《发酵工程》课程教学资源（讲义）第五章 丙酮酸发酵过程优化

表5-2-1无机氮源及其质量浓度对菌株WSHP12发酵生产丙酮酸的影响 氮质量浓度 丙酮酸质量浓度/gL NH4)2SO4 NH4CI (NH4)2HPO4尿素 0.32 2.5 0.64 10.0 10.0 4.3 10.0 15.6 6.7 12.0 19 7.5 11.8 2.54 16.0 15.2 5.7 10.9 14.7 11.3 5.8 10.8 五、分批培养中供氧方式和培养基碳氮比对丙酮酸发酵的影响 (一)供氧方式对丙酮酸发酵的影响 由于丙酮酸处于EMP途径和T℃CA循环的交点位置,溶氧水平直接影响碳流的走向, 因此,我们考察了溶氧浓度对丙酮酸生产的影响。在实验中采用了两种不同的供氧方式, 以使发酵体系处于不同的溶氧水平。供氧方式Ⅰ为搅拌转速恒定在700r/min,供氧方式Ⅱ 为搅拌转速按DOT不低于30%的要求逐渐升高。由这两种供氧方式控制的发酵过程曲线如 图5-2-4所示,过程主要参数列于表5-22 = i叫 RΔ△ 10203040 t/h 图5-2-4不同供氧方式下的丙酮酸发酵过程 O and..0-39h, 700 r/min; A and -0-6h, 400 r/min; 6-14h, 500 r/min; 14-37h, 600 r/min 表5-2-2不同供氧方式控制的发酵过程主要参数比较 操作方式初始葡萄糖1剩余葡萄糖丙酮酸细胞干重生产强度产率 /g L/ /g L-.h /gL 搅拌转速恒定869 39.5 18.5 0.47 搅拌转速变化93.7301.627025.20.900.29 由图5-2-4可知,供氧方式Ⅱ控制下的发酵过程,总体上溶氧水平低于供氧方式I, 尽管细胞生长和葡萄糖消耗速度明显快于供氧方式Ⅰ,然而丙酮酸产率和产量却较低(表 5-2-2),表明相对较高的溶氧水平有利于T. glabrata发酵生产丙酮酸。关于溶氧水平对丙酮

10 表 5-2-1 无机氮源及其质量浓度对菌株 WSH-IP12 发酵生产丙酮酸的影响 氮质量浓度 / gL -1 丙酮酸质量浓度 / gL -1 (NH4)2SO4 NH4Cl (NH4)2HPO4 尿素 0.32 4.1 5.4 2.5 5.0 0.64 10.0 10.0 4.3 10.0 1.27 15.6 11.8 6.7 12.0 1.91 16.3 12.8 7.5 11.8 2.54 16.0 15.2. 5.7 10.9 3.18 14.7 11.3 5.8 10.8 五、分批培养中供氧方式和培养基碳氮比对丙酮酸发酵的影响 (一)供氧方式对丙酮酸发酵的影响 由于丙酮酸处于 EMP 途径和 TCA 循环的交点位置，溶氧水平直接影响碳流的走向， 因此，我们考察了溶氧浓度对丙酮酸生产的影响。在实验中采用了两种不同的供氧方式， 以使发酵体系处于不同的溶氧水平。供氧方式Ⅰ为搅拌转速恒定在 700 r/min，供氧方式Ⅱ 为搅拌转速按 DOT 不低于 30%的要求逐渐升高。由这两种供氧方式控制的发酵过程曲线如 图 5-2-4 所示，过程主要参数列于表 5-2-2。 细胞干重 / gL-1 0 20 40 60 80 100 相对溶氧浓度 DOT / % 0 10 20 30 40 50 t / h 0 20 40 60 80 100 0 10 20 30 40 葡萄糖 / gL-1 丙酮酸 / gL-1 0 10 20 30 0 10 20 30 40 t / h 图 5-2-4 不同供氧方式下的丙酮酸发酵过程 ○ and … 0-39h, 700 r/min; △ and ─ 0-6h，400 r/min; 6-14h, 500 r/min; 14-37h, 600 r/min 表 5-2-2 不同供氧方式控制的发酵过程主要参数比较 操作方式 初始葡萄糖 / gL -1 t / h 剩余葡萄糖 / gL -1 丙酮酸 / gL -1 细胞干重 / gL -1 生产强度 / gL -1 h -1 产率 / gL -1 搅拌转速恒定 86.9 40 5.2. 39.5 18.5 0.99 0.47 搅拌转速变化 93.7 30 1.6 27.0 25.2 0.90 0.29 由图 5-2-4 可知，供氧方式Ⅱ控制下的发酵过程，总体上溶氧水平低于供氧方式Ⅰ， 尽管细胞生长和葡萄糖消耗速度明显快于供氧方式Ⅰ，然而丙酮酸产率和产量却较低(表 5-2-2)，表明相对较高的溶氧水平有利于 T. glabrata 发酵生产丙酮酸。关于溶氧水平对丙酮

酸发酵的影响,后面还将进行详细论述 (二)培养基碳氮比的影响 在小型发酵罐中进一步考察了培养基的初始葡萄糖浓度和或碳氮比对丙酮酸发酵的 影响。结果发现,如果葡萄糖和蛋白胨的浓度按碳氮比相同的原则(25:1)同时提高,则丙酮 酸生产也会得到促进;然而,若蛋白胨浓度保持不变,在此基础上再提高葡萄糖的浓度(即 CN增大),则发酵后期(40h后)细胞生长速度和葡萄糖消耗速度明显下降(图5-2-5),丙酮 酸产率也显著降低(表5-2-3) 器四 巴怎 图5-2-5分批培养中初始葡萄糖浓度和或碳氮比对丙酮酸发酵的影响 ●葡萄糖Ωg/,蛋白胨15g/L;■葡萄糖127g/,蛋白胨20g/LO葡萄糖201g/,蛋白胨20g/L 表5-2-3不同初始葡萄糖浓度和/或碳氮比下的分批培养过程参数 初始葡萄糖蛋白胨CNt剩余葡萄糖丙酮酸细胞干重生产强度丙酮酸产率细胞产率乙醇 /gg"/h /g.L. /gL-1 /g- L-h 1525:139 0.44 0.2163.0 2025:136 47.925.6 133 0.41 1.05 0.31 0.2175.7 六、葡萄糖流加培养中氮的供给对丙酮酸发酵的影响 由于较高的初始葡萄糖浓度对丙酮酸生产存在一定的抑制作用,因此,可以考虑采用 适宜的葡萄糖流加方案来提高丙酮酸的生产水平。在进行小型发酵罐流加培养实验前,我 们先在摇瓶培养中考察了简单的补糖操作对wSH-P12发酵生产丙酮酸的影响。如图5-2-6 所示,在葡萄糖总浓度均为80g/L的前提下,初始葡萄糖浓度为20g/、分三次补足80g

11 酸发酵的影响，后面还将进行详细论述。 (二)培养基碳氮比的影响 在小型发酵罐中进一步考察了培养基的初始葡萄糖浓度和/或碳氮比对丙酮酸发酵的 影响。结果发现，如果葡萄糖和蛋白胨的浓度按碳氮比相同的原则(25:1)同时提高，则丙酮 酸生产也会得到促进；然而，若蛋白胨浓度保持不变，在此基础上再提高葡萄糖的浓度(即 C/N 增大)，则发酵后期(40 h 后)细胞生长速度和葡萄糖消耗速度明显下降(图 5-2-5)，丙酮 酸产率也显著降低(表 5-2-3)。  (Glucose) / (g/L)  (DCW) / (g/L)  (Pyruvate) / (g/L) t / h 图 5-2-5 分批培养中初始葡萄糖浓度和/或碳氮比对丙酮酸发酵的影响 ● 葡萄糖 92 g/L，蛋白胨 15 g/L; ■ 葡萄糖 127 g/L，蛋白胨 20 g/L;○ 葡萄糖 201 g/L，蛋白胨 20 g/L. 表 5-2-3 不同初始葡萄糖浓度和/或碳氮比下的分批培养过程参数 初始葡萄糖 / gL -1 蛋白胨 / gL -1 C:N / gg -1 t / h 剩余葡萄糖 / gL -1 丙酮酸 / gL -1 细胞干重 / gL -1 生产强度 /gL -1 h -1 丙酮酸产率 / gg -1 细胞产率 / gg -1 乙醇 / gL -1 92 15 25:1 39 4.5 38.5 18.5 0.99 0.44 0.216 3.0 127 20 25:1 36 10.8 47.9 25.6 1.33 0.41 0.220 4.5 201 20 40:1 44 52.9 46.2 32.2 1.05 0.31 0.217 5.7 六、葡萄糖流加培养中氮的供给对丙酮酸发酵的影响 由于较高的初始葡萄糖浓度对丙酮酸生产存在一定的抑制作用，因此，可以考虑采用 适宜的葡萄糖流加方案来提高丙酮酸的生产水平。在进行小型发酵罐流加培养实验前，我 们先在摇瓶培养中考察了简单的补糖操作对 WSH-IP12 发酵生产丙酮酸的影响。如图 5-2-6 所示，在葡萄糖总浓度均为 80 g/L 的前提下，初始葡萄糖浓度为 20 g/L、分三次补足 80 g/L

的方式(48h丙酮酸产量30.2gL),其丙酮酸产量和产率均优于初始葡萄糖浓度为80g/(48 h丙酮酸产量23.5gL)的操作方式,表明流加培养有可能提高丙酮酸的生产水平。 0102030405060 t/h t/h t/h 图5-2-6摇瓶培养中补糖操作对丙酮酸发酵的影响。 ●补糖:O不补糖 在小型发酵罐中进行了数次流加培养实验,其中典型的发酵过程曲线如图5-2-7所示 从图5-2-7中可以发现,发酵13h后由于葡萄糖消耗速度低于流加速度,因此罐内葡萄糖 浓度有所升高,但对丙酮酸生产没有造成不利影响。然而,发酵24h后,丙酮酸积累速度 明显下降,与此同时,葡萄糖浓度迅速上升,表明细胞消耗葡萄糖的速度正在急剧下降(因 为葡萄糖流加速度也在下降)。计算发现,发酵25h时发酵罐内的葡萄糖总浓度已达到1 gL,而初始蛋白胨浓度为15g/L,即CN已达到30:1,且随着葡萄糖的加入,CN还在不 断升高(3h时达到34:1)。由于CN过高会使细胞消耗葡萄糖的能力降低。因此,分别在 34h和40h补入10g蛋白胨和5g(NH4)SO4,使培养基的CN下降到25左右,结果(图 5-2-7),葡萄糖消耗和细胞生长能力均得以恢复,发酵64h时丙酮酸产量达到54.5g(对 葡萄糖产率为0.47gg)。由此表明,要在流加培养中获得高的丙酮酸产率和生产强度,氮 的有效供给是非常重要的 80 Glucose 0 010203040506070 t/h 图5-2-7典型的T. glabrata WSh-P2流加培养过程曲线 ●丙酮酸,O葡萄糖,▲细胞干重;一乙醇 根据以上分析,为了进一步提高丙酮酸的产量和产率,在相同的培养条件下,不补加 氮源,而改用氨水代替KoH控制发酵过程的p相当于连续提供氮源)进行流加培养实验

12 的方式(48 h 丙酮酸产量 30.2 g/L)，其丙酮酸产量和产率均优于初始葡萄糖浓度为 80 g/L(48 h 丙酮酸产量 23.5 g/L)的操作方式，表明流加培养有可能提高丙酮酸的生产水平。 0 10 20 30 0 20 40 60 80 100 0 10 20 30 40 0 10 20 30 40 50 60 t / h 丙酮酸 / gL-1 葡萄糖 / gL-1 细胞干重 / gL-1 t / h t / h 0 10 20 30 40 50 60 0 10 20 30 40 50 60 图 5-2-6 摇瓶培养中补糖操作对丙酮酸发酵的影响。 ● 补糖；○不补糖 在小型发酵罐中进行了数次流加培养实验，其中典型的发酵过程曲线如图 5-2-7 所示。 从图 5-2-7 中可以发现，发酵 13 h 后由于葡萄糖消耗速度低于流加速度，因此罐内葡萄糖 浓度有所升高，但对丙酮酸生产没有造成不利影响。然而，发酵 24 h 后，丙酮酸积累速度 明显下降，与此同时，葡萄糖浓度迅速上升，表明细胞消耗葡萄糖的速度正在急剧下降(因 为葡萄糖流加速度也在下降)。计算发现，发酵 25 h 时发酵罐内的葡萄糖总浓度已达到 110 g/L，而初始蛋白胨浓度为 15 g/L，即 C/N 已达到 30:1，且随着葡萄糖的加入，C/N 还在不 断升高(33 h 时达到 34:1)。由于 C/N 过高会使细胞消耗葡萄糖的能力降低。因此，分别在 34 h 和 40 h 补入 10 g 蛋白胨和 5 g (NH4)2SO4，使培养基的 C/N 下降到 25:1 左右，结果(图 5-2-7)，葡萄糖消耗和细胞生长能力均得以恢复，发酵 64 h 时丙酮酸产量达到 54.5 g/L(对 葡萄糖产率为 0.47 g/g)。由此表明，要在流加培养中获得高的丙酮酸产率和生产强度，氮 的有效供给是非常重要的。 0 20 40 60 80 100 0 10 20 30 40 50 60 70 t / h 细胞干重、葡萄糖 / gL-1 0 10 20 30 40 50 60 丙酮酸、乙醇 / gL-1 5g (NH4)2SO4 Glucose 10g 蛋白胨 图 5-2-7 典型的 T. glabrata WSH-IP12 流加培养过程曲线 ● 丙酮酸; ○ 葡萄糖; ▲ 细胞干重; ─ 乙醇 根据以上分析，为了进一步提高丙酮酸的产量和产率，在相同的培养条件下，不补加 氮源，而改用氨水代替 KOH 控制发酵过程的 pH(相当于连续提供氮源)进行流加培养实验

结果发现(图5-2-8),整个发酵过程中细胞均表现出很强的丙酮酸合成能力,55h丙酮酸产 量达到57.3g/L(对葡萄糖产率0.50gg),丙酮酸产量、产率、生产强度均高于图5-2-7所 示的流加培养过程。此外,检测发现,发酵结束时铵离子浓度为10.3g/L,表明发酵过程中 氮的供给是充分的,细胞代谢正常进行。因此,尽管34h后由于糖流加速率过快,造成罐 内葡萄糖也有所积累,但对产酸并没有负面影响。 80 葡萄糖 ▲▲M 20 10 0 0102030 t/ h 图5-2-8以氨水代替KOH控制pH的T. glabrata WSh-P2流加培养过程曲线 丙酮酸;O葡萄糖;▲细胞干重;一乙醇 七、讨论 (-)氮源对T. glabrata WSH-IPI2发酵生产丙酮酸的影响 米原辙等曾发现,当培养基中硫胺素浓度超过40μg/L时,多重维生素(烟酸、硫胺素 生物素和吡哆醇)营养缺陷菌株.gbπ ata iFo0065积累丙酮酸的能力下降。酵母粉中硫胺 素的含量通常在50μgg左右,因此,在发酵液中添加1gL的酵母粉就使丙酮酸产量降低 图5-2-1),主要原因是酵母粉中硫胺素质量分数较高,从而间接导致培养基中硫胺素浓度 升高。由于硫胺素是丙酮酸脱氢酶系(PDH和丙酮酸脱羧酶(PDC)的辅酶,而我们采用的T glabrata WSH-Pl12是硫胺素营养缺陷型,在一定范围内,硫胺素浓度增加,PDH和PDC 活性也会升高。这样,随着酵母粉浓度的提高,进入TCA循环的碳流量也增加,结果导致 细胞量大幅度提高,葡萄糖消耗不断加快,而丙酮酸积累却明显减少。 尽管T. glabrata WSH-IP2能够同化无机氮源并积累丙酮酸,但结果均不如以蛋白胨 为氮源的情况。 Yokota等人在研究E.coli的硫辛酸营养缺陷型菌株生产丙酮酸时也采用蛋 白胨作为氮源,他们的观点是,对E.cob细胞来说,蛋白胨中的LLys和LMt可以代替 硫辛酸,这样,既可以促进细胞生长,又不会造成PDH活性升高。我们则认为,蛋白胨中 的某些氨基酸类物质是丙酮酸生产的促进因子,但其中的一些维生素,由于组分和质量分 数不确定,有可能会对丙酮酸积累产生负作用。对图5-2-2的数据进行碳平衡分析可以发 现(表5-2-4),蛋白胨浓度高于15g/L后,碳流更多地由积累丙酮酸转向合成细胞和乙醇 表明PDH和PDC活性均有所增加,结果使丙酮酸的氧化脱羧作用加强。这种效应就有可 能是蛋白胨中的不定量维生素带来的,只不过由于蛋白胨中的维生素质量分数低于酵母粉, 因此,蛋白胨浓度增加对丙酮酸积累造成的不利影响不如酵母粉严重 表5-2-4不同蛋白胨浓度下的碳平衡

13 结果发现(图 5-2-8)，整个发酵过程中细胞均表现出很强的丙酮酸合成能力，55 h 丙酮酸产 量达到 57.3 g/L (对葡萄糖产率 0.50 g/g)，丙酮酸产量、产率、生产强度均高于图 5-2-7 所 示的流加培养过程。此外，检测发现，发酵结束时铵离子浓度为 10.3 g/L，表明发酵过程中 氮的供给是充分的，细胞代谢正常进行。因此，尽管 34 h 后由于糖流加速率过快，造成罐 内葡萄糖也有所积累，但对产酸并没有负面影响。 0 20 40 60 80 100 0 10 20 30 40 50 60 t / h 0 10 20 30 40 50 60 葡萄糖 细胞干重、葡萄糖 / gL-1 丙酮酸、乙醇 / gL-1 图 5-2-8 以氨水代替 KOH 控制 pH 的 T. glabrata WSH-IP12 流加培养过程曲线 ● 丙酮酸; ○ 葡萄糖; ▲ 细胞干重; ─ 乙醇 七、讨 论 (一)氮源对 T. glabrata WSH-IP12 发酵生产丙酮酸的影响 米原辙等曾发现，当培养基中硫胺素浓度超过 40 g/L 时，多重维生素(烟酸、硫胺素、 生物素和吡哆醇)营养缺陷菌株 T. glabrata IFO 0005 积累丙酮酸的能力下降。酵母粉中硫胺 素的含量通常在 50 g/g 左右，因此，在发酵液中添加 1 g/L 的酵母粉就使丙酮酸产量降低 (图 5-2-1)，主要原因是酵母粉中硫胺素质量分数较高，从而间接导致培养基中硫胺素浓度 升高。由于硫胺素是丙酮酸脱氢酶系(PDH)和丙酮酸脱羧酶(PDC)的辅酶，而我们采用的 T. glabrata WSH-IP12 是硫胺素营养缺陷型，在一定范围内，硫胺素浓度增加，PDH 和 PDC 活性也会升高。这样，随着酵母粉浓度的提高，进入 TCA 循环的碳流量也增加，结果导致 细胞量大幅度提高，葡萄糖消耗不断加快，而丙酮酸积累却明显减少。 尽管 T. glabrata WSH-IP12 能够同化无机氮源并积累丙酮酸，但结果均不如以蛋白胨 为氮源的情况。Yokota 等人在研究 E.coli 的硫辛酸营养缺陷型菌株生产丙酮酸时也采用蛋 白胨作为氮源，他们的观点是，对 E.coli 细胞来说，蛋白胨中的 L-Lys 和 L-Met 可以代替 硫辛酸，这样，既可以促进细胞生长，又不会造成 PDH 活性升高。我们则认为，蛋白胨中 的某些氨基酸类物质是丙酮酸生产的促进因子，但其中的一些维生素，由于组分和质量分 数不确定，有可能会对丙酮酸积累产生负作用。对图 5-2-2 的数据进行碳平衡分析可以发 现(表 5-2-4)，蛋白胨浓度高于 15 g/L 后，碳流更多地由积累丙酮酸转向合成细胞和乙醇， 表明 PDH 和 PDC 活性均有所增加，结果使丙酮酸的氧化脱羧作用加强。这种效应就有可 能是蛋白胨中的不定量维生素带来的，只不过由于蛋白胨中的维生素质量分数低于酵母粉， 因此，蛋白胨浓度增加对丙酮酸积累造成的不利影响不如酵母粉严重。 表 5-2-4 不同蛋白胨浓度下的碳平衡

蛋白胨/gL1 0 1015 20 葡萄糖 100100100100100100100100100 细胞量C 353532302829343637 丙酮酸C丙酮酸 03326212017 乙醇 ETOH 剩余碳 393837333237363433 ①以被消耗的葡萄糖中的碳为基准计算, ②假设生物量的分子式为C39fH707O196Nay,灰分含量3.35% ③剩余碳包括二氧化碳(大约25%左右)及其它副产物,如酮戊二酸 (二)培养基碳氮比对丙酮酸发酵的影响 运用碳平衡的观点对图5-2-5和表5-2-3的数据进行分析,可以发现(表5-2-5),当葡萄 糖和蛋白胨浓度按相同C/N提高时,C丙瞬酸下降了6%,而Cx和 ETOH各增加了16%和10%。 如果维持蛋白胨浓度不变,而将葡萄糖浓度由127g/L提高到201gL,则C丙酾酸下降了24%, 但Cx和CεpoH却保持不变。这些结果表明:(1)较高的初始葡萄糖浓度对丙酮酸产率也有 不利影响,CN升高后(即氮源相对缺乏),这种不利因素就表现得更为突出;(2)CN和氮 浓度是控制细胞代谢的重要因素,氮源相对缺乏时,EMP途径的某些关键酶的合成可能受 阻,结果导致细胞消耗葡萄糖的能力明显下降。 Lagunas等人曾发现,在缺乏氮源的葡萄糖 培养基中培养酵母,不仅酵解途径流量持续下降,细胞转运葡萄糖的能力也不断降低;(3 蛋白胨中存在的不定量维生素对丙酮酸脱氢酶系(进入TCA循环)和丙酮酸脱羧酶(生成乙 醇)的活性有着重要影响。在外加一定量维生素的前提下,蛋白胨浓度增加,Cx和CETH 也增加:蛋白胨浓度不变,Cx和 ETOH也不变这个事实,充分说明了这一点。由于T. glabrata wSH-IP12也能利用无机氮源生长和产酸,因此,采用蛋白胨和无机氮源相组合的方法, 有可能可以减轻蛋白胨中的不定量维生素带来的负面影响 表5-2-5不同初始葡萄糖浓度和/或碳氮比下的碳平衡 碳氮比 42:1 初始葡萄糖/gL188 葡萄糖 100 细胞量Cx 24 28 丙酮酸C丙酸 乙醇CE 剩余碳 23 ①、②、③与表5-2-4描述的内容相同 适宜的CN对丙酮酸发酵的重要性在流加培养中也得到了体现。氮源缺乏导致葡萄糖 消耗和丙酮酸生产停滞,补加一定量的氮又可使细胞代谢恢复正常。由于氨水也可用作氮 源,因此,我们采用氨水来控制发酵过程的pH(相当于连续提供氮源),发现流加培养也能 正常进行。这一结果同时表明,蛋白胨比无机氮源更适于T. glabrata WSH-IPl2生产丙酮 酸的原因可能是蛋白胨中含有一些特殊因子(如氨基酸类物质)。一旦T. glabrata WSH-IPl2 的发酵过程被适宜浓度的蛋白胨所启动,以铵态氮为氮源也可以获得理想的丙酮酸产量

14 碳 ① 蛋白胨 / gL -1 0 3 7 10 15 20 30 45 60 葡萄糖 100 100 100 100 100 100 100 100 100 细胞量② CX 35 35 32 30 28 29 34 36 37 丙酮酸 C 丙酮酸 14 19 24 30 33 26 21 20 17 乙醇 CETOH 12 8 7 7 7 8 9 10 13 剩余碳③ 39 38 37 33 32 37 36 34 33 ① 以被消耗的葡萄糖中的碳为基准计算。 ② 假设生物量的分子式为 C3.93H7.07O1.96N0.79，灰分含量 3.35%。 ③ 剩余碳包括二氧化碳(大约 25%左右)及其它副产物，如酮戊二酸。 (二)培养基碳氮比对丙酮酸发酵的影响 运用碳平衡的观点对图 5-2-5 和表 5-2-3 的数据进行分析，可以发现(表 5-2-5)，当葡萄 糖和蛋白胨浓度按相同 C/N 提高时，C 丙酮酸下降了 6%，而 CX 和 CETOH 各增加了 16%和 10%。 如果维持蛋白胨浓度不变，而将葡萄糖浓度由 127 g/L 提高到 201 g/L，则 C 丙酮酸下降了 24%， 但 CX 和 CE TOH 却保持不变。这些结果表明∶(1) 较高的初始葡萄糖浓度对丙酮酸产率也有 不利影响，C/N 升高后(即氮源相对缺乏)，这种不利因素就表现得更为突出；(2) C/N 和氮 浓度是控制细胞代谢的重要因素，氮源相对缺乏时，EMP 途径的某些关键酶的合成可能受 阻，结果导致细胞消耗葡萄糖的能力明显下降。Lagunas 等人曾发现，在缺乏氮源的葡萄糖 培养基中培养酵母，不仅酵解途径流量持续下降，细胞转运葡萄糖的能力也不断降低；(3) 蛋白胨中存在的不定量维生素对丙酮酸脱氢酶系(进入 TCA 循环)和丙酮酸脱羧酶(生成乙 醇)的活性有着重要影响。在外加一定量维生素的前提下，蛋白胨浓度增加，CX 和 CE TOH 也增加；蛋白胨浓度不变，CX 和 CETOH 也不变这个事实，充分说明了这一点。由于 T. glabrata WSH-IP12 也能利用无机氮源生长和产酸，因此，采用蛋白胨和无机氮源相组合的方法， 有可能可以减轻蛋白胨中的不定量维生素带来的负面影响。 表 5-2-5 不同初始葡萄糖浓度和/或碳氮比下的碳平衡 碳① 碳氮比 25:1 25:1 42:1 初始葡萄糖 / gL -1 88 127 201 葡萄糖 100 100 100 细胞量② CX 24 28 28 丙酮酸 C 丙酮酸 45 42 32 乙醇 CETOH 5 7 7 剩余碳③ 26 23 33 ①、②、③与表 5-2-4 描述的内容相同 适宜的 C/N 对丙酮酸发酵的重要性在流加培养中也得到了体现。氮源缺乏导致葡萄糖 消耗和丙酮酸生产停滞，补加一定量的氮又可使细胞代谢恢复正常。由于氨水也可用作氮 源，因此，我们采用氨水来控制发酵过程的 pH(相当于连续提供氮源)，发现流加培养也能 正常进行。这一结果同时表明，蛋白胨比无机氮源更适于 T. glabrata WSH-IP12 生产丙酮 酸的原因可能是蛋白胨中含有一些特殊因子(如氨基酸类物质)。一旦 T. glabrata WSH-IP12 的发酵过程被适宜浓度的蛋白胨所启动，以铵态氮为氮源也可以获得理想的丙酮酸产量