且较高的铵离子浓度(10.3g/L)没有对细胞代谢产生明显的抑制作用 第三节维生素在丙酮酸过量合成中的重要作用 引言 在有关发酵法生产丙酮酸的研究中,米原辙和宫田令子报道的 Torulopsis glabrata IFO00563h流加发酵,丙酮酸产量达678g(对葡萄糖产率0494g/g)和 Yokota等报道的 缺乏F1-AP酶活力的Eco经24h发酵,丙酮酸产量达30g/L(对葡萄糖产率0.6g/g),是目 前该领域的最高研究水平。目前日本已用于工业上生产丙酮酸的菌株可能是7. glabrata。采 用T. glabrata发酵生产丙酮酸的主要问题是对葡萄糖的产率不太高,一般只能达到0.5~ 0.53gg。由于丙酮酸处于细胞代谢的关键节点上,要提高丙酮酸的产率和生产强度,必须 在抑制负责丙酮酸降解的诸多酶(系)活性的基础上加速糖酵解 多重维生素营养缺陷型菌株T. glabrata中负责丙酮酸降解的酶(系)活性是受培养基中 维生素的水平控制的,阐明其相互作用关系并优化其浓度,对实现丙酮酸发酵高产率与高 生产强度的统一非常重要。然而,迄今为止,日本学者只是在以蛋白胨为氮源的培养基中, 用单因素试验方法初步考察了维生素对丙酮酸生产的影响。蛋白胨中的维生素足以满足细 胞生长,这一结论是基于日本九州工业大学清水和幸等人的实验数据不加维生素的种子 培养基(蛋白胨浓度为30g/L)照样可以使细胞生长良好。我们在研究中也发现了类似现象。 由于蛋白胨的种类和质量通常是随生产批次而变化的,因此,以蛋白胨为氮源进行研究 很难阐明 T. glabrata对维生素的确切需求,也就很难使丙酮酸的产率有较大的提高 在第二节中,我们发现T. glabrata WSH-IPl2能够利用无机氮源生长,但丙酮酸产量 不佳。理想地,细胞应具有以无机氮化合物为唯一氮源生长并大量积累丙酮酸的能力。这 样,一方面可以在一个全合成培养基中很方便地研究各种维生素对代谢途径的影响,另 方面,也有利于将来实现工业化生产。基于这一思路,我们筛选得到了一株能以NH4C1为 唯一氮源生长和大量产酸的突变株T. glabrata WSh-IP303。在此基础上,详细考察了外加 该菌株所缺陷的维生素对其积累丙酮酸的影响,并确定了较优的浓度组合。 二、突变株. glabrata Wsh-IP303的获得及其氮源同化能力 对经EMS诱变后获得54株CM平板上透明圈较大的菌株进行初筛,结果如图5-3-1所示 以NH4Cl为唯一氮源时,有3株菌的丙酮酸生产能力较出发菌株有所提高,其中有8株菌的 提高幅度在35%以上。对这8株菌进行维生素营养缺陷型验证,发现它们仍为烟酸、硫胺素、 吡哆醇和生物素四种维生素的营养缺陷型 对这8株菌进行复筛,同时考察它们在连续传代过程中合成丙酮酸的稳定性,结果列于 表5-3-1。突变株wSH-P303、IP312和P1225在传代过程中丙酮酸产生能力强且稳定,而其 余5株菌在传代3次后,丙酮酸产生能力均下降了20%左右。综合考虑丙酮酸产生能力和菌 株的遗传稳定性,我们确定wSH-IP303为研究用菌株。以NHC为唯一氮源时,其丙酮酸 产量比出发株提高近60%
15 且较高的铵离子浓度(10.3 g/L)没有对细胞代谢产生明显的抑制作用。 第三节 维生素在丙酮酸过量合成中的重要作用 一、引言 在有关发酵法生产丙酮酸的研究中，米原辙和宫田令子报道的Torulopsis glabrata IFO0005经63 h流加发酵，丙酮酸产量达67.8 g/L(对葡萄糖产率0.494 g/g)和Yokota等报道的 缺乏F1-ATP酶活力的E. coli 经24 h发酵，丙酮酸产量达30 g/L(对葡萄糖产率0.6 g/g)，是目 前该领域的最高研究水平。目前日本已用于工业上生产丙酮酸的菌株可能是T. glabrata。采 用T. glabrata 发酵生产丙酮酸的主要问题是对葡萄糖的产率不太高，一般只能达到0.5～ 0.53 g/g。由于丙酮酸处于细胞代谢的关键节点上，要提高丙酮酸的产率和生产强度，必须 在抑制负责丙酮酸降解的诸多酶(系)活性的基础上加速糖酵解。 多重维生素营养缺陷型菌株T. glabrata 中负责丙酮酸降解的酶(系)活性是受培养基中 维生素的水平控制的，阐明其相互作用关系并优化其浓度，对实现丙酮酸发酵高产率与高 生产强度的统一非常重要。然而，迄今为止，日本学者只是在以蛋白胨为氮源的培养基中， 用单因素试验方法初步考察了维生素对丙酮酸生产的影响。蛋白胨中的维生素足以满足细 胞生长，这一结论是基于日本九州工业大学清水和幸等人的实验数据∶不加维生素的种子 培养基(蛋白胨浓度为30 g/L)照样可以使细胞生长良好。我们在研究中也发现了类似现象。 由于蛋白胨的种类和质量通常是随生产批次而变化的，因此，以蛋白胨为氮源进行研究， 很难阐明T. glabrata 对维生素的确切需求，也就很难使丙酮酸的产率有较大的提高。 在第二节中，我们发现 T. glabrata WSH-IP12 能够利用无机氮源生长，但丙酮酸产量 不佳。理想地，细胞应具有以无机氮化合物为唯一氮源生长并大量积累丙酮酸的能力。这 样，一方面可以在一个全合成培养基中很方便地研究各种维生素对代谢途径的影响，另一 方面，也有利于将来实现工业化生产。基于这一思路，我们筛选得到了一株能以 NH4Cl 为 唯一氮源生长和大量产酸的突变株 T. glabrata WSH-IP303。在此基础上，详细考察了外加 该菌株所缺陷的维生素对其积累丙酮酸的影响，并确定了较优的浓度组合。 二、突变株 T. glabrata WSH-IP303 的获得及其氮源同化能力 对经EMS诱变后获得54株CM平板上透明圈较大的菌株进行初筛，结果如图5-3-1所示。 以NH4Cl为唯一氮源时，有33株菌的丙酮酸生产能力较出发菌株有所提高，其中有8株菌的 提高幅度在35%以上。对这8株菌进行维生素营养缺陷型验证，发现它们仍为烟酸、硫胺素、 吡哆醇和生物素四种维生素的营养缺陷型。 对这8株菌进行复筛，同时考察它们在连续传代过程中合成丙酮酸的稳定性，结果列于 表5-3-1。突变株WSH-IP303、IP312和IP1225在传代过程中丙酮酸产生能力强且稳定，而其 余5株菌在传代3次后，丙酮酸产生能力均下降了20%左右。综合考虑丙酮酸产生能力和菌 株的遗传稳定性，我们确定WSH-IP303为研究用菌株。以NH4Cl为唯一氮源时，其丙酮酸 产量比出发株提高近60%
出发菌株 10~1818~2020~2222~2525~3030~ 丙酮酸/g 图5-3-1以NH4C为唯一氮源的突变株的丙酮酸生产能力比较 表5-3-1以NH4C1为唯一氮源的8株较优突变株在传代过程中的丙酮酸生产能力 丙酮酸/gL 菌株 第1代 第2代 第3代 WSH-IP12 21.8 21.0 WSH-IP303 35.3 35.2 WSH-IP312 33.0 32.8 32.5 WSH-IP 33.6 32.8 33.0 WSH-IP 30.3 279 WSH-IP1228 35.4 31.2 29.3 WSH-IP122OP 36.9 33.4 30.2 WSH-IP1236P 32.5 29.9 WSH-IP2 14 33.6 30.8 26.9 突变株WSH-IP303对氮源的同化实验表明(图5-3-2),该菌株在以NH4Cl、(NH4)2SO4 (NH)HPO和尿素为唯一氮源的培养基中生长非常好,随着无机氮源浓度的增加,菌株的 生长略受抑制,但不是非常明显。由于该菌株是在以№HCl为唯一氮源的平板上筛选出来 的,因此,以NH4Cl为唯一氮源的丙酮酸产量均比其它无机铵盐高。有趣的是,与第二节 结论相反,蛋白胨不再是生产丙酮酸的最佳氮源,其浓度要达到20g以上,才能使T labrada wsh-lp303的生长达到与利用无机氮源相当的水平,并且丙酮酸产量不高。图5-3-2 的结果还表明,尿素也是一种非常适合T. glabrata WSH-IP303生产丙酮酸的氮源物质,但 由于铵离子的测定比较简单,故我们仍选用NH4C1为氮源,其浓度确定为7gL(氮浓度为1.8 70 0.9121.51.82.12.42.73.0 0.91.21.51.82.1242.73.0 氮质量浓度/gL 氮质量浓度/gL
16 0 10 20 10～18 18～20 20～22 22～25 25～30 30～ 丙酮酸 / gL -1 菌株数量 出发菌株 图5-3-1 以NH4Cl为唯一氮源的突变株的丙酮酸生产能力比较 表5-3-1 以NH4Cl为唯一氮源的8株较优突变株在传代过程中的丙酮酸生产能力 菌株 丙酮酸 / gL -1 第1代 第2代 第3代 WSH-IP12 21.5 21.8 21.0 WSH-IP303 35.3 35.2 34.8 WSH-IP312 33.0 32.8 32.5 WSH-IP1225 33.6 32.8 33.0 WSH-IP1226 35.1 30.3 27.9 WSH-IP1228 35.4 31.2 29.3 WSH-IP1220P 36.9 33.4 30.2 WSH-IP1236P 35.1 32.5 29.9 WSH-IP214 33.6 30.8 26.9 突变株WSH-IP303对氮源的同化实验表明(图5-3-2)，该菌株在以NH4Cl、(NH4)2SO4、 (NH4)2HPO4和尿素为唯一氮源的培养基中生长非常好，随着无机氮源浓度的增加，菌株的 生长略受抑制，但不是非常明显。由于该菌株是在以NH4Cl为唯一氮源的平板上筛选出来 的，因此，以NH4Cl为唯一氮源的丙酮酸产量均比其它无机铵盐高。有趣的是，与第二节 结论相反，蛋白胨不再是生产丙酮酸的最佳氮源，其浓度要达到20 g/L以上，才能使T. glabrata WSH-IP303的生长达到与利用无机氮源相当的水平，并且丙酮酸产量不高。图5-3-2 的结果还表明，尿素也是一种非常适合T. glabrata WSH-IP303生产丙酮酸的氮源物质，但 由于铵离子的测定比较简单，故我们仍选用NH4Cl为氮源，其浓度确定为7 g/L (氮浓度为1.8 g/L)。 40 50 60 70 80 90 0.9 1.2 1.5 1.8 2.1 2.4 2.7 3.0 细胞生长 / OD660 10 20 30 40 0.9 1.2 1.5 1.8 2.1 2.4 2.7 3.0 氮质量浓度 / gL -1 丙酮酸 / gL-1 氮质量浓度 / gL -1
图5-3-2T. glabrata WSh-P303对氮源的同化能力 ●蛋白胨,口(NH2SO,■(NH4)HPO; O Urea,△NHCl 含氮化合物以相同的含氮量加入培养基。蛋白胨中氮质量分数为0.1g/g。发酵培养基中含有0.03mgL 硫胺素,8mg烟酸,0.03mgL生物素,0.3mgL吡哆醇和0.15mg/L核黄素← 三、维生素对WSH-P303过量合成丙酮酸的影响 T. glabrata Wsh-IP303能够以氯化铵为唯一氮源大量积累丙酮酸,这意味着可以在 个全合成培养基中,对维生素的影响进行深入研究。首先利用单因素试验考察了烟酸、硫 胺素、吡哆醇、生物素和核黄素对丙酮酸发酵的影响。核黄素虽然不是T. glabrata wSH-IP303缺陷的维生素,但其作为FAD的前体,有可能影响电子传递链的活性,因此 并进行了研究(图5-3-3) 古 么么么么么么么么么 么么么么 00526101500.010030080.200.10.20.511.500.010030080.200.10204 烟酸/mgL1 硫胺素/mgL 吡哆醇/mgL 生物素/mgL1核黄素/mgL 图5-3-3维生素浓度对T. glabrata WSh-P303发酵生产丙酮酸的影响(单因素试验) 表5-3-2L16(45)正交试验因素水平表 因素\水平 A:烟酸/mgL2468 B:硫胺素/mgL10.010.02003004 C:吡哆醇/mgL10.10.20.30.4 D.生物素/mgL10.010.020030.04 E:核黄素/mgL100.050.10.15 维生素单因素试验结果表明:(1)培养基中若缺乏烟酸、硫胺素、吡哆醇和生物素四 种维生素的任何一种,细胞生长均很弱(数据未显示),丙酮酸产量也很低;(2)细胞生长不 需要核黄素(数据未显示),但添加适量核黄素对丙酮酸生产有一定的促进作用;(3)T glabrata wsh-IP303积累丙酮酸时,对不同维生素浓度变化的敏感程度不同。据此,我们认 为,进一步考察烟酸、硫胺素、吡哆醇和生物素这四种维生素在T. glabrata WSH-IP303过 量合成丙酮酸中的作用,阐明它们对丙酮酸合成与分解途径的影响,并得到优化的浓度组 合,对实现高水平的丙酮酸发酵来说是非常必要的。 实际工作中,我们采用正交试验来考察这五种维生素在丙酮酸过量合成中的重要作用 及其相关关系。按照L16(45)正交试验因素水平表(表5-32)安排正交试验,其中各种维生素的 浓度范围是根据单因素试验结果(图5-3-3)确定的。具体试验设计及结果见表5-3-3 表5-3-3L16(45)正交试验设计及实验结果
17 图 5-3-2 T. glabrata WSH-IP303对氮源的同化能力 ● 蛋白胨; □ (NH4)2SO4; ■ (NH4)2HPO4; ○ Urea; △ NH4Cl 注∶含氮化合物以相同的含氮量加入培养基。蛋白胨中氮质量分数为0.1 g/g。发酵培养基中含有0.03 mg/L 硫胺素, 8 mg/L 烟酸, 0.03 mg/L 生物素, 0.3 mg/L 吡哆醇和0.15 mg/L 核黄素。 三、维生素对 WSH-IP303 过量合成丙酮酸的影响 T. glabrata WSH-IP303 能够以氯化铵为唯一氮源大量积累丙酮酸，这意味着可以在一 个全合成培养基中，对维生素的影响进行深入研究。首先利用单因素试验考察了烟酸、硫 胺素、吡哆醇、生物素和核黄素对丙酮酸发酵的影响。核黄素虽然不是 T. glabrata WSH-IP303 缺陷的维生素，但其作为 FAD 的前体，有可能影响电子传递链的活性，因此 一并进行了研究(图 5-3-3)。 0 10 20 30 40 0 0.5 2 6 10 15 0 0.01 0.03 0.08 0.2 0 0.1 0.2 0.5 1 1.5 0 0.01 0.03 0.08 0.2 0 0.1 0.2 0.4 烟酸 / mgL -1 丙酮酸 / gL-1 硫胺素 / mgL -1 吡哆醇 / mgL -1 生物素 / mgL -1 核黄素 / mgL -1 图 5-3-3 维生素浓度对T.glabrata WSH-IP303发酵生产丙酮酸的影响(单因素试验) 表 5-3-2 L16(45 )正交试验因素水平表 因素 ＼ 水平 1 2 3 4 A: 烟酸 / mgL -1 2 4 6 8 B: 硫胺素 / mgL -1 0.01 0.02 0.03 0.04 C: 吡哆醇 / mgL -1 0.1 0.2 0.3 0.4 D: 生物素 / mgL -1 0.01 0.02 0.03 0.04 E: 核黄素 / mgL -1 0 0.05 0.1 0.15 维生素单因素试验结果表明∶(1) 培养基中若缺乏烟酸、硫胺素、吡哆醇和生物素四 种维生素的任何一种，细胞生长均很弱(数据未显示)，丙酮酸产量也很低；(2) 细胞生长不 需要核黄素(数据未显示)，但添加适量核黄素对丙酮酸生产有一定的促进作用；(3) T. glabrata WSH-IP303积累丙酮酸时，对不同维生素浓度变化的敏感程度不同。据此，我们认 为，进一步考察烟酸、硫胺素、吡哆醇和生物素这四种维生素在T. glabrata WSH-IP303过 量合成丙酮酸中的作用，阐明它们对丙酮酸合成与分解途径的影响，并得到优化的浓度组 合，对实现高水平的丙酮酸发酵来说是非常必要的。 实际工作中，我们采用正交试验来考察这五种维生素在丙酮酸过量合成中的重要作用 及其相关关系。按照L16(45 )正交试验因素水平表(表5-3-2)安排正交试验，其中各种维生素的 浓度范围是根据单因素试验结果(图5-3-3)确定的。具体试验设计及结果见表5-3-3。 表 5-3-3 L16(45 )正交试验设计及实验结果1