本低廉, 操作 简单, 但干扰较大, 且无法区分活菌体和死菌体, 常在准确度 要求不高时选用。 2.4 荧光显微镜计数法 荧光显微镜技术的应用使细菌的观察、鉴定和分析进入 了一个新的时代, 具有快速、劳动强度小、结果稳定、准确度 高等优点。 目前, 荧光显微镜计数法主要包括荧光染料直接 计数法、荧光原位杂交计数法和荧光免疫染色计数法等。 2.4.1 荧光染料直接计数法 在生物染色剂中, 有一类可被激发而发射荧光的染料, 统称为荧光染料 [ 8] 。 常见的荧光染料直接计数法有 AO(acrodineorange, 吖啶橙)染色法和 DAPI(4, 6 -diamidino-2 - phenylindole, 4, 6 -联脒 -2 -苯基吲哚)染色法。 荧光染料 AO和 DAPI可与细胞中的 DNA和 RNA特异结合, 在特定波 长光的激发下发出荧光, 便于染色后的细菌在荧光显微镜下 观察。 AO染色法最早由 Fransiseo[ 9] 于 1973 年使用于天然 水体中的细菌总数的计数, 建立了 AO染色法的基本体系和 步骤。 1977年 Hobbie等 [ 10]进行了改进, 其操作方法是:取 水样加入甲醛固定后, 以 AO染色液染色, 然后将细菌过滤 到事先用 Irgalan黑染色的孔径为 0.2 μm的聚碳酸酯滤膜 上, 冲洗后置载玻片上, 于落射光荧光显微镜下计数, 经测量 视野面积及滤膜有效面积而换算出样品中所含细菌数量。 1980年 Porter等[ 11]进一步改进了细菌的染色方法, 用 DAPI 对细菌进行染色。 与 AO相比, DAPI的使用能够更好地排除 其它微粒的干扰, 背景更清晰, 使染色的效果更加专一且制 片后的保存时间更长久, DIPA的这些优越性使它在荧光染 色中的应用得到推广 。 1986年, Velji等[ 12]针对采集的海水、 沉积物中的细菌以及海藻样品, 在 Porter等的基础上首先采 用了超声波对样品进行了前处理, 使其从颗粒表面解脱下 来, 再应用 DAPI法对海洋细菌进行直接计数, 得到较好效 果。 1987年, Arend等[ 13]也运用 DAPI法对浅海水界面沉积 物细菌总数进行了研究, 得出了细菌数量在空间和时间上的 分布及活动规律, 该法用于细菌计数研究已经逐渐成熟起 来。 荧光染料直接计数法快速、准确、简便, 且样品易于保 存, 用于水体中细菌总数测定能较好反映样品中细菌的实际 数量。 国家技术监督局已将吖啶橙染色荧光显微镜直接计 数法(AODC)列入海洋细菌总数计数方法的国家标准[ 14] , 该 方法也广泛用于各种水环境细菌总数的测定。 2.4.2 荧光原位杂交计数法 荧光原位杂交 (fluorescentinsituhybridization, FISH)技 术是近年来生物学领域发展起来的一项新技术。 该技术是 用特殊的荧光素标记 DNA探针, 特异性地与互补核酸序列 在完整的细胞内结合, 用荧光显微镜等荧光检测技术进行观 察和分析 [ 15] 。 1981年, Roumam首次报道了荧光素标记的 cDNA作原位杂交[ 16] 。 近年来随着 FISH技术应用的探针种 类的不断增多, FISH技术在细胞遗传学和环境水体中各种 细菌的检测和分析等方面得到了广泛应用, 其实验方法主要 包括:(1)固定标本;(2)预处理样品;(3)用相应的探针进 行杂交;(4)洗掉未结合的探针;(5)信号的仪器(普通荧光 显微镜、共聚焦激光扫描显微镜或流式细胞仪 )检测及结果 分析 [ 15] 。 1996年, Wagner等 [ 17]较早将 FISH技术应用于硝 化细菌检测, 研究了一套较完善的对硝化细菌检测的技术, 从此 FISH技术被广泛地应用于活性污泥系统、硝化流化床 反应器以及膜 -生物反应器等污水处理系统中[ 18] 。 2003 年, Satoh等[ 19]在旋转盘式生物膜法水处理装置中研究生物 膜对脱氮菌的处理机能时, 采用 NSO190、NIT和 CNIT等探 针, 应用 FISH法对硝化菌进行了定量计数观测, 结果快速准 确。 同年, 谢冰等[ 20] 成功应用该法研究了活性污泥中的亚 硝化细菌和硝化细菌空间上的数量分布情况, 取得了满意的 结果。 FISH计数法具有安全、简便、灵敏、快速, 可检测出环境 样品中大多数的细菌 [ 21] , 能对不同环境样品中的细菌从系 统发育的角度进行鉴定, 尤其对水生生态系统中微生物菌群 的系统发育、定性、定量检测方面有着独特的优越性[ 22] 。 但 值得指出是:荧光探针价格昂贵, 而且需要专业的分子生物 学知识, 在杂交效率、杂质的干扰、荧光淬灭、清洗过程中的 脱落等方面都可能影响观测结果的可靠性[ 22] 。 2.4.3 荧光免疫计数 荧光免疫技术(immunofluorescencetechnique, IFT)是一 种以荧光染料作为标记物的免疫分析技术, 随着一系列新仪 器和新方法的建立, 荧光免疫技术取得了快速发展, 使荧光 免疫技术的标准化、定量化和自动化进入一个新的发展阶 段。 荧光免疫计数法是利用抗原和抗体相互作用的原理, 用 荧光素的衍生物(如异硫氰酸荧光素, fluoresceinisothiocyanate, FITC;氨基荧光素, dichlorotriazinylaminofluorescein, DTAF 等)标记特异性抗体, 检测微生物细胞上的抗原, 在显微镜视 野下进行荧光点的检测即可得到样品中细菌的数量[ 23, 24] , Stanley等最早应用荧光免疫计数法直接测定细菌的数量[ 2] 。 目前该技术主要用于沙门氏菌、李斯特菌、葡萄球菌毒素、 EscherichiaColiO157和单核细胞增生李斯特氏菌等的快速 检测 [ 25] 。 1995年, 朱曜 [ 26]使用该法快速检测肉类、蛋类等 食品中的沙门氏菌, 取得很好效果。 2002年, Yu等[ 27] 应用 时间分辨荧光免疫法检测苹果酒中 EscherichiaColiO157∶ H7, 建立了检测的实验方法, 具有较好的灵敏度和特异性。 IFT计数法操作快速、简便、特异性高、非特异性荧光干
化学化工2008年4月世界科技研究与发展扰因素少，结果稳定且准确度高，但敏感度偏低。专一性强培养基电特性变化推演出微生物的原始菌量[3]。电阻抗法可采用自动连续性检测，能同时检测多个样品的含菌量，具每检查一种抗原需制备相应的特异性荧光抗体123，加之由有在线快速、准确的特点！3，具有较好的应用前景。但该法于天然水样品中细菌并不是都能与之相结合，不适宜于天然水样品中细菌总数的测定（含有多个细菌种群）1成本相对偏高，受培养基变化等干扰因素影响也较大，且无法区分碎片和细胞[325最可几率数一聚合酶链式反应计数法（MPN-PCR法）28流式细胞仪测定法近年来，由于分子生物学的发展，提出了PCR技术和流式细胞术（flowcyrmetryFCM）是二十世纪70年代MPN联用技术进行细菌数量测定的新方法，称为MPN-PCR发展起来的一种以流式细胞仪为工具，能快速测量细胞的物法。PCR法是一种在体外快速扩增微量靶DNA的技术，目理或化学性质，如大小、内部结构、DNARNA蛋白质、抗原前已广泛地用检测水体及土壤中的微生物，其方法为：对抽等，并可对其分类、收集的高新技术「337。其原理是：经荧光提的总DNA溶液进行10倍梯度稀释，选取不同稀释度的样染料标记过的细胞样品制成单细胞悬液，以一定的流速经过品分别进行PCR反应。根据扩增产物的电泳结果来计数各喷嘴到达光源发出的激光形成的聚焦区时，标记的荧光染料样品的阳性反应数。再从MPN表中查出细菌的相应近似值，在激发光的激发下发射出特异颜色的荧光信号和散射光信即可推算单位水样中细菌的数量2§，1997年，Minthen号，信号的强弱与细胞内待测组分的含量呈正比。经光电信等I2I采用MPN-PCR法对新鲜奶酪中产肠毒素C的金黄色号转换，即可实现数字化定量分析[3]，1983年，Yensch葡萄球菌进行了计数。对该法的步骤进行了系统的阐述，并等[到较早地将流式细胞术用于浮游植物的研究，对海洋中指出了该法的应用前景，结果也比较令人满意。2002年，明微生物粒径进行了划分并阐述其分析方法这对流式细胞仪镇囊等「对该法进一步完善，从生物硝化池污水中快速抽应用于海洋微型浮游植物研究起了积极的推动作用。1999提模板DNA的方法快速、灵敏、稳定地定量测定了生物硝年，Tanrran等[利用显微镜和流式细胞仪相结合的方法分化池中硝化细菌的数量，确定了该法的各种条件，并和MPN别测定了阿拉伯海多个站点在季风期间的浮游植物的生物-Gress法进行了比较突出了该法在细菌数量测定上的优量和群落结构，分析了季风期间水流对浮游植物分布的影越性。2007年，魏利等[303]利用MPN-PCR法研究了油田响。同年，Gin等|4|利用流式细胞仪调查了百慕大大西洋不硫酸盐还原菌进行快速定量检测方法，也取得了满意的结同季节细菌和浮游植物的大小及生物量，得出一年中不同季果，并指出该法在生产中应用的重大意义，节中细菌和浮游植物的水平变化和垂直变化规律。近十来MPN-PCR法快速且灵敏度高，可对同种细菌的不同类年，流式细胞仪在海洋调查中的应用，使得细菌数量测定的群进行检测，检测结果稳定且准确，对实现水体中细菌进行准确性有了很大的提高，已成为水生生态系统中细菌数量测实时监控提供了可能；但该法成本相对偏高，操作条件严格，定的标准方法之一13，专业性强。对于某一特定细菌的检测需要合成特定引物。流式细胞术的应用范围广，凡能被荧光分子标记的细胞26混浊度计数法或微粒均能用流式细胞仪检测【4]，对水生细菌计数测定具其原理是：在一定波长范围内，菌悬液中的细胞浓度与有明显的优势。该法测定过程干扰小，区分度好、简便快速、混浊度（即光吸收值。OD)成正比。其实验方法是：首先配成结果准确可靠，并具备多参数测定的优点并能兼容其他分子系列不同浓度的细菌悬浮液标准溶液，采用分光光度计测定生物学测定手段的特性，在实验室和现场测定都能起到很好相应的CD值，获取菌液浓度与OD值标准曲线确定OD与的效果14]。但流式细胞仪价格昂贵，操作要求高，样品前处细菌数目的关系即可实现水样品中细菌数量[3。混浊度计理较为复杂。数法快速，操作简单，不受时间和其他因素的限制，但该法测3水生细菌计数方法的对比与评价得的是细菌总量，无法区分死活菌体。应当指出的是：该法受培养基固体颗粒物及细菌代谢产物性质的影响较大，对某如上所述，水生细菌的计数方法多种多样，不同方法的一种细菌也无专一性及针对性可能导致测定结果偏高[3]比较与评价见表1从中可见。各种计数方法各有其优缺点。2.7电阻抗法其检测范围也有所不同。总体而言，荧光显微镜计数法以其该法是通过测量细菌代谢引起的培养基电特性变化来快速、准确、操作简便的优势逐渐取代平板菌落计数法、最可测定样品微生物含量的一种快速检测方法。微生物在培养几率计数法等一系列传统的培养计数法得到广泛的应用。过程中，由于新陈代谢，使培养基中的大分子的电情性物质。近年来。采用流式细胞仪测定法对水生细菌数量的检测越来如碳水化合物、类脂、蛋白质等转化为小分子的电活性物越多，尤其可对比较小细菌颗粒进行检测。较荧光显微镜计质，如乳酸盐、醋酸盐、重碳酸盐等，使导电性增强。电阻抗降数法更快速，操作步骤更简便。低【3]研究表明电导率随时间的变化曲线与细菌生长曲4结束语线相似。出现缓慢增长期、加速增长期、指数增长期和缓慢减少期最后趋于稳定期，细菌起始数量不同，出现指数增长水体中细菌数量是反映水体水质和污染状况的重要监期的时间也不同，通过建立二者之间的关系，就能通过检测测指标。随着分析科学、环境科学、环境生物地球化学、微第140页wwwgpbescicam?1994-2014China Academic Journal Electronic PublishingHouse.All rightsreserved.http://www.cnki.net
化学化工 世界科技研究与发展 2008年 4月 第 140页 www.globesci.com 扰因素少, 结果稳定且准确度高, 但敏感度偏低, 专一性强, 每检查一种抗原需制备相应的特异性荧光抗体[ 23] , 加之由 于天然水样品中细菌并不是都能与之相结合, 不适宜于天然 水样品中细菌总数的测定(含有多个细菌种群)[ 2] 。 2.5 最可几率数—聚合酶链式反应计数法(MPN-PCR法) 近年来, 由于分子生物学的发展, 提出了 PCR技术和 MPN联用技术进行细菌数量测定的新方法, 称为 MPN-PCR 法。 PCR法是一种在体外快速扩增微量靶 DNA的技术, 目 前已广泛地用检测水体及土壤中的微生物, 其方法为:对抽 提的总 DNA溶液进行 10倍梯度稀释, 选取不同稀释度的样 品分别进行 PCR反应, 根据扩增产物的电泳结果来计数各 样品的阳性反应数, 再从 MPN表中查出细菌的相应近似值, 即可推算单位水 样中细菌的 数量[ 28] 。 1997 年, Mäntynen 等 [ 29]采用 MPN-PCR法对新鲜奶酪中产肠毒素 C的金黄色 葡萄球菌进行了计数, 对该法的步骤进行了系统的阐述, 并 指出了该法的应用前景, 结果也比较令人满意。 2002年, 明 镇寰等 [ 28]对该法进一步完善, 从生物硝化池污水中快速抽 提模板 DNA的方法, 快速、灵敏、稳定地定量测定了生物硝 化池中硝化细菌的数量, 确定了该法的各种条件, 并和 MPN -Griess法进行了比较, 突出了该法在细菌数量测定上的优 越性。 2007年, 魏利等[ 30, 31]利用 MPN-PCR法研究了油田 硫酸盐还原菌进行快速定量检测方法, 也取得了满意的结 果, 并指出该法在生产中应用的重大意义。 MPN-PCR法快速且灵敏度高, 可对同种细菌的不同类 群进行检测, 检测结果稳定且准确, 对实现水体中细菌进行 实时监控提供了可能;但该法成本相对偏高, 操作条件严格, 专业性强, 对于某一特定细菌的检测需要合成特定引物。 2.6 混浊度计数法 其原理是:在一定波长范围内, 菌悬液中的细胞浓度与 混浊度(即光吸收值, OD)成正比。 其实验方法是:首先配成 系列不同浓度的细菌悬浮液标准溶液, 采用分光光度计测定 相应的 OD值, 获取菌液浓度与 OD值标准曲线, 确定 OD与 细菌数目的关系即可实现水样品中细菌数量[ 32] 。 混浊度计 数法快速, 操作简单, 不受时间和其他因素的限制, 但该法测 得的是细菌总量, 无法区分死活菌体。 应当指出的是:该法 受培养基固体颗粒物及细菌代谢产物性质的影响较大, 对某 一种细菌也无专一性及针对性, 可能导致测定结果偏高 [ 33] 。 2.7 电阻抗法 该法是通过测量细菌代谢引起的培养基电特性变化来 测定样品微生物含量的一种快速检测方法。 微生物在培养 过程中, 由于新陈代谢, 使培养基中的大分子的电惰性物质, 如碳水化合物、类脂、蛋白质等, 转化为小分子的电活性物 质, 如乳酸盐、醋酸盐、重碳酸盐等, 使导电性增强, 电阻抗降 低 [ 34] 。研究表明, 电导率随时间的变化曲线与细菌生长曲 线相似, 出现缓慢增长期、加速增长期、指数增长期和缓慢减 少期, 最后趋于稳定期。 细菌起始数量不同, 出现指数增长 期的时间也不同, 通过建立二者之间的关系, 就能通过检测 培养基电特性变化推演出微生物的原始菌量[ 35] 。 电阻抗法 可采用自动连续性检测, 能同时检测多个样品的含菌量, 具 有在线快速、准确的特点[ 35] , 具有较好的应用前景。 但该法 成本相对偏高, 受培养基变化等干扰因素影响也较大, 且无 法区分碎片和细胞 [ 2] 。 2.8 流式细胞仪测定法 流式细胞术(flowcytometry, FCM)是二十世纪 70年代 发展起来的一种以流式细胞仪为工具, 能快速测量细胞的物 理或化学性质, 如大小、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原 等, 并可对其分类、收集的高新技术 [ 36, 37] 。 其原理是:经荧光 染料标记过的细胞样品制成单细胞悬液, 以一定的流速经过 喷嘴到达光源发出的激光形成的聚焦区时, 标记的荧光染料 在激发光的激发下发射出特异颜色的荧光信号和散射光信 号, 信号的强弱与细胞内待测组分的含量呈正比, 经光电信 号转换, 即可实 现数字化 定量分 析[ 38] 。 1983 年, Yentsch 等[ 39]较早地将流式细胞术用于浮游植物的研究, 对海洋中 微生物粒径进行了划分并阐述其分析方法, 这对流式细胞仪 应用于海洋微型浮游植物研究起了积极的推动作用。 1999 年, Tanrran等 [ 40]利用显微镜和流式细胞仪相结合的方法分 别测定了阿拉伯海多个站点在季风期间的浮游植物的生物 量和群落结构, 分析了季风期间水流对浮游植物分布的影 响。 同年, Gin等[ 41]利用流式细胞仪调查了百慕大大西洋不 同季节细菌和浮游植物的大小及生物量, 得出一年中不同季 节中细菌和浮游植物的水平变化和垂直变化规律。 近十来 年, 流式细胞仪在海洋调查中的应用, 使得细菌数量测定的 准确性有了很大的提高, 已成为水生生态系统中细菌数量测 定的标准方法之一 [ 2] 。 流式细胞术的应用范围广, 凡能被荧光分子标记的细胞 或微粒均能用流式细胞仪检测[ 42] , 对水生细菌计数测定具 有明显的优势。 该法测定过程干扰小、区分度好、简便快速、 结果准确可靠, 并具备多参数测定的优点并能兼容其他分子 生物学测定手段的特性, 在实验室和现场测定都能起到很好 的效果 [ 43] 。 但流式细胞仪价格昂贵, 操作要求高, 样品前处 理较为复杂。 3 水生细菌计数方法的对比与评价 如上所述, 水生细菌的计数方法多种多样, 不同方法的 比较与评价见表 1。 从中可见, 各种计数方法各有其优缺点, 其检测范围也有所不同。 总体而言, 荧光显微镜计数法以其 快速、准确、操作简便的优势逐渐取代平板菌落计数法、最可 几率计数法等一系列传统的培养计数法, 得到广泛的应用。 近年来, 采用流式细胞仪测定法对水生细菌数量的检测越来 越多, 尤其可对比较小细菌颗粒进行检测, 较荧光显微镜计 数法更快速, 操作步骤更简便。 4 结束语 水体中细菌数量是反映水体水质和污染状况的重要监 测指标。随着分析科学 、环境科学、环境生物地球化学、微
化学化工2008年4月世界科技研究与发展表1几种水生细菌计数方法的比较7.58~ 59Tabe1Comparison of the diferentcauntingmethodsofaqua ticbacteria【6]钱存柔黄仪秀.微生物学实验教程【M.北京：北京大学出版社。200397~100蓬漫蒸霞成本方法检测范围.【7]王芳，裴哲.关于微生物细胞数量的镜检计数法的改进【」.中国科技信息20052167适用于水体中多种细平板菌落菌的检测，但该法为低大耗时长【8]黄晓峰，张远强。张英起。荧光探针技术［M．北京：人民军医出计数法氧培养、主要角宇好氧菌的培养计数版社。20042适用于平板培养法不[9] Francisco DE Mah R A Rabin AC Acridine orange-epifuores能进行的活菌计数却cence echngue for caunthg bacteria h natualwatery J. TmansacMPN法低大很容易在液体培养基耗时长中生长并被检查出来tiomnsof he American Microscopica1Socie y197392(3):416~421的细菌[10] Hobbie JE DaleyRJ Jaspers Use of nucepole filters por countng适用于各种细菌的检光学显微智花刻拳华探毅杀bacte ria by fluorescencem icroscopy j. App lied and Env iomenal略高小快速镜计数法Microbplcgy199733(5)1225-1228菌体误差较大不仅适用于各种水体[11] Porer K G FegY S The use of DAPI for identivng and counting样品也可用于水下物荧光显微squaticm iciofpr J. Limnopey and Oceancgephy 1980 25(5)高小快速体表面附着细菌的直镜计数法接计数包括不透明物943~948体[ 12] Veli IM AlbrghtLJ The dipersin of adhered marine bac eria by适用于各种水生细菌MPN-PCR法高小快速yophosPhate and uJtrasound pror o direct caunting J.Collog Int的检测CentNatRedh Sci 1986 3 249~259[13] Arend L ReilM Seasonal and patial distrbution of extracelupr该法适用于菌体分散混浊度计数法较高快速鼻好简宜干扰少的细enzim atic activities and miciobial incorporation of diso ved organicsubstrates inmarine sedim emty J. APlied and Envixm eneIMi适用于细菌浓度高的cobobey198753(8)1748-1755高小电阻抗法快速检测[4号，浓度低时不[14]GB/T127636-1991海洋调查规范海洋生物调查能准确反应实际数量【15]朱海霞，陈林海，张大伟，等.活性污泥微生物菌群研究方法进该法应用范围广，能用展【J.生态学报。200727(1):314~322流式细胞于各种细菌的检测而小最高最快【16]梁毓.荧光原位杂交技术的研究进展【J.中国优生与遗传杂仪测定法是晶胎螃靓细胞结构志200523（5）：119-120[17] WagnerM RathG Koops H P eta] h situ anaysis ofnitriv'ing生物学等多学科的交叉渗透，水生细菌数量的检测对于揭示bacteria n sewage treamentPlant Jj.Wa ter Science and Technol水体一沉积物体系中的微生物作用过程与机制至关重要，从OBY199634(1)237-244而对环境评价以及工业发展有着重大意义。虽然，目前准确【18]孙寓姣。王勇，黄霞．荧光原位杂交技术在环境微生物生态学对水生细菌进行计数还存在着不足，但随着方法的创新和仪解析中的应用研究【].环境污染治理技术与设备，20045器的改进，以及多种方法的联合使用，必将推动相关测定方(11):14~20法的改进与提高。我们认为：未来在水生细菌准确计数方法[19] SichH Okabe S YamagudhiY et a] Eva uation of the mpactof研究方面，将在传统细菌计数法的基础上，逐步向自动化、高bicaugmentation and bostmujaton by in situ hybridizatin and mi灵敏度、高准确度、专属性的在线分析方向发展，并不断向水cioelectrdq J. W aterResearch 2003 37:2206 -2216生细菌的不同菌种、菌属的分类分析测定和细菌微观形貌、【20]谢冰徐华徐亚同。荧光原位杂交法在活性污泥硝化细菌检测赋存形态及其结构分析与表征等更深层次方向迈进，从而加中的应用［J：上海环境科学，200322（5)：363～369[21] Am ann R Luwing W SchleiferK Phyloenetic identification and速推进环境污染状况的适时监控与环境污染治理研究的发展进程。n situ detectionof ndvidua m icrobilcels withautcultia tion.M icrob pjcgicalReviews 1995 59( 1): 143 ~ 169【22]张明.硝化细菌应用技术研究【DJ.上海：华东师范大学，参考文献2003534~63【1]沈萍.微生物学【M.北京：高等教育出版社。200Q12~20287~【23]刘辉。免疫学与免疫学检验【M]·北京：人民军医出版社312200692~98【2]邱大俊，焦念志，钱鲁闽.水生细菌数量与菌体大小测定技术的进【24]朱立平，陈学清.免疫学常用实验方法[M北京：人民军医出展【J.台湾海峡，20043(3)：377~385版社，2000366~387【3范秀容，李广武沈萍.微生物学实验【M.第二版，北京高等教育出版社。1989138~141【25]佟平，陈红兵.免疫学技术在食品微生物检测中的应用【]．江【4蒋增辉，王幸艳.介绍几种新的水中细菌总数检测方法【J.城市西食品工业。2007136-38公用事业。200519（2)：15~16【26]朱曜.免疫染色法快速检测食品中沙门氏菌【J.现代商检科【5陆苏鹿.MPN法的原理与局限性分析【J.中国食品工业。2004技19955(2):18~21wwwglobescicam第14顶?1994-2014China AcademicJournal Electronic PublishingHouse.All rights reserved.htp:/www.cnki.net
2008年 4月 世界科技研究与发展 化学化工 www.globesci.com 第 141页 表 1 几种水生细菌计数方法的比较 Table1 Comparisonofthedifferentcountingmethodsofaquaticbacteria 方法 成本 劳动 强度 检测 速度 检测范围 平板菌落 计数法 低 大 耗时长 适用于水体中多种细 菌的检测, 但该法为曝 氧培养, 主要用于好氧 菌的培养计数 MPN法 低 大 耗时长 适用于平板培养法不 能进行的活菌计数, 却 很容易在液体培养基 中生长并被检查出来 的细菌 光学显微 镜计数法 略高 小 快速 适用于各种细菌的检 测, 特别是体积较大的 菌体, 对于个体较小的 菌体误差较大 荧光显微 镜计数法 高 小 快速 不仅适用于各种水体 样品, 也可用于水下物 体表面附着细菌的直 接计数, 包括不透明物 体 MPN-PCR法 高 小 快速 适用于各种水生细菌 的检测 混浊度计数法 较高 小 快速 该法适用于菌体分散 良好[ 33] 且干扰少的细 菌 电阻抗法 高 小 快速 适用于细菌浓度高的 检测[ 44] , 浓度低时不 能准确反应实际数量 流式细胞 仪测定法 最高 小 最快 该法应用范围广, 能用 于各种细菌的检测, 而 且可以检测细胞结构 及细胞功能 生物学等多学科的交叉渗透, 水生细菌数量的检测对于揭示 水体 -沉积物体系中的微生物作用过程与机制至关重要, 从 而对环境评价以及工业发展有着重大意义。 虽然, 目前准确 对水生细菌进行计数还存在着不足, 但随着方法的创新和仪 器的改进, 以及多种方法的联合使用, 必将推动相关测定方 法的改进与提高。 我们认为:未来在水生细菌准确计数方法 研究方面, 将在传统细菌计数法的基础上, 逐步向自动化、高 灵敏度、高准确度、专属性的在线分析方向发展, 并不断向水 生细菌的不同菌种、菌属的分类分析测定和细菌微观形貌、 赋存形态及其结构分析与表征等更深层次方向迈进, 从而加 速推进环境污染状况的适时监控与环境污染治理研究的发 展进程。 参考文献 [ 1] 沈萍.微生物学[ M] .北京:高等教育出版社, 2000:12 ～ 20, 287 ～ 312 [ 2] 邱大俊, 焦念志, 钱鲁闽.水生细菌数量与菌体大小测定技术的进 展[ J] .台湾海峡, 2004, 3(3):377 ～ 385 [ 3] 范秀容, 李广武, 沈萍.微生物学实验[ M] .第二版, 北京:高等教 育出版社, 1989:138 ～ 141 [ 4] 蒋增辉, 王幸艳.介绍几种新的水中细菌总数检测方法[ J] .城市 公用事业, 2005, 19(2):15 ～ 16 [ 5] 陆苏飚.MPN法的原理与局限性分析 [ J] .中国食品工业, 2004, 7:58 ～ 59 [ 6] 钱存柔, 黄仪秀.微生物学实验教程[ M] .北京:北京大学出版 社, 2003:97 ～ 100 [ 7] 王芳, 裴哲.关于微生物细胞数量的镜检计数法的改进[ J] .中国 科技信息, 2005, 21:67 [ 8] 黄晓峰, 张远强, 张英起.荧光探针技术[ M] .北京:人民军医出 版社, 2004, 2 [ 9] FranciscoDE, MahRA, RabinAC.Acridineorange-epifluorescencetechniqueforcountingbacteriainnaturalwaters[ J] .TransactionsoftheAmericanMicroscopicalSociety, 1973, 92(3):416 ～ 421 [ 10] HobbieJE, DaleyRJ, JasperS.Useofnucleporefiltersforcounting bacteriabyfluorescencemicroscopy[ J] .AppliedandEnvironmental Microbiology, 1997, 33(5):1225 ～ 1228 [ 11] PorterKG, FeigYS.TheuseofDAPIforidentifyingandcounting aquaticmicroflora[ J] .LimnologyandOceanography, 1980, 25(5): 943 ～ 948 [ 12] VeljiIM, AlbrightLJ.Thedispersionofadheredmarinebacteriaby pyrophosphateandultrasoundpriortodirectcounting[ J] .ColloqInt CentNatRechSci, 1986, 3:249 ～ 259 [ 13] ArendL, ReilM.Seasonalandspatialdistributionofextracellular enzymaticactivitiesandmicrobialincorporationofdissolvedorganic substratesinmarinesediments[ J] .AppliedandEnvironmentalMicrobiology, 1987, 53(8):1748 ～ 1755 [ 14] GB/T12763.6-1991海洋调查规范海洋生物调查 [ 15] 朱海霞, 陈林海, 张大伟, 等.活性污泥微生物菌群研究方法进 展[ J] .生态学报, 2007, 27(1):314 ～ 322 [ 16] 梁毓.荧光原位杂交技术的研究进展[ J] .中国优生与遗传杂 志, 2005, 23(5):119 ～ 120 [ 17] WagnerM, RathG, KoopsHP, etal.Insituanalysisofnitrifying bacteriainsewagetreatmentplants[ J] .WaterScienceandTechnology, 1996, 34(1):237 ～ 244 [ 18] 孙寓姣, 王勇, 黄霞.荧光原位杂交技术在环境微生物生态学 解析中的应用研究 [ J] .环境污染治理技术与设备, 2004, 5 (11):14 ～ 20 [ 19] SatohH, OkabeS, YamaguchiY, etal.Evaluationoftheimpactof bioaugmentationandbiostimulationbyinsituhybridizationandmicroelectrode[ J] .WaterResearch, 2003, 37:2206 ～ 2216 [ 20] 谢冰, 徐华, 徐亚同.荧光原位杂交法在活性污泥硝化细菌检测 中的应用[ J] .上海环境科学, 2003, 22(5):363 ～ 369 [ 21] AmannR, LudwingW, SchleiferK.Phylogeneticidentificationand insitudetectionofindividualmicrobialcellswithoutcultivation[ J] . MicrobiologicalReviews, 1995, 59(1):143 ～ 169 [ 22] 张明.硝化细菌应用技术研究 [ D] .上海:华东师范大学, 2003, 5, 34 ～ 63 [ 23] 刘辉.免疫学与免疫学检验 [ M] .北京:人民军医出版社, 2006, 92 ～ 98 [ 24] 朱立平, 陈学清.免疫学常用实验方法[ M] .北京:人民军医出 版社, 2000, 366 ～ 387 [ 25]佟平, 陈红兵.免疫学技术在食品微生物检测中的应用[ J] .江 西食品工业, 2007, 1:36 ～ 38 [ 26] 朱曜.免疫染色法快速检测食品中沙门氏菌 [ J] .现代商检科 技, 1995, 5(2):18 ～ 21
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