第六章透明质酸发酵过程优化 第一节透明质酸发酵概述 、透明质酸的分布、结构、性质与应用 透明质酸( Hyaluronic acid,简称透明质酸),又名玻璃酸,是 Meyer和 Palmer于1934年 首先从牛眼玻璃体中分离出的一种高粘性物质。 balazs于1960年将透明质酸用于复杂的视网 膜脱离手术取得理想疗效后,透明质酸开始作为生化药物得到应用。透明质酸在日化工业(特 别是化妆品工业)中也有广阔的应用前景。据报道,透明质酸在国际市场上的价格为 2,000-100,000美元/kg。1985年透明质酸在国际市场上的总销售额为1亿美元,到1990年已 达2亿多美元。国外已有多家公司生产透明质酸药品,如美国的 Hyvisc,前苏联的 Luronitel, 澳大利亚的 Etamycin及瑞士的 Healon等。 (一)透明质酸的分布、结构和性质 透明质酸为白色、无定形固体,是由葡萄糖醛酸(GlcA)和N-乙酰氨基葡萄糖( GIcNAc)以 β-1,3和β-1,4糖苷键连接成的二糖单元重复构建而成的丝状高分子聚合物,其结构如图6-1-1 所示。透明质酸具有许多天然粘多糖共同的物理性质,无嗅无味,溶于水,不溶于有机溶剂, 水溶液的比旋光度为-70~-80°。 COoH CH2 OH 图6-1-1透明质酸结构示意图 自然界中,透明质酸广泛地存在于动物的各种组织内,如结缔组织、脐带、皮肤、人血 清、鸡冠、关节滑液、脑、软骨、眼玻璃体、人尿、鸡胚、兔卵细胞、动脉和静脉壁。其中 以哺乳动物的玻璃体、脐带和关节滑液中透明质酸产量最高。在这些组织中,透明质酸常与 蛋白质结合,并与其它粘多糖共存,以溶解的形式存在于玻璃体和滑液中,而以凝胶形式存 在于鸡冠和脐带中。 透明质酸的分子量在数十万到数百万之间。分子量为4×10Da的分子,链长约为10um 由于直链链轴上单糖之间氢键的作用,透明质酸分子在空间上呈刚性的螺旋柱型,半径为200 nm,柱内侧因有大量羟基而产生强亲水性:透明质酸在溶液中可亲和约为其自身重量1000倍 的水分。这些水在螺旋柱内固定不动,不易流失 透明质酸除具有强烈的亲水性外,其溶液还有着独特的流变学特性。透明质酸水溶液是 一种非牛顿流体,有着良好的粘弹性和应变性。这些性质主要取决于其分子量的大小和溶液 浓度与酸度的高低。一般来说,浓度高、分子量大,则溶液粘度也高。 Gibbs发现低浓度的透 明质酸溶液主要表现为粘性,而高浓度溶液则主要显示出弹性。在粘性与弹性之间有一个明 确的临界浓度转变点,这个点与溶液的pH值有着很大的关系 (二)透明质酸的主要用途 透明质酸在有机体内具有多种重要的生理功能,如润滑关节,调节蛋白质、水、电解质 的扩散和运转,促进创伤愈合等,因此其在临床医学上有着巨大用途,例如:透明质酸已成 为现代眼科“粘性手术”的必备药物:利用透明质酸独特的流体力学特性可治疗骨关节疾病
1 第六章 透明质酸发酵过程优化 第一节 透明质酸发酵概述 一、透明质酸的分布、结构、性质与应用 透明质酸(Hyaluronic acid，简称透明质酸)，又名玻璃酸，是 Meyer 和 Palmer 于 1934 年 首先从牛眼玻璃体中分离出的一种高粘性物质。Balazs 于 1960 年将透明质酸用于复杂的视网 膜脱离手术取得理想疗效后，透明质酸开始作为生化药物得到应用。透明质酸在日化工业(特 别是化妆品工业)中也有广阔的应用前景。据报道，透明质酸在国际市场上的价格为 2,000~100,000 美元/kg。1985 年透明质酸在国际市场上的总销售额为 1 亿美元，到 1990 年已 达 2 亿多美元。国外已有多家公司生产透明质酸药品，如美国的 Hyvisc，前苏联的 Luronitel， 澳大利亚的 Etamucin 及瑞士的 Healon 等。 (一)透明质酸的分布、结构和性质 透明质酸为白色、无定形固体，是由葡萄糖醛酸(GlcA)和 N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)以 -1,3 和-1,4 糖苷键连接成的二糖单元重复构建而成的丝状高分子聚合物，其结构如图 6-1-1 所示。透明质酸具有许多天然粘多糖共同的物理性质，无嗅无味，溶于水，不溶于有机溶剂， 水溶液的比旋光度为-70~ -80。 n n>1000 图 6-1-1 透明质酸结构示意图 自然界中，透明质酸广泛地存在于动物的各种组织内，如结缔组织、脐带、皮肤、人血 清、鸡冠、关节滑液、脑、软骨、眼玻璃体、人尿、鸡胚、兔卵细胞、动脉和静脉壁。其中 以哺乳动物的玻璃体、脐带和关节滑液中透明质酸产量最高。在这些组织中，透明质酸常与 蛋白质结合，并与其它粘多糖共存，以溶解的形式存在于玻璃体和滑液中，而以凝胶形式存 在于鸡冠和脐带中。 透明质酸的分子量在数十万到数百万之间。分子量为 4106 Da 的分子，链长约为 10 m。 由于直链链轴上单糖之间氢键的作用，透明质酸分子在空间上呈刚性的螺旋柱型，半径为 200 nm，柱内侧因有大量羟基而产生强亲水性∶透明质酸在溶液中可亲和约为其自身重量 1000 倍 的水分。这些水在螺旋柱内固定不动，不易流失。 透明质酸除具有强烈的亲水性外，其溶液还有着独特的流变学特性。透明质酸水溶液是 一种非牛顿流体，有着良好的粘弹性和应变性。这些性质主要取决于其分子量的大小和溶液 浓度与酸度的高低。一般来说，浓度高、分子量大，则溶液粘度也高。Gibbs 发现低浓度的透 明质酸溶液主要表现为粘性，而高浓度溶液则主要显示出弹性。在粘性与弹性之间有一个明 确的临界浓度转变点，这个点与溶液的 pH 值有着很大的关系。 (二)透明质酸的主要用途 透明质酸在有机体内具有多种重要的生理功能，如润滑关节，调节蛋白质、水、电解质 的扩散和运转，促进创伤愈合等，因此其在临床医学上有着巨大用途，例如∶透明质酸已成 为现代眼科“粘性手术”的必备药物；利用透明质酸独特的流体力学特性可治疗骨关节疾病；
促进伤口的愈合;作为易于检测的观察指标辅助诊断某些疾病等。透明质酸目前及潜在的医 学医药应用见表6-1-1。 表6-1-1透明质酸在医学医药上的应用 应用领域 主要功能和作用 眼科玻璃体的替代品,舒适的滴眼药,眼科手术中的优良粘合剂。 矫型外科增强骨骼关节间的滑动,用于矫型手术 外科手术用于耳鼻喉科手术,用作腹部、手部的抗粘连接剂。 骨关节术有希望将动物关节术中的成功经验用于人类。 伤口愈合促进组织再生、重塑和愈合,其银盐可缓慢向伤口释放银离子而促进伤 口愈 临床诊断用作肝、肿瘤的诊断指标 此外,透明质酸具有特殊的保水作用。高分子量的透明质酸最多可以持水6Lg,因而是 种理想的天然保湿因子( Natural moisturing Factor,简称NMF)。它可以改善皮肤的营养代谢 使皮肤柔嫩、光滑、去皱、增加弹性、防止衰老。含有透明质酸的化妆品目前被国际上公认 为“仿生化妆品”、“第四代化妆品”,许多国家在竞相研究开发。表6-1-2列出透明质酸结 构、性能对皮肤的影响 表6-1-2透明质酸结构、性能对皮肤的影响 结构中代表性基团相应表现的特征 羧酸基( COONa) 亲水性湿性 显性 湿润效果 羟基,氧基(-OHO) 配糖苷(1,3- Glycoside)紧密结构一弹性 能与皮肤相亲和 酰胺基NCO)与蛋白质亲和一一亲肤性保持皮肤光洁 生物相容大分子结构成膜性 较少皮肤渗透性,无刺激阻挡外来因素对皮肤毒害 、透明质酸的生物合成 (一)透明质酸的生物合成途径 1937年, Kendal等发现溶血性链球菌 Streptococcus haemolyticus可以合成透明质酸后 陆续报道了许多可产生透明质酸的微生物菌株。虽然到目前为止生物合成透明质酸的详细机 制还不是很清楚,但根据现有的工作以及关于透明质酸两种UDP前体的研究,可以确定透明 质酸的合成途径如图6-1-2所示。透明质酸是UDP葡萄糖醛酸(UDP-GlA)和UDPN-乙酰葡 萄糖胺( UDP-GICNAc)在透明质酸合成酶作用下合成的。UDP-GlA是糖醛酸途径的中间产物 与UDP- GIcNAc一样,它们的形成都不需破坏葡萄糖骨架。 Oregan通过同位素标记实验证实, 只有5~7%的葡萄糖能转化成透明质酸,其原因有可能是磷酸葡萄糖变位酶受 UDP-GICNAc反 馈抑制。因此,要增加透明质酸的合成,必须克服这种反馈调节机制
2 促进伤口的愈合；作为易于检测的观察指标辅助诊断某些疾病等。透明质酸目前及潜在的医 学医药应用见表 6-1-1。 表 6-1-1 透明质酸在医学医药上的应用 应用领域 主要功能和作用 眼科 玻璃体的替代品，舒适的滴眼药，眼科手术中的优良粘合剂。 矫型外科 增强骨骼关节间的滑动，用于矫型手术。 外科手术 用于耳鼻喉科手术，用作腹部、手部的抗粘连接剂。 骨关节术 有希望将动物关节术中的成功经验用于人类。 伤口愈合 促进组织再生、重塑和愈合，其银盐可缓慢向伤口释放银离子而促进伤 口愈合。 临床诊断 用作肝、肿瘤的诊断指标。 此外，透明质酸具有特殊的保水作用。高分子量的透明质酸最多可以持水 6 L/g，因而是 一种理想的天然保湿因子(Natural Moisturing Factor，简称 NMF)。它可以改善皮肤的营养代谢， 使皮肤柔嫩、光滑、去皱、增加弹性、防止衰老。含有透明质酸的化妆品目前被国际上公认 为“仿生化妆品”、“第四代化妆品”，许多国家在竞相研究开发。表 6-1-2 列出透明质酸结 构、性能对皮肤的影响。 表 6-1-2 透明质酸结构、性能对皮肤的影响 结构中代表性基团 相应表现的特征 显示作用 羧酸基(-COONa) 吸湿性 羟基，氧基(-OH, -O) 保湿性 配糖苷(1,3-Glycoside) 紧密结构—弹性 能与皮肤相亲和 酰胺基(-NHCO-) 与蛋白质亲和——亲肤性 成膜性 较少皮肤渗透性，无刺激 阻挡外来因素对皮肤毒害 亲水性 生物相容大分子结构 保持皮肤光洁 湿润效果 二、透明质酸的生物合成 (一)透明质酸的生物合成途径 1937 年，Kendall 等发现溶血性链球菌 Streptococcus haemolyticus 可以合成透明质酸后， 陆续报道了许多可产生透明质酸的微生物菌株。虽然到目前为止生物合成透明质酸的详细机 制还不是很清楚，但根据现有的工作以及关于透明质酸两种 UDP 前体的研究，可以确定透明 质酸的合成途径如图 6-1-2 所示。透明质酸是 UDP-葡萄糖醛酸(UDP-GlcA)和 UDP-N-乙酰葡 萄糖胺(UDP-GlcNAc)在透明质酸合成酶作用下合成的。UDP-GlcA 是糖醛酸途径的中间产物， 与 UDP-GlcNAc 一样，它们的形成都不需破坏葡萄糖骨架。O'regan 通过同位素标记实验证实， 只有 5~7%的葡萄糖能转化成透明质酸，其原因有可能是磷酸葡萄糖变位酶受 UDP-GlcNAc 反 馈抑制。因此，要增加透明质酸的合成，必须克服这种反馈调节机制
glucose-6-Phosphase glucose-6-P glucosaminine-6-P synthase UDP-glucos glucosaminine-1-P phorylase) UDP-glucose glucosaminine-1-P UDP-N-acty -(pyrophosphorylase hyaluronic acid 图6-1-2透明质酸代谢示意图 位于原生质体膜上的透明质酸合成酶 hyaluronan synthase)是透明质酸合成途径中的关键 酶,但并不是说在透明质酸合成酶的作用下 UDP-GIcA和 UDP-GICNAc就能够合成透明质酸。 在真核和原核微生物中都会形成一个与原生质膜相关的蛋白复合物来催化透明质酸的合成和 运输。转座子突变实验证实原核细胞的透明质酸合成酶为42kDa的膜蛋白。 Stoolmiller和 Dorfman等对A群链球菌的酶制备液进行研究,发现透明质酸分子链的延长是从内源透明质 酸的非还原端进行的,在Mg2+存在的条件下,仅以 UDP-GIcA和 UDP-GICNAc为底物即可合 成透明质酸。合成时将 UDP-GICA和 UDP-GICNAc交替连接在透明质酸链上,反应进行非常 快,每分钟约100个糖单位。 Van de rijn发现链球菌的透明质酸合成酶也与细胞膜有关,在 对数生长期可以很高的速率(大约为430~954mol(hg蛋白)合成透明质酸;但在静止期,其 膜上的酶会失去利用前体形成聚合物的能力。 Van de rijn推测这可能是由于膜形态的改变, 造成合成机制的改变,或是有关合成的酶被稀释和降解造成的。 Sugahara等用无细胞体系进行研究,发现合成的透明质酸可以分成两部分,即可溶于三氯 乙酸的部分和不溶于三氯乙酸的部分。脉冲追踪技术表明,不溶部分是可溶部分的前体,但 这两部分在分子大小上没有明显的区别。同时还发现透明质酸分子链的起始不需要酶系统参 加。虽然有学者对透明质酸链延长的步骤进行了推测,但详细机制还不很清楚。 细菌在合成透明质酸的同时也伴随着透明质酸的降解。链球菌在胞内合成透明质酸后, 在细胞膜上的透明质酸酶的作用下,将胞内透明质酸降解到一定程度后,分泌到胞外。产生 透明质酸酶的微生物有很多,不同菌种所产生酶的活力及产生时间是不一样的。 Van de rijn 发现C族链球菌D181的胞内透明质酸分子量为10×10°Da,而胞外的仅2×10°Da,约为胞 内的20%。细胞在静止期大量合成胞外降解酶,可以将透明质酸彻底降解, (二)透明质酸合成的分子生物学机制 Dougherty和 Van de rijn对A群链球菌研究发现,从透明质酸前体的合成到透明质酸的 合成所需的酶都与细胞膜有关。有关透明质酸合成的操纵子是包含一个称为hasA的基因,编 码着A群 Streptococci的透明质酸合成酶。所合成的蛋白显示出膜蛋白的特性,氨基酸序列同 系现象表明该蛋白与多糖产生和细胞分化有关。 Dougherty等同时确定了其DNA序列和hasA 转录起始点。用Tn916作为插入子插入hasA基因中,除透明质酸合成酶失去活性外,UDP 葡萄糖醛酸脱氢酶活力也丧失。这些结果表明,编码透明质酸合成酶基因和UDP·葡萄糖醛酸 脱氢酶基因存在于同一个操纵子上。 Crater和 Van de rijn对has操纵子进行了进一步的研究,发现has操纵子上有三个基因
3 glucose glucose-6-P glucose-1-P UDP-glucose UDP-glucuronic acid fructose-6-P glucosaminine-6-P glucosaminine-1-P N-actylglucosaminine-1-P UDP-N-actylglucosaminine hexokinase mutase glucosaminine-1-P actyl transferase N-actyl-glucosaminine 1-P-uridyl transferase (pyrophosphorylase) phospho glucomutase UDP-glucose 1-P-uridyl transferase (pyrophosphorylase) UDP-glucose dehydrogenase hyaluronic acid hyaluronan synthase glucose-6-Phosphase isomerase glucosaminine-6-P synthase 图 6-1-2 透明质酸代谢示意图 位于原生质体膜上的透明质酸合成酶(hyaluronan synthase)是透明质酸合成途径中的关键 酶，但并不是说在透明质酸合成酶的作用下 UDP-GlcA 和 UDP-GlcNAc 就能够合成透明质酸。 在真核和原核微生物中都会形成一个与原生质膜相关的蛋白复合物来催化透明质酸的合成和 运输。转座子突变实验证实原核细胞的透明质酸合成酶为 42 kDa 的膜蛋白。Stoolmiller 和 Dorfman 等对 A 群链球菌的酶制备液进行研究，发现透明质酸分子链的延长是从内源透明质 酸的非还原端进行的，在 Mg2+存在的条件下，仅以 UDP-GlcA 和 UDP-GlcNAc 为底物即可合 成透明质酸。合成时将 UDP-GlcA 和 UDP-GlcNAc 交替连接在透明质酸链上，反应进行非常 快，每分钟约 100 个糖单位。Van de Rijn 发现链球菌的透明质酸合成酶也与细胞膜有关，在 对数生长期可以很高的速率(大约为 430~954 nmol/(hg 蛋白))合成透明质酸；但在静止期，其 膜上的酶会失去利用前体形成聚合物的能力。Van de Rijn 推测这可能是由于膜形态的改变， 造成合成机制的改变，或是有关合成的酶被稀释和降解造成的。 Sugahara 等用无细胞体系进行研究，发现合成的透明质酸可以分成两部分，即可溶于三氯 乙酸的部分和不溶于三氯乙酸的部分。脉冲追踪技术表明，不溶部分是可溶部分的前体，但 这两部分在分子大小上没有明显的区别。同时还发现透明质酸分子链的起始不需要酶系统参 加。虽然有学者对透明质酸链延长的步骤进行了推测，但详细机制还不很清楚。 细菌在合成透明质酸的同时也伴随着透明质酸的降解。链球菌在胞内合成透明质酸后， 在细胞膜上的透明质酸酶的作用下，将胞内透明质酸降解到一定程度后，分泌到胞外。产生 透明质酸酶的微生物有很多，不同菌种所产生酶的活力及产生时间是不一样的。Van de Rijn 发现 C 族链球菌 D181 的胞内透明质酸分子量为 10×106 Da，而胞外的仅 2×106 Da，约为胞 内的 20%。细胞在静止期大量合成胞外降解酶，可以将透明质酸彻底降解。 (二)透明质酸合成的分子生物学机制 Dougherty 和 Van de Rijn 对 A 群链球菌研究发现，从透明质酸前体的合成到透明质酸的 合成所需的酶都与细胞膜有关。有关透明质酸合成的操纵子是包含一个称为 hasA 的基因，编 码着 A 群 Streptococci 的透明质酸合成酶。所合成的蛋白显示出膜蛋白的特性，氨基酸序列同 系现象表明该蛋白与多糖产生和细胞分化有关。Dougherty 等同时确定了其 DNA 序列和 hasA 转录起始点。用 Tn916 作为插入子插入 hasA 基因中，除透明质酸合成酶失去活性外，UDP- 葡萄糖醛酸脱氢酶活力也丧失。这些结果表明，编码透明质酸合成酶基因和 UDP-葡萄糖醛酸 脱氢酶基因存在于同一个操纵子上。 Crater 和 Van de Rijn 对 has 操纵子进行了进一步的研究，发现 has 操纵子上有三个基因
hasA、hasB、hasC,分别编码着透明质酸合成酶、UDP葡萄糖脱氢酶和UDP-葡萄糖焦磷酸化 酶。has操纵子的表达是 Streptococci(A群)合成透明质酸荚膜所必须的。 Streptococci(A群)荚 膜细菌和非荚膜细菌,以及 Streptococci(C型)荚膜菌都具有has操纵子。荚膜表型可以说明膜 上是否缺少透明质酸合成酶活性或胞外透明质酸酶。RNA分析也表明失去荚膜的 Streptococci (A群)菌会失去has操纵子所转录的mRNA,微生物生理状态的变化规律与所获得的has操纵 子的启动子所表现的一致,这些都说明A群链球菌透明质酸荚膜的合成是受转录机制所控制 、透明质酸的生产 (一)动物组织提取法生产透明质酸 最初生产透明质酸的途径主要是从动物组织中提取,原料涉及前述的大部分含透明质酸 的动物组织,表6-1-3为各种组织中透明质酸的含量。由于来源和成本的原因,鸡冠、牛眼是 最常用的提取原料 表6-1-3各种组织(液)中透明质酸的含量 原料浓度/ mgL-(mg.kg)原料浓度/mgL(/mgkg) 公鸡冠 人玻璃体 40~380 牛鼻软骨 人表皮 兔脑 65 人淋巴液 5~18 兔肌肉 人尿 0.1~0.5 人脐带 4100 人血清 0.01~0.1 人关节滑液 1240~3600 从人和动物体内所得到的透明质酸的分子量一般都大于60万,粘度较高,保湿性能也较 好,占据世界眼科主要市场的透明质酸制剂 Healon,目前仍然采用这种方法所制得。从动物 组织中提取的一般方法如下:先将组织打成匀浆,再用水和稀的盐溶液提取。提取液用季铵 盐(如氯化十六烷基吡啶)沉淀。将所得沉淀溶于氯化钠溶液,用三倍乙醇沉淀即得粗品。纯化 时,可用乙醇和季铵盐反复沉淀进行处理,也可通过凝胶和或离子交换色谱的方法精制。1kg 新鲜公鸡冠一般可制得4g纯透明质酸。 (二)发酵法生产透明质酸 动物组织提取法有着许多不可克服的缺点。首先是原料来源缺乏,无论是鸡冠、还是牛 眼都非常稀少,并且各种原料中的透明质酸产量相对比较低(表6-1-3):其次由于动物组织中 透明质酸通常与其它蛋白多糖相结合,使得透明质酸提取和精制的成本很高:再者动物来源 的透明质酸可能受到不同程度的污染,因此其使用受到许多严格规定的限制:更为重要的原 因是提取法生产的产品难以满足透明质酸市场需求量不断增加的需要。在这种情况下,研究 人员积极探索透明质酸生产新途径。 1983年日本资生堂首次报道用链球菌生产透明质酸,随后英美等国相继报道采用微生物 发酵生产透明质酸的方法,大大拓宽了透明质酸来源,推动了透明质酸的研究和应用。微生 物发酵方法生产透明质酸的实现是透明质酸生产领域在近年来取得的最重大的进展,不仅可 以降低透明质酸生产成本,而且透明质酸的质量提高,品质稳定。发酵法生产透明质酸和提 取法生产透明质酸的比较如表6-1-4。同其它产物的发酵一样,透明质酸的发酵生产同样也追 求高产率和高转化率,同时还要保证透明质酸产品的高分子量,因为其分子量的高低直接影 响其质量的高低。此外,透明质酸作为一种医药产品,其安全性也是需要考虑的一个重要问
4 hasA、hasB、hasC，分别编码着透明质酸合成酶、UDP-葡萄糖脱氢酶和 UDP-葡萄糖焦磷酸化 酶。has 操纵子的表达是 Streptococci (A 群)合成透明质酸荚膜所必须的。Streptococci (A 群)荚 膜细菌和非荚膜细菌，以及 Streptococci (C 型)荚膜菌都具有 has 操纵子。荚膜表型可以说明膜 上是否缺少透明质酸合成酶活性或胞外透明质酸酶。RNA 分析也表明失去荚膜的 Streptococci (A 群)菌会失去 has 操纵子所转录的 mRNA，微生物生理状态的变化规律与所获得的 has 操纵 子的启动子所表现的一致，这些都说明 A 群链球菌透明质酸荚膜的合成是受转录机制所控制 的。 三、透明质酸的生产 (一)动物组织提取法生产透明质酸 最初生产透明质酸的途径主要是从动物组织中提取，原料涉及前述的大部分含透明质酸 的动物组织，表 6-1-3 为各种组织中透明质酸的含量。由于来源和成本的原因，鸡冠、牛眼是 最常用的提取原料。 表 6-1-3 各种组织(液)中透明质酸的含量 原料 浓度 /mgL -1 (mgkg-1 ) 原料 浓度 /mgL -1 (/mgkg-1 ) 公鸡冠 7500 人玻璃体 140~380 牛鼻软骨 1200 人表皮 200 兔脑 65 人淋巴液 8.5~18 兔肌肉 27 人尿 0.1~0.5 人脐带 4100 人血清 0.01~0.1 人关节滑液 1240~3600 从人和动物体内所得到的透明质酸的分子量一般都大于 60 万，粘度较高，保湿性能也较 好，占据世界眼科主要市场的透明质酸制剂 Healon，目前仍然采用这种方法所制得。从动物 组织中提取的一般方法如下：先将组织打成匀浆，再用水和稀的盐溶液提取。提取液用季铵 盐(如氯化十六烷基吡啶)沉淀。将所得沉淀溶于氯化钠溶液，用三倍乙醇沉淀即得粗品。纯化 时，可用乙醇和季铵盐反复沉淀进行处理，也可通过凝胶和/或离子交换色谱的方法精制。1 kg 新鲜公鸡冠一般可制得 4 g 纯透明质酸。 (二)发酵法生产透明质酸 动物组织提取法有着许多不可克服的缺点。首先是原料来源缺乏，无论是鸡冠、还是牛 眼都非常稀少，并且各种原料中的透明质酸产量相对比较低(表 6-1-3)；其次由于动物组织中 透明质酸通常与其它蛋白多糖相结合，使得透明质酸提取和精制的成本很高；再者动物来源 的透明质酸可能受到不同程度的污染，因此其使用受到许多严格规定的限制；更为重要的原 因是提取法生产的产品难以满足透明质酸市场需求量不断增加的需要。在这种情况下，研究 人员积极探索透明质酸生产新途径。 1983 年日本资生堂首次报道用链球菌生产透明质酸，随后英美等国相继报道采用微生物 发酵生产透明质酸的方法，大大拓宽了透明质酸来源，推动了透明质酸的研究和应用。微生 物发酵方法生产透明质酸的实现是透明质酸生产领域在近年来取得的最重大的进展，不仅可 以降低透明质酸生产成本，而且透明质酸的质量提高，品质稳定。发酵法生产透明质酸和提 取法生产透明质酸的比较如表 6-1-4。同其它产物的发酵一样，透明质酸的发酵生产同样也追 求高产率和高转化率，同时还要保证透明质酸产品的高分子量，因为其分子量的高低直接影 响其质量的高低。此外，透明质酸作为一种医药产品，其安全性也是需要考虑的一个重要问
表6-1-4发酵法生产透明质酸与动物组织提取法生产透明质酸的比较 提取法 发酵法 原料 来源有限 原料很广 提取工艺透明质酸在原料中与蛋白质和其它多透明质酸在发酵液中游离存在,分离 糖形成复合体,分离纯化工艺复杂纯化容易 分子量 <100万 >180万 性质 不同来源差异较大 分子量高、粘度大、保湿力强 质量与产量质量不稳定,取决于动物组织来源,产品质量稳定,产量大,产品成本明 产量较小,产品成本高 显低于提取法 1.环境条件对透明质酸产量的影响 迄今为止,实验室研究和工业化生产都发现最适合发酵生产透明质酸的微生物是链球菌。 影响链球菌合成透明质酸的最主要环境因素是氧。厌氧条件下发酵法生产透明质酸的产量为 0.3~1.0g几,而在通风搅拌的情况下,可以达到4-6g。 Johns等研究了搅拌转速对透明质酸 生产的影响,发现在厌氧培养时,较高的搅拌转速下透明质酸产量更高,而菌体的生长速率 和转化率不受影响:降低转速会使透明质酸产量降低,同时副产物增加。这是因为透明质酸 溶液是一种假塑性流体,髙的搅拌(剪切)速率可以降低溶液粘度,増加营养的供给,消除细胞 周围富集的副产物对细胞的毒害,同时高的搅拌速率可以将细菌的透明质酸荚膜释放到培养 基中。 不同研究关于氧对链球菌生产透明质酸的影响并不一致。 Clery和 larkin认为透明质酸可 作为一种抵抗O渗透的屏障,防止分子氧对细胞的毒害,因此通风可以促进透明质酸的产生: Swan等也发现在对数生长期控制相对较高的溶氧浓度,可以获得更高的透明质酸转化率。然 而 Bracke等发现培养基中丰富的CO2可以促进透明质酸的合成。 Johns等发现,与厌氧培养 相比,通风培养可以获得更高的透明质酸浓度和转化率。另外,厌氧培养的产物单一,而通 风培养时大大增加了其它副产物及CO2的产生 营养源的浓度对透明质酸产量的影响也很大。宫田俊范发现培养基中葡萄糖浓度过高或 过低时都不能得到好的发酵结果,当初始葡萄糖浓度为15g,发酵过程中控制培养液中葡萄 糖含量低于15gL可获得最高的透明质酸产量。此外,发酵方式也影响透明质酸的生产。高 山健一郎采用半连续和连续培养的方法控制粘度在200cps以下可使得透明质酸产率、转化率 大大提高。也有将培养基中氧化还原电位控制在-100~-400mⅤ使透明质酸产量提高的报道 2.环境条件对透明质酸分子量的影响 氧不仅对透明质酸发酵生产的产量有很大影响,而且还影响透明质酸的分子量。厌氧条 件下透明质酸的重均分子量为07×10Da或更低,有氧条件下分子量则高于2×10°Da。在一 定的条件下,胞外透明质酸酶缺失的链球菌可产生高分子量的透明质酸。控制pH对透明质酸 的分子量影响很大。日本资生堂首次报道的用链球菌发酵得到40gL透明质酸的实验是在通 气搅拌、pH7的情况下进行的。当pH在80-89的范围内,透明质酸分子量可以达到25×10 Da。特殊的添加剂也能提高产物的分子量。如在培养基中添加苯酚等化合物,透明质酸的分 子量可以达2.5×10Da左右;森田裕等通过添加表面活性剂,获得了高纯度高分子量的透明 质酸。 产品分子量不仅受发酵条件的影响,也受提取工艺的影响。不恰当的提取方法不仅会使
5 题。 表 6-1-4 发酵法生产透明质酸与动物组织提取法生产透明质酸的比较 提取法 发酵法 原料 来源有限 原料很广 提取工艺 透明质酸在原料中与蛋白质和其它多 糖形成复合体，分离纯化工艺复杂 透明质酸在发酵液中游离存在，分离 纯化容易 分子量 <100 万 >180 万 性质 不同来源差异较大 分子量高、粘度大、保湿力强 质量与产量 质量不稳定，取决于动物组织来源， 产量较小，产品成本高 产品质量稳定，产量大，产品成本明 显低于提取法 1．环境条件对透明质酸产量的影响 迄今为止，实验室研究和工业化生产都发现最适合发酵生产透明质酸的微生物是链球菌。 影响链球菌合成透明质酸的最主要环境因素是氧。厌氧条件下发酵法生产透明质酸的产量为 0.3~1.0 g/L，而在通风搅拌的情况下，可以达到 4~6 g/L。Johns 等研究了搅拌转速对透明质酸 生产的影响，发现在厌氧培养时，较高的搅拌转速下透明质酸产量更高，而菌体的生长速率 和转化率不受影响；降低转速会使透明质酸产量降低，同时副产物增加。这是因为透明质酸 溶液是一种假塑性流体，高的搅拌(剪切)速率可以降低溶液粘度，增加营养的供给，消除细胞 周围富集的副产物对细胞的毒害，同时高的搅拌速率可以将细菌的透明质酸荚膜释放到培养 基中。 不同研究关于氧对链球菌生产透明质酸的影响并不一致。Clery 和 larkin 认为透明质酸可 作为一种抵抗 O2 渗透的屏障，防止分子氧对细胞的毒害，因此通风可以促进透明质酸的产生； Swann 等也发现在对数生长期控制相对较高的溶氧浓度，可以获得更高的透明质酸转化率。然 而 Bracke 等发现培养基中丰富的 CO2 可以促进透明质酸的合成。Johns 等发现，与厌氧培养 相比，通风培养可以获得更高的透明质酸浓度和转化率。另外，厌氧培养的产物单一，而通 风培养时大大增加了其它副产物及 CO2 的产生。 营养源的浓度对透明质酸产量的影响也很大。宫田俊范发现培养基中葡萄糖浓度过高或 过低时都不能得到好的发酵结果，当初始葡萄糖浓度为 15 g/L，发酵过程中控制培养液中葡萄 糖含量低于 15 g/L 可获得最高的透明质酸产量。此外，发酵方式也影响透明质酸的生产。高 山健一郎采用半连续和连续培养的方法控制粘度在 200 cps 以下可使得透明质酸产率、转化率 大大提高。也有将培养基中氧化还原电位控制在-100~-400 mV 使透明质酸产量提高的报道。 2．环境条件对透明质酸分子量的影响 氧不仅对透明质酸发酵生产的产量有很大影响，而且还影响透明质酸的分子量。厌氧条 件下透明质酸的重均分子量为 0.7×106 Da 或更低，有氧条件下分子量则高于 2×106 Da。在一 定的条件下，胞外透明质酸酶缺失的链球菌可产生高分子量的透明质酸。控制 pH 对透明质酸 的分子量影响很大。日本资生堂首次报道的用链球菌发酵得到 4.0 g/L 透明质酸的实验是在通 气搅拌、pH 7 的情况下进行的。当 pH 在 8.0~8.9 的范围内，透明质酸分子量可以达到 2.5×106 Da。特殊的添加剂也能提高产物的分子量。如在培养基中添加苯酚等化合物，透明质酸的分 子量可以达 2.5×106 Da 左右；森田裕等通过添加表面活性剂，获得了高纯度高分子量的透明 质酸。 产品分子量不仅受发酵条件的影响，也受提取工艺的影响。不恰当的提取方法不仅会使