第五章丙酮酸发酵过程优化 第一节丙酮酸发酵概述 、引言 二、国外研究水平和发展趋势 、发酵法生产丙酮酸研究中存在的问题 .6 四、本章主要内容 第二节营养条件对光滑球拟酵母WSH-P12生产丙酮酸的影响 引言 二、酵母粉浓度对丙酮酸发酵的影响 三、蛋白胨浓度对丙酮酸发酵的影响 8 四、豆饼水解液和无机氮源对丙酮酸发酵的影响 五、分批培养中供氧方式和培养基碳氮比对丙酮酸发酵的影响…… 六、葡萄糖流加培养中氮的供给对丙酮酸发酵的影响 第三节维生素在丙酮酸过量合成中的重要作用 、引言 二、突变株T. glabrata WSH-IP303的获得及其氮源同化能力 ou35557 三、维生素对 WSH-IP303过量合成丙酮酸的影响 四、维生素亚适量供给下的分批发酵过程 五、讨论 第四节丙酮酸分批发酵的供氧控制模式 、引言 222 二、丙酮酸分批发酵过程的溶氧变化情况 三、不同ka下wSH-P303发酵生产丙酮酸的动力学特征 四、分阶段供氧控制模式的提出和实验验证 五、讨论 第五节丙酮酸发酵过程的代谢网络分析 、引言 二、代谢网络构建和代谢通量计算 三、不同硫胺素浓度和不同DOT下的分批发酵结果 四、不同硫胺素浓度和不同DOT下 NADPH的产生与消耗 2478 五、不同硫胺素浓度和不同DOT下NADH的产生与消耗 六、不同硫胺素浓度和不同DOT下ATP的产生与消耗 七、讨论 第六节丙酮酸发酵的逐级放大和中间试验. 引言 二、30L发酵罐中葡萄糖浓度对wSH-P303菌株生产丙酮酸的影响 三、300L规模的丙酮酸发酵试验 四、5m3规模丙酮酸发酵中试 905
第五章 丙酮酸发酵过程优化.........................................................................................1 第一节 丙酮酸发酵概述.............................................................................................1 一、引言..................................................................................................................1 二、国外研究水平和发展趋势..................................................................................1 三、发酵法生产丙酮酸研究中存在的问题.................................................................6 四、本章主要内容....................................................................................................7 第二节 营养条件对光滑球拟酵母WSH-IP12生产丙酮酸的影响....................................8 一、引言..................................................................................................................8 二、酵母粉浓度对丙酮酸发酵的影响........................................................................8 三、蛋白胨浓度对丙酮酸发酵的影响........................................................................8 四、豆饼水解液和无机氮源对丙酮酸发酵的影响......................................................9 五、分批培养中供氧方式和培养基碳氮比对丙酮酸发酵的影响............................... 10 六、葡萄糖流加培养中氮的供给对丙酮酸发酵的影响............................................. 11 七、讨 论............................................................................................................ 13 第三节 维生素在丙酮酸过量合成中的重要作用........................................................ 15 一、引言................................................................................................................ 15 二、突变株T. glabrata WSH-IP303的获得及其氮源同化能力.................................... 15 三、维生素对WSH-IP303过量合成丙酮酸的影响.................................................... 17 四、维生素亚适量供给下的分批发酵过程............................................................... 20 五、讨论................................................................................................................ 22 第四节 丙酮酸分批发酵的供氧控制模式................................................................... 25 一、引言................................................................................................................ 25 二、丙酮酸分批发酵过程的溶氧变化情况............................................................... 25 三、不同kLa下WSH-IP303发酵生产丙酮酸的动力学特征......................................... 25 四、分阶段供氧控制模式的提出和实验验证........................................................... 27 五、讨论................................................................................................................ 29 第五节 丙酮酸发酵过程的代谢网络分析................................................................... 32 一、引言................................................................................................................ 32 二、代谢网络构建和代谢通量计算......................................................................... 32 三、不同硫胺素浓度和不同DOT下的分批发酵结果 ................................................ 34 四、不同硫胺素浓度和不同DOT下NADPH的产生与消耗........................................ 37 五、不同硫胺素浓度和不同DOT下NADH的产生与消耗.......................................... 38 六、不同硫胺素浓度和不同DOT下ATP的产生与消耗 ............................................. 39 七、讨论................................................................................................................ 41 第六节 丙酮酸发酵的逐级放大和中间试验............................................................... 49 一、引言................................................................................................................ 49 二、30 L发酵罐中葡萄糖浓度对WSH-IP303菌株生产丙酮酸的影响......................... 49 三、300 L规模的丙酮酸发酵试验 ........................................................................... 50 四、5 m3规模丙酮酸发酵中试................................................................................. 51
第五章丙酮酸发酵过程优化 第一节丙酮酸发酵概述 引言 丙酮酸( Pyruvic acid),又称2-氧代丙酸(2- oxopropanoic acid)、α-酮基丙酸 (α- ketopropionic acid或乙酰基甲酸( acetylformic acid),为无色至淡黄色液体,呈醋酸香气 和愉快酸味,是最重要的α-氧代羧酸之一。丙酮酸不仅在生物能量代谢中具有十分重要的 作用,而且是多种有用化合物的前体,因此,它在化工、制药和农用化学品等工业及科学 研究中都有广泛的用途,如表5-1-1所示。 表5-1-1丙酮酸的主要用途 酶法合成L-色氨酸、L-酪氨酸、L多 用于伯醇及仲醇的检定:转氨酶的测 制药工业巴;合成L半胱氨酸、L亮氨酸、VB6生化研究定;是脂肪族胺的显色剂等。 和VB12等。 是合成乙烯系聚合物、氢化阿托酸、 与乳酸组成抗氧化剂,降低对细胞的 农用化学品谷物保护剂等多种农药的起始原料。细胞培养伤害:是动物细胞培养的重要底物 GB2760-19%6规定为酸味添加剂。近 与乳酸、锂构成人工胰脏,作为体外 食品工业年来由于在减肥上有特效而受到西传感器传感器测定葡萄糖的含量。 方消费者青睐 虽然作为一种化工产品,丙酮酸早已实现了工业化生产,但是,直到20世纪90年代 工业上生产丙酮酸的方法仍是酒石酸脱水脱羧法∶将酒石酸与硫酸氢钾混合物在220℃下 蒸馏,馏出物再经真空精馏即可得到丙酮酸。这种工艺的主要缺点是:(1)丙酮酸产率较 低(对酒石酸的产率系数为029~030g/g):(2)得到1g丙酮酸需要消耗5g硫酸氢钾。为此, 在很长一段时间内,丙酮酸的价格居高不下,推广应用自然也受到限制。以丙酮酸在食品 工业中的应用为例,尽管它是一种很有潜力的酸味剂,但由于其在价格上与其它有机酸相 比过于昂贵,因此,几乎没有厂家愿意在饮料或食品中添加丙酮酸来改善风味 开发成本更低的丙酮酸生产技术,如直接发酵法或生物转化法,是扩大丙酮酸应用范 围的根本途径。然而,丙酮酸在代谢途径中所处的关键地位,使得丙酮酸高产菌株的选育 十分困难。尽管有一些微生物能够积累丙酮酸,但其产量无法达到工业化的要求。发酵法 生产丙酮酸真正取得突破,是在1988年。当时,日本东丽工业株式会社的研究人员选育出 系列丙酮酸产量超过50g/L的球拟酵母( Torulopsis)菌株,使得发酵法生产丙酮酸的工业 化成为可能。1992年,日本开始采用发酵法生产丙酮酸,产量为400ta,售价为4000日 元/kg。国内除作者发表的论文外,尚未见关于发酵法生产丙酮酸的公开文献报道。 二、国外研究水平和发展趋势 发酵法生产丙酮酸包括两种方法∶一种是微生物在生长过程中直接利用碳源积累丙酮 酸,即直接发酵法;另一种是微生物先生长,再转化底物为丙酮酸,称之为休止细胞法。 休止细胞法与完整细胞酶法合成丙酮酸的区别在于:后者是利用微生物中某一种具有特定 功能的酶完成由底物(如乳酸)向丙酮酸的转化;而前者则是利用微生物中的一系列酶(如 EMP途径酶系)完成由底物(如葡萄糖)生成丙酮酸的转化过程。因此,休止细胞法也可归广 义的发酵法。 (一)酵母直接发酵生产丙酮酸
1 第五章 丙酮酸发酵过程优化 第一节 丙酮酸发酵概述 一、引言 丙酮酸 (Pyruvic acid) ，又称 2- 氧 代 丙 酸 (2-oxopropanoic acid) 、 - 酮基丙酸 (-ketopropionic acid)或乙酰基甲酸(acetylformic acid)，为无色至淡黄色液体，呈醋酸香气 和愉快酸味，是最重要的-氧代羧酸之一。丙酮酸不仅在生物能量代谢中具有十分重要的 作用，而且是多种有用化合物的前体，因此，它在化工、制药和农用化学品等工业及科学 研究中都有广泛的用途，如表 5-1-1 所示。 表5-1-1 丙酮酸的主要用途 用 途 实 例 用 途 实 例 制药工业 酶法合成 L-色氨酸、L-酪氨酸、L-多 巴；合成 L-半胱氨酸、L-亮氨酸、VB6 和 VB12 等。 生化研究 用于伯醇及仲醇的检定；转氨酶的测 定；是脂肪族胺的显色剂等。 农用化学品 是合成乙烯系聚合物、氢化阿托酸、 谷物保护剂等多种农药的起始原料。 细胞培养 与乳酸组成抗氧化剂，降低对细胞的 伤害；是动物细胞培养的重要底物。 食品工业 GB 2760-1996 规定为酸味添加剂。近 年来由于在减肥上有特效而受到西 方消费者青睐。 传感器 与乳酸、锂构成人工胰脏，作为体外 传感器测定葡萄糖的含量。 虽然作为一种化工产品，丙酮酸早已实现了工业化生产，但是，直到 20 世纪 90 年代， 工业上生产丙酮酸的方法仍是酒石酸脱水脱羧法∶将酒石酸与硫酸氢钾混合物在220 ℃下 蒸馏，馏出物再经真空精馏即可得到丙酮酸。这种工艺的主要缺点是∶(1) 丙酮酸产率较 低(对酒石酸的产率系数为 0.29～0.30 g/g)；(2)得到 1 g 丙酮酸需要消耗 5 g 硫酸氢钾。为此， 在很长一段时间内，丙酮酸的价格居高不下，推广应用自然也受到限制。以丙酮酸在食品 工业中的应用为例，尽管它是一种很有潜力的酸味剂，但由于其在价格上与其它有机酸相 比过于昂贵，因此，几乎没有厂家愿意在饮料或食品中添加丙酮酸来改善风味。 开发成本更低的丙酮酸生产技术，如直接发酵法或生物转化法，是扩大丙酮酸应用范 围的根本途径。然而，丙酮酸在代谢途径中所处的关键地位，使得丙酮酸高产菌株的选育 十分困难。尽管有一些微生物能够积累丙酮酸，但其产量无法达到工业化的要求。发酵法 生产丙酮酸真正取得突破，是在 1988 年。当时，日本东丽工业株式会社的研究人员选育出 一系列丙酮酸产量超过 50 g/L 的球拟酵母(Torulopsis)菌株，使得发酵法生产丙酮酸的工业 化成为可能。1992 年，日本开始采用发酵法生产丙酮酸，产量为 400 t/a，售价为 4000 日 元/kg。国内除作者发表的论文外，尚未见关于发酵法生产丙酮酸的公开文献报道。 二、国外研究水平和发展趋势 发酵法生产丙酮酸包括两种方法∶一种是微生物在生长过程中直接利用碳源积累丙酮 酸，即直接发酵法；另一种是微生物先生长，再转化底物为丙酮酸，称之为休止细胞法。 休止细胞法与完整细胞酶法合成丙酮酸的区别在于∶后者是利用微生物中某一种具有特定 功能的酶完成由底物(如乳酸)向丙酮酸的转化；而前者则是利用微生物中的一系列酶(如 EMP 途径酶系)完成由底物(如葡萄糖)生成丙酮酸的转化过程。因此，休止细胞法也可归广 义的发酵法。 (一)酵母直接发酵生产丙酮酸
在直接发酵法生产丙酮酸的菌株中,酵母是研究得最多的一种。表5-1-2中对酵母发 酵生产丙酮酸的情况进行了总结,从中可以了解到近30年来国外学者在利用酵母生产丙酮 酸方面的研究进展 表5-1-2以酵母为菌种直接发酵生产丙酮酸的研究情况一览 菌株 遗传特点 碳源 氮源 度时间丙酮酸产率反应器 /g L/gg Candida 可利用脂肪酸乙酰胺玉米浆31.572150.15 摇瓶 酰胺为碳源 丙酸(NH42SO431.572220.22 摇瓶 NH4NO3 Candida 硫胺素、蛋氨酸葡萄糖NH4NO3307243.60.44 摇瓶 营养缺陷型 Debaryomyces 柑桔皮(NH4)2SO4304811.5 摇瓶 coudert 水解物NHNO3 Debaryomyces硫胺素、生物素葡萄糖蛋白胨289642 0.42 摇瓶 营养缺陷型 Saccharomyces硫胺素营养缺葡萄糖 304836.9 摇瓶 陷型 Torulopsis sp硫胺素营养缺葡萄糖蛋白胨(含生306040.70.41 陷型 Torulopsis sp 精氨酸营养缺葡萄糖聚胨30 49.3 摇瓶 陷型 Torulopsis sp.异亮氨酸、缬氨葡萄糖聚胨306050 摇瓶 酸营养缺陷型 Torulopsis sp.氨基羟基乙酸葡萄糖聚胨3060210.52 摇瓶 抗性 硫胺素、生物葡萄糖蛋白胨30602730.54 摇瓶 素、精氨酸缺陷 型,氨基羟基乙 酸抗性 2-脱氧葡萄糖葡萄糖蛋白胨30 0.52 抗性 PDC活性降低葡萄糖蛋白胨30 56.8 0.58 Torulopsis 硫胺素、生物葡萄糖聚胨305957 0.57 摇瓶 glabrata 素、吡哆醇、烟 酸营养缺陷型 硫胺素、生物葡萄糖聚胨30 367.8 0.493L发酵罐 glabrata 素、吡哆醇、烟 酸营养缺陷型 嗜盐 葡萄糖NH4C130 02 摇瓶 KNO3 嗜盐 葡萄糖酪蛋白30 10d5.1 0.10 1L发酵罐 etchellsii 氨基酸
2 在直接发酵法生产丙酮酸的菌株中，酵母是研究得最多的一种。表 5-1-2 中对酵母发 酵生产丙酮酸的情况进行了总结，从中可以了解到近 30 年来国外学者在利用酵母生产丙酮 酸方面的研究进展。 表 5-1-2 以酵母为菌种直接发酵生产丙酮酸的研究情况一览 菌株 遗传特点 碳源 氮源 温度 /℃ 时间 / h 丙酮酸 / gL -1 产率 / gg -1 反应器 Candida lipolytica 可利用脂肪酸 酰胺为碳源 乙酰胺 玉米浆 31.5 72 1.5 0.15 摇瓶 Candida maltosa 丙酸 (NH4)2SO4 NH4NO3 31.5 72 2.2 0.22 摇瓶 Candida lipolytica 硫胺素、蛋氨酸 营养缺陷型 葡萄糖 NH4NO3 30 72 43.6 0.44 摇瓶 Debaryomyces coudertii 柑桔皮 水解物 (NH4)2SO4 NH4NO3 30 48 11.5 摇瓶 Debaryomyces hansenii 硫胺素、生物素 营养缺陷型 葡萄糖 蛋白胨 28 96 42 0.42 摇瓶 Saccharomyces cerevisiae 硫胺素营养缺 陷型 葡萄糖 30 48 36.9 0.37 摇瓶 Torulopsis sp. 硫胺素营养缺 陷型 葡萄糖 蛋白胨(含生 物素) 30 60 40.7 0.41 摇瓶 Torulopsis sp. 精氨酸营养缺 陷型 葡萄糖 聚胨 30 60 49.3 0.49 摇瓶 Torulopsis sp. 异亮氨酸、缬氨 酸营养缺陷型 葡萄糖 聚胨 30 60 50 0.50 摇瓶 Torulopsis sp. 氨基羟基乙酸 抗性 葡萄糖 聚胨 30 60 52.1 0.52 摇瓶 Torulopsis Glabrata 硫胺素、生物 素、精氨酸缺陷 型，氨基羟基乙 酸抗性 葡萄糖 蛋白胨 30 60 27.3 0.54 摇瓶 Torulopsis sp. 2-脱氧葡萄糖 抗性 葡萄糖 蛋白胨 30 60 52.1 0.52 摇瓶 Torulopsis sp. PDC活性降低 葡萄糖 蛋白胨 30 60 56.8 0.58 摇瓶 Torulopsis glabrata 硫胺素、生物 素、吡哆醇、烟 酸营养缺陷型 葡萄糖 聚胨 30 59 57 0.57 摇瓶 Torulopsis glabrata 硫胺素、生物 素、吡哆醇、烟 酸营养缺陷型 葡萄糖 聚胨 30 63 67.8 0.49 3 L发酵罐 Torulopsis etchellsii 嗜盐 葡萄糖 NH4Cl KNO3 30 14 d 1.08 0.02 摇瓶 Torulopsis etchellsii 嗜盐 葡萄糖 酪蛋白 氨基酸 30 10 d 5.1 0.10 1 L发酵罐
葡萄糖 乙醇 丙酮 氨基酸 乙酰辅醇AⅢ 檬酸草酰乙酸 TCA循环 图5-1-1光滑球拟酵母中丙酮酸的代谢途径 I:丙酮酸脱羧酶(PDC);Ⅱ:转氨酶:Ⅲ:丙酮酸羧化酶(PC):Ⅳ:丙酮酸脱氢酶系PDH) B1:硫胺素:B6:吡哆醇;Bio:生物素 球拟酵母( Torulopsis)属菌株,特别是烟酸、硫胺素、吡哆醇和生物素四种维生素的营 养缺陷型T. glabrata IFO005,5是发酵法生产丙酮酸的首选菌株。T. glabrata的维生素营养 缺陷型能够积累丙酮酸的生理学依据如图5-1-1所示。烟酸和硫胺素是丙酮酸脱氢酶系的 辅因子;生物素是丙酮酸羧化酶的辅因子;吡哆醇是转氨酶的辅因子;硫胺素是丙酮酸脱 羧酶的辅因子。由于营养缺陷型菌株自身不能合成这些维生素,当培养基中这些维生素的 浓度处于亚适量水平时,负责丙酮酸降解或转化的四种酶的活性均较低,于是丙酮酸得以 积累。 在一般培养条件下, T. glabrata IFO0005对葡萄糖的丙酮酸产率为0.41g/g。米原辙对 该菌株进行诱变,增加一系列遗传标记(如L-^rg营养缺陷型;LVal和L-Ie营养缺陷型 2-脱氧葡萄糖抗性和氨基羟基乙酸抗性)以后,丙酮酸产率可提高到0.54gg。为了减少突 变株产乙醇的能力,进一步提高丙酮酸产率,米原辙又通过选育乙酸营养缺陷型菌株,有 效地降低了突变株的PDC活性,使丙酮酸产率提高到0.58g/g。尽管经过研究者的不懈努 力,摇瓶发酵中的丙酮酸产量和产率已分别达到568gL和0.58gg,但要获得丙酮酸高产 量与高产率的统一却并非易事。如,日本东丽化学公司采用流加培养技术,在3L发酵罐 中丙酮酸产量达到678g/,然而丙酮酸产率仅为049gg 嗜盐酵母 Torulopsis etchellsii能在含盐量达80g的葡萄糖培养基中积累丙酮酸,但 产率很低。硫胺素营养缺陷型菌株 Candida lipolytica、 Debaryomyces hansenii和 Saccharomyces cerevisiae积累丙酮酸的能力也不弱。其产率(0.37~0.44gg)虽然不及T labrada,但这些酵母能以无机铵盐为唯一氮源,而这一特点又是T. glabrata所不具备的。 日本开展发酵法生产丙酮酸的研究的公司主要有3家。20世纪70年代是味之素发酵 株式会社,以研究假丝酵母( Candida)为主;80~90年代则是东丽工业株式会社,以研究球 拟酵母( Torulopsis)为主;另一家公司( Toyobo Co.Ltd)发表的专利和研究报告略少,以研究 德巴利酵母( Debaryomyces)为主。这些公司之间的竟争,是推动日本发酵法生产丙酮酸迅速 实现工业化的动力 3
3 葡萄糖 乙醇 丙酮酸 氨基酸 乙酰辅酶 A B1 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ B6 B1 NA Bio 柠檬酸 草酰乙酸 TCA 循环 图5-1-1 光滑球拟酵母中丙酮酸的代谢途径 Ⅰ: 丙酮酸脱羧酶(PDC)；Ⅱ: 转氨酶；Ⅲ: 丙酮酸羧化酶(PC)；Ⅳ: 丙酮酸脱氢酶系(PDH) NA∶烟酸；B1∶硫胺素；B6∶吡哆醇；Bio∶生物素 球拟酵母(Torulopsis)属菌株，特别是烟酸、硫胺素、吡哆醇和生物素四种维生素的营 养缺陷型 T. glabrata IFO 0005，是发酵法生产丙酮酸的首选菌株。T. glabrata 的维生素营养 缺陷型能够积累丙酮酸的生理学依据如图 5-1-1 所示。烟酸和硫胺素是丙酮酸脱氢酶系的 辅因子；生物素是丙酮酸羧化酶的辅因子；吡哆醇是转氨酶的辅因子；硫胺素是丙酮酸脱 羧酶的辅因子。由于营养缺陷型菌株自身不能合成这些维生素，当培养基中这些维生素的 浓度处于亚适量水平时，负责丙酮酸降解或转化的四种酶的活性均较低，于是丙酮酸得以 积累。 在一般培养条件下，T. glabrata IFO 0005 对葡萄糖的丙酮酸产率为 0.41 g/g。米原辙对 该菌株进行诱变，增加一系列遗传标记(如 L-Arg 营养缺陷型；L-Val 和 L-Ile 营养缺陷型； 2-脱氧葡萄糖抗性和氨基羟基乙酸抗性)以后，丙酮酸产率可提高到 0.54 g/g。为了减少突 变株产乙醇的能力，进一步提高丙酮酸产率，米原辙又通过选育乙酸营养缺陷型菌株，有 效地降低了突变株的 PDC 活性，使丙酮酸产率提高到 0.58 g/g。尽管经过研究者的不懈努 力，摇瓶发酵中的丙酮酸产量和产率已分别达到 56.8 g/L 和 0.58 g/g，但要获得丙酮酸高产 量与高产率的统一却并非易事。如，日本东丽化学公司采用流加培养技术，在 3 L 发酵罐 中丙酮酸产量达到 67.8 g/L，然而丙酮酸产率仅为 0.49 g/g。 嗜盐酵母 Torulopsis etchellsii 能在含盐量达 80 g/L 的葡萄糖培养基中积累丙酮酸，但 产 率 很低 。硫 胺素 营养 缺陷 型菌 株 Candida lipolytica 、 Debaryomyces hansenii 和 Saccharomyces cerevisiae 积累丙酮酸的能力也不弱。其产率(0.37～0.44 g/g)虽然不及 T. glabrata，但这些酵母能以无机铵盐为唯一氮源，而这一特点又是 T. glabrata 所不具备的。 日本开展发酵法生产丙酮酸的研究的公司主要有 3 家。20 世纪 70 年代是味之素发酵 株式会社，以研究假丝酵母(Candida)为主；80～90 年代则是东丽工业株式会社，以研究球 拟酵母(Torulopsis)为主；另一家公司(Toyobo Co. Ltd.)发表的专利和研究报告略少，以研究 德巴利酵母(Debaryomyces)为主。这些公司之间的竞争，是推动日本发酵法生产丙酮酸迅速 实现工业化的动力
(二)细菌或放线菌直接发酵生产丙酮酸 在已有的文献报道中,酵母积累丙酮酸一般都以葡萄糖为底物。相对而言,细菌积累 丙酮酸时所能利用的底物种类更多一些。如表5-1-3所示,能直接利用葡萄糖为底物积累 丙酮酸的细菌只有大肠杆菌(E.col。另有许多细菌能以葡萄糖酸、丙二醇和丙酸为底物生 产丙酮酸。这些细菌通常没有明显的与丙酮酸代谢有关的遗传标记,其丙酮酸产率虽然不 是很低(介于03~04gg之间),但丙酮酸产量最高仅为23g/L( Nocardia fumifera以葡萄糖 酸为底物积累丙酮酸)。如此低的产量注定这些研究在目前还只能处于实验室阶段 表5-1-3以细菌或放线菌为菌种直接发酵生产丙酮酸的研究情况一览 菌株 遗传特点 碳源 氮源温度时间丙酮酸产率反应器 葡萄糖 0.38 Escherichia coli 硫辛酸缺陷型葡萄糖聚胨372 发酵罐 Escherichia coli 硫辛酸缺陷型,葡萄糖 聚胨372430 0.60 缺失F1-ATP酶 发酵罐 活性 Nocardia lutea 丙酸(NH4)2SO431.5722.50.25摇瓶 NHaNO3 Nocardia fiumifera 0.46 Pseudomonas tabari 葡萄糖酸(NH4SO430 摇瓶 0.26 Pseudomonas shuter 葡萄糖酸(NH4)2SO43014412 0.24 摇瓶 葡萄糖酸酵母膏30 0.32 1,2-丙二醇铵盐28 摇瓶 cinetobacter sp 硫胺素缺陷型1,2-丙二醇聚胨289611.60.58摇瓶 Pseudomo烟酸sp 1,2-丙二醇NH4NO330 与 Miyata等选育T. glabrata的多重维生素营养缺陷型不同的是, Yokota选育的E.coli w485l2遗传标记非常简单,仅为硫辛酸营养缺陷型。硫辛酸也是PDH的辅因子,在硫 辛酸亚适量供给的情况下,E. coli W1485lp2过量积累丙酮酸的原理与T. glabrata IFo0005 是基本相同的。 Yokota认为硫辛酸营养缺陷型比硫胺素营养缺陷型性能更佳,其原因是由 于硫胺素是磷酸戊糖途径中转酮酶的辅因子,故磷酸戊糖途径的活性在. glabrata的硫胺 素营养缺陷型中会受到影响,但在E.co的硫辛酸营养缺陷型中则不会。E.colW485lp2 培养32h时丙酮酸产率达0.5lgg,而以该菌株为出发菌株构建的缺失F1-ATP酶活性的 E. coli tbla-1培养24h时丙酮酸产率就达到了0.6g参见表5-1-3)。其原因是:E.col IBLA-1缺失F1-ATP酶活性后,通过氧化磷酸化途径形成的ATP减少,细胞整体能量水 平下降,葡萄糖分解速度加快,从而使得丙酮酸积累速度显著提髙 细菌发酵生产丙酮酸的另一个特点是:培养基的pH一般在70左右甚至更高一些。这意 味着可以构建一个发酵生产丙酮酸一酶法合成色氨酸的耦合系统。 Yokota和 Takao先在含50 g/葡萄糖的培养基中培养 Agaricus campe stria,待发酵液中丙酮酸产量达到2~-26g/时, 加入具有色氨酸酶活性的 Enterobacter aerogenes、吲哚和氯化铵,转化12h后L-Tp产量达 到15g/L。这一耦合系统随后又有新的发展, Yokota筛选了具有色氨酸酶活性的 Enterobacter aerogenes的硫辛酸营养缺陷型(可积累丙酮酸)。待发酵液中丙酮酸产量达到17g时,只需
4 (二)细菌或放线菌直接发酵生产丙酮酸 在已有的文献报道中，酵母积累丙酮酸一般都以葡萄糖为底物。相对而言，细菌积累 丙酮酸时所能利用的底物种类更多一些。如表 5-1-3 所示，能直接利用葡萄糖为底物积累 丙酮酸的细菌只有大肠杆菌(E. coli)。另有许多细菌能以葡萄糖酸、丙二醇和丙酸为底物生 产丙酮酸。这些细菌通常没有明显的与丙酮酸代谢有关的遗传标记，其丙酮酸产率虽然不 是很低(介于 0.3～0.4 g/g 之间)，但丙酮酸产量最高仅为 23 g/L (Nocardia fumifera 以葡萄糖 酸为底物积累丙酮酸)。如此低的产量注定这些研究在目前还只能处于实验室阶段。 表5-1-3 以细菌或放线菌为菌种直接发酵生产丙酮酸的研究情况一览 菌株 遗传特点 碳源 氮源 温度 / ℃ 时间 / h 丙酮酸 / gL -1 产率 / gg -1 反应器 Schizophyllum commune 葡萄糖 聚胨 27 120 19 0.38 摇瓶 Escherichia coli 硫辛酸缺陷型 葡萄糖 聚胨 37 32 25.5 0.51 5 L 发酵罐 Escherichia coli 硫辛酸缺陷型, 缺失F1-ATP酶 活性 葡萄糖 聚胨 37 24 30 0.60 5 L 发酵罐 Nocardia lutea 丙酸 (NH4)2SO4 NH4NO3 31.5 72 2.5 0.25 摇瓶 Nocardia fumifera 葡萄糖酸 (NH4)2SO4 30 96 23 0.46 Pseudomonas tabati 摇瓶 13 0.26 Pseudomonas stutzeri 葡萄糖酸 (NH4)2SO4 30 144 12 0.24 摇瓶 Enterococcus casseliflavus 葡萄糖酸 酵母膏 30 72 16 0.32 摇瓶 Corynebacterium sp. 1,2-丙二醇 铵盐 28 8.1 0.41 摇瓶 Acinetobacter sp. 硫胺素缺陷型 1,2-丙二醇 聚胨 28 96 11.6 0.58 摇瓶 Pseudomo烟酸s sp. 1,2-丙二醇 NH4NO3 30 72 14 0.35 摇瓶 与 Miyata 等选育 T. glabrata 的多重维生素营养缺陷型不同的是，Yokota 选育的 E. coli W1485lip2 遗传标记非常简单，仅为硫辛酸营养缺陷型。硫辛酸也是 PDH 的辅因子，在硫 辛酸亚适量供给的情况下，E. coli W1485lip2 过量积累丙酮酸的原理与 T. glabrata IFO 0005 是基本相同的。Yokota 认为硫辛酸营养缺陷型比硫胺素营养缺陷型性能更佳，其原因是由 于硫胺素是磷酸戊糖途径中转酮酶的辅因子，故磷酸戊糖途径的活性在 T. glabrata 的硫胺 素营养缺陷型中会受到影响，但在 E. coli 的硫辛酸营养缺陷型中则不会。E. coli W1485lip2 培养 32 h 时丙酮酸产率达 0.51 g/g，而以该菌株为出发菌株构建的缺失 F1-ATP 酶活性的 E. coli TBLA-1 培养 24 h 时丙酮酸产率就达到了 0.6 g/g(参见表 5-1-3)。其原因是∶E. coli TBLA-1 缺失 F1-ATP 酶活性后，通过氧化磷酸化途径形成的 ATP 减少，细胞整体能量水 平下降，葡萄糖分解速度加快，从而使得丙酮酸积累速度显著提高。 细菌发酵生产丙酮酸的另一个特点是∶培养基的pH一般在7.0左右甚至更高一些。这意 味着可以构建一个发酵生产丙酮酸─酶法合成色氨酸的耦合系统。Yokota和Takao先在含50 g/L葡萄糖的培养基中培养Agaricus campestris，待发酵液中丙酮酸产量达到22～26 g/L时， 加入具有色氨酸酶活性的Enterobacter aerogenes、吲哚和氯化铵，转化12 h后L-Trp产量达 到15 g/L。这一耦合系统随后又有新的发展，Yokota筛选了具有色氨酸酶活性的Enterobacter aerogenes的硫辛酸营养缺陷型(可积累丙酮酸)。待发酵液中丙酮酸产量达到17 g/L时，只需