第八章聚羟基烷酸酯发酵过程优化 第一节聚羟基烷酸酯发酵概述 、PHAs的结构、物理化学性质和应用 PHAs的生物合成 三、本章主要内容 第二节真养产碱杆菌生产PHB摇瓶发酵条件的研究 引言 二、PHB摇瓶发酵条件研究与补料优化….….… 1112899947 、PHB发酵过程中理论产率的计算 第三节真氧产碱杆菌连续培养动力学及二级连续培养系统生产聚羟基丁酸. 、引言 二、真养产碱杆菌一级连续培养动力学 三、二级连续培养生产PHB的动力学研究 21 四、二级连续培养系统中PHB的生产强度和PHB对葡萄糖的产率系数…… 第四节聚羟基丁酸分批发酵过程动力学模型及优化. 、前言 二、不同供氧水平对PHB发酵过程的影响 2222 三、不同初糖浓度对PHB发酵过程的影响 四、PHB分批发酵过程分析和控制 五、PHB分批发酵动力学 六、PHB分批发酵过程动力学的分析 第五节聚羟基丁酸流加发酵条件研究 、前言 氮源的限制、缺乏和恢复氮源供应对R. eutrophus菌体生长和PHB合成的影响.40 三、葡萄糖的限制、缺乏和恢复供应对R. eutrophus菌体生长和PHB合成的影响….43 四、限氧和恢复氧供应对生长和PHB合成的影响 五、培养过程中的不同停氮时间对PHB形成的影响 六、PHB合成期不同的氮源流加速率对PHB合成的影响 第六节聚羟基丁酸双底物流加发酵准优化控制策略 、引言 455 二、PHB流加发酵过程的准优化控制研究 第七节羟基丁酸与羟基戊酸共聚物发酵条件的优化 、引言 666 二、PHBⅤ摇瓶发酵条件研究 三、2L罐中PHBⅤ流加发酵过程的准优化控制
第八章 聚羟基烷酸酯发酵过程优化...................................................................................1 第一节 聚羟基烷酸酯发酵概述...................................................................................1 一、PHAs的结构、物理化学性质和应用 ................................................................1 二、PHAs的生物合成 ............................................................................................2 三、本章主要内容 .................................................................................................8 第二节 真养产碱杆菌生产PHB摇瓶发酵条件的研究....................................................9 一、引言 ...............................................................................................................9 二、PHB摇瓶发酵条件研究与补料优化..................................................................9 三、PHB发酵过程中理论产率的计算....................................................................14 第三节 真氧产碱杆菌连续培养动力学及二级连续培养系统生产聚羟基丁酸...............17 一、引言 .............................................................................................................17 二、真养产碱杆菌一级连续培养动力学................................................................17 三、二级连续培养生产PHB的动力学研究.............................................................21 四、二级连续培养系统中PHB的生产强度和PHB对葡萄糖的产率系数...................25 第四节 聚羟基丁酸分批发酵过程动力学模型及优化..................................................26 一、前言 .............................................................................................................26 二、不同供氧水平对PHB发酵过程的影响.............................................................27 三、不同初糖浓度对PHB发酵过程的影响.............................................................29 四、PHB分批发酵过程分析和控制.......................................................................33 五、PHB分批发酵动力学.....................................................................................34 六、PHB分批发酵过程动力学的分析....................................................................38 第五节 聚羟基丁酸流加发酵条件研究.......................................................................40 一、前言 .............................................................................................................40 二、氮源的限制、缺乏和恢复氮源供应对R. eutrophus菌体生长和PHB合成的影响.40 三、葡萄糖的限制、缺乏和恢复供应对R. eutrophus菌体生长和PHB合成的影响 ....43 四、限氧和恢复氧供应对生长和PHB合成的影响..................................................45 五、培养过程中的不同停氮时间对PHB形成的影响...............................................46 六、PHB合成期不同的氮源流加速率对PHB合成的影响........................................48 第六节 聚羟基丁酸双底物流加发酵准优化控制策略..................................................54 一、引言 .............................................................................................................54 二、PHB流加发酵过程的准优化控制研究.............................................................54 第七节 羟基丁酸与羟基戊酸共聚物发酵条件的优化..................................................67 一、引言 .............................................................................................................67 二、PHBV摇瓶发酵条件研究...............................................................................67 三、2 L罐中PHBV流加发酵过程的准优化控制 .....................................................73
第八章聚羟基烷酸酯发酵过程优化 第一节聚羟基烷酸酯发酵概述 、PHAs的结构、物理化学性质和应用 聚羟基烷酸酯( Polyhydroxyalkoates,简称PHAs)是生物可降解材料的一个研究热点。其中 聚β羟基丁酸(简称PHB)及3羟基丁酸与3羟基戊酸的共聚物(简称P3HB-co-3HV)或PHBV)是 PHAs族中研究和应用最广泛的两种多聚体。PHAs作为一种有光学活性的聚酯,除具有高分子 化合物的基本特性,如质轻、弹性、可塑性、耐磨性、抗射线等外,更重要的是其还具有生 物可降解性和生物可相容性。已有研究表明,采用PHAs制作的香波瓶,在自然环境中9个月后 可基本上被完全降解,而用合成塑料制作的同样物品,完全降解的时间约需100年。因此研究 和开发PHAs作为各种容器、瓶、袋和薄膜等包装材料,使之成为同类用途的石化合成塑料最 有潜力的替代品,对避免或减少塑料废物对环境的污染,具有深远的环境意义 多种微生物在一定条件下能在胞内积累PHAs作为碳源和能源的贮存物。由于PHAs具有低 溶解性和高分子量,它在胞内的积累不会引起滲透压的增加,因而,它们是一类理想的胞内 贮藏物,比糖原、多聚磷酸或脂肪更加普遍地存在于微生物中。PHAs的通式可写成: R O O-CH-CH=C 式中R多为不同链长的正烷基,也可以是支链的、不饱和的或带取代基的烷基。R为甲基 时,其聚合物为聚B羟基丁酸(PHB,R为乙基时,其聚合物为聚B-羟基戊酸(PHV),其它依 此类推。此外,在一定条件下两种或两种以上的单体还能形成共聚物,其典型代表是3HB和3HV 组成的共聚物P(3HB-co3HV 至今为止发现的PHAs几乎都是线状的β-羟基烷酸的聚酯。β-碳原子的手性决定了这些多 聚物具有光学活性,所有的组成单位仅以R型存在。采用溶剂法从不同细菌中提取的多聚物 有些多聚物的分子量可高达2×10,对应聚合度约为2000,其理化性质和机械性能(如韧度 脆性、熔点、玻璃态温度和抗溶剂性等)与单体的组成有密切的关系。例如,在PHBV共聚物 中增加β-羟基戊酸的组分可使熔点从180℃(PHB均聚物)降至75℃(PHBⅤ共聚物中HV组分为 30-40mol%)。再如,从食油假单孢菌( P oleovorans)中提取的中长链PHAs可溶于丙酮或乙醚 而PHB不能溶解。 目前大多数关于PHAs理化性质的研究是针对PHB和PHBV两种聚合物进行的。PHB是 100%立体专一性的,所有的不对称碳原子都是D(-)构型,因而PHB是高度结晶的晶体,结晶 度的范围在55~80%,其在物理性质甚至分子结构上与聚丙烯(PP)很相似,例如熔点、玻璃态 温度、结晶度、抗张强度等,而比重大、透氧率低和抗紫外线照射以及具有光学活性、阻湿 性和压电性等则是PHB的优点(表8-1-1)
1 第八章 聚羟基烷酸酯发酵过程优化 第一节 聚羟基烷酸酯发酵概述 一、PHAs 的结构、物理化学性质和应用 聚羟基烷酸酯(Polyhydroxyalkoates，简称PHAs)是生物可降解材料的一个研究热点。其中 聚--羟基丁酸(简称PHB)及3-羟基丁酸与3-羟基戊酸的共聚物(简称P(3HB-co-3HV)或PHBV)是 PHAs族中研究和应用最广泛的两种多聚体。PHAs作为一种有光学活性的聚酯，除具有高分子 化合物的基本特性，如质轻、弹性、可塑性、耐磨性、抗射线等外，更重要的是其还具有生 物可降解性和生物可相容性。已有研究表明，采用PHAs制作的香波瓶，在自然环境中9个月后， 可基本上被完全降解，而用合成塑料制作的同样物品，完全降解的时间约需100年。因此研究 和开发PHAs作为各种容器、瓶、袋和薄膜等包装材料，使之成为同类用途的石化合成塑料最 有潜力的替代品，对避免或减少塑料废物对环境的污染，具有深远的环境意义。 多种微生物在一定条件下能在胞内积累PHAs作为碳源和能源的贮存物。由于PHAs具有低 溶解性和高分子量，它在胞内的积累不会引起渗透压的增加，因而，它们是一类理想的胞内 贮藏物，比糖原、多聚磷酸或脂肪更加普遍地存在于微生物中。PHAs的通式可写成： 2 _ _ _ R C __ O n ___ O CH CH 式中R多为不同链长的正烷基，也可以是支链的、不饱和的或带取代基的烷基。R为甲基 时，其聚合物为聚--羟基丁酸(PHB)，R为乙基时，其聚合物为聚--羟基戊酸(PHV)，其它依 此类推。此外，在一定条件下两种或两种以上的单体还能形成共聚物，其典型代表是3HB和3HV 组成的共聚物P(3HB-co-3HV)。 至今为止发现的PHAs几乎都是线状的-羟基烷酸的聚酯。-碳原子的手性决定了这些多 聚物具有光学活性，所有的组成单位仅以R型存在。采用溶剂法从不同细菌中提取的多聚物， 有些多聚物的分子量可高达2×106，对应聚合度约为20,000，其理化性质和机械性能(如韧度、 脆性、熔点、玻璃态温度和抗溶剂性等)与单体的组成有密切的关系。例如，在PHBV共聚物 中增加-羟基戊酸的组分可使熔点从180 ℃(PHB均聚物)降至75 ℃(PHBV共聚物中HV组分为 30-40 mol %)。再如，从食油假单孢菌(P. oleovorans)中提取的中长链PHAs可溶于丙酮或乙醚， 而PHB不能溶解。 目前大多数关于PHAs理化性质的研究是针对PHB和PHBV两种聚合物进行的。PHB是 100 %立体专一性的，所有的不对称碳原子都是D-(-)构型，因而PHB是高度结晶的晶体，结晶 度的范围在55～80 %，其在物理性质甚至分子结构上与聚丙烯(PP)很相似，例如熔点、玻璃态 温度、结晶度、抗张强度等，而比重大、透氧率低和抗紫外线照射以及具有光学活性、阻湿 性和压电性等则是PHB的优点(表8-1-1)
表8-1-1PHAs和聚丙烯(PP)的性质比较 性 PHB P(3HB-Co-3HV) P(3HB-CO-4HB) P(4HB) mol%HV 25mol%HV 10mol%HB 64mol%HB 点Tm/℃ 171~186171~182162 玻璃态温度Ts/℃ 155~10 结晶度/% 65~7065~80 比重/gcm 0.905 1.24 分子量Mw/105 1-8 分子量分布 5~12 弯曲模量/GPa 3.5~4 149 抗张强度/MPa 37 断裂伸长/% 抗紫外线照射 90差好 46好差 抗溶剂 透氧率cmm2 atm"d-I17 生物降解性 不可降解可降解可降解可降解可降解可降解可降解 从表8-1-1中可见,PHB的机械性能包括弯曲模量(3.5~4GPa)和抗张强度(40MPa)与聚丙 烯相仿,但其断裂伸长仅为5%,比聚丙烯的值(400%)要低得多,因而PHB较脆和发硬,但这 可通过与适量HⅣⅤ共聚而补偿。随着PHBⅴ中HV组分的增加,聚合物的脆度降低而韧性增加 且共聚物的熔点随着HV组分的增加而降低,热加工性能提高。此外,单体4HIB的聚合物或3HB 与4HB的共聚物P(3HB-co-4HB)则是高弹体,且其生物降解的速度比均聚PHB或PHBV更快 PHB的工业化应用主要存在两个缺点:一是PHB的熔化稳定性较差。其分解温度约为 200℃,与其熔点相近(约175℃):二是在环境条件下贮存数日后,PHB易发脆。对第一个缺 点,可通过在发酵过程中加入3HV的前体合成PHBV共聚体或将PHB与其它多聚物相混合使用 来解决;而对于第二个缺点,最近的研究发现,可通过简单的退火处理来改善PHB的脆性问题 PHAs的生物降解性和生物相容性是许多化学合成塑料所不具备的。PHAs这类热塑性聚酯 能纺丝、压膜或注塑,在工业上可用作各类包装材料等。在医药方面,由于其生物相容性, PHAs可作外科缝线、伤口敷料、血管替代品、长效药物的生物降解载体,骨骼代用品或骨板 等。农药工业上,PHAs可用于合成长效除莠剂、抗真菌剂或杀虫剂。PHAs还可作为合成手性 化合物的前体原料,用于合成药物和昆虫信息素等物质。 、PHAs的生物合成 (一)合成PHAs的主要微生物和基质 PHB最初是由 Lemoine于192年首先发现的,随后他从巨大芽孢杆菌( Bacillus megaterium) 中分离并鉴定了该物质,并阐明了该菌形成孢子时形成PHB。20世纪50年代末研究了生长条件 对PHB代谢的影响,发现PHB生成的量随着生长培养基中糖铵比的增加而增加,即PHB的积累 是在某种营养物受限制的不平衡生长条件下发生的,这是一个重要的发现。1974年,Wale 和 Rohwedder报道了从活性污泥的氯仿萃取液中测定到含3HB和其他3-羟酰基单体的杂聚物的 存在,使研究领域由PHB扩展到PHAs1983年有专利报道了微生物合成PHBV共聚物,而且 它较PHB均聚物有某些更好的特性。此后,有关PHAs的研究报道越来越多。 能产生PHAs的微生物分布极广,包括光能和化能自养及异养菌计65个属中的近300种微生 物。积累有PHAs的微生物能很容易通过用苏丹黑或尼罗蓝染色来鉴别。目前研究较多的有:
2 表8-1-1 PHAs和聚丙烯(PP)的性质比较 性 质 PP PHB P(3HB-co-3HV) P(3HB-co-4HB) P(4HB) 9mol%HV 25mol%HV 10mol%HB 64mol%HB 熔 点 Tm / ℃ 171～186 171～182 162 137 159 50 53 玻璃态温度Tg / ℃ -15 5～10 / / / / / 结晶度 / % 65～70 65～80 / / / / / 比重/ gcm-3 0.905 1.24 / / / / / 分子量Mw / 105 2.2～7 1-8 / / / / / 分子量分布 5～12 2.2～3 / / / / / 弯曲模量/ GPa 1.7 3.5～4 1.9 0.7 / 30 149 抗张强度/ MPa 39 40 37 30 24 17 104 断裂伸长/ % 400 6-8 / / 242 591 1000 抗紫外线照射 差 好 / / / / / 抗溶剂 好 差 / / / / / 透氧率/cm3m -2 atm-1 d -1 1700 45 / / / / / 生物降解性 不可降解 可降解 可降解 可降解 可降解 可降解 可降解 从表8-1-1中可见，PHB的机械性能包括弯曲模量(3.5～4 GPa)和抗张强度(40 MPa)与聚丙 烯相仿，但其断裂伸长仅为5 %，比聚丙烯的值(400 %)要低得多，因而PHB较脆和发硬，但这 可通过与适量HV共聚而补偿。随着PHBV中HV组分的增加，聚合物的脆度降低而韧性增加， 且共聚物的熔点随着HV组分的增加而降低，热加工性能提高。此外，单体4HB的聚合物或3HB 与4HB的共聚物P(3HB-co-4HB)则是高弹体，且其生物降解的速度比均聚PHB或PHBV更快。 PHB的工业化应用主要存在两个缺点：一是PHB的熔化稳定性较差。其分解温度约为 200 ℃，与其熔点相近(约175 ℃)；二是在环境条件下贮存数日后，PHB易发脆。对第一个缺 点，可通过在发酵过程中加入3HV的前体合成PHBV共聚体或将PHB与其它多聚物相混合使用 来解决；而对于第二个缺点，最近的研究发现，可通过简单的退火处理来改善PHB的脆性问题。 PHAs的生物降解性和生物相容性是许多化学合成塑料所不具备的。PHAs这类热塑性聚酯 能纺丝、压膜或注塑，在工业上可用作各类包装材料等。在医药方面，由于其生物相容性， PHAs可作外科缝线、伤口敷料、血管替代品、长效药物的生物降解载体，骨骼代用品或骨板 等。农药工业上，PHAs可用于合成长效除莠剂、抗真菌剂或杀虫剂。PHAs还可作为合成手性 化合物的前体原料，用于合成药物和昆虫信息素等物质。 二、PHAs 的生物合成 (一)合成 PHAs 的主要微生物和基质 PHB最初是由Lemoigne于1925年首先发现的，随后他从巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium) 中分离并鉴定了该物质，并阐明了该菌形成孢子时形成PHB。20世纪50年代末研究了生长条件 对PHB代谢的影响，发现PHB生成的量随着生长培养基中糖铵比的增加而增加，即PHB的积累 是在某种营养物受限制的不平衡生长条件下发生的，这是一个重要的发现。1974年，Wallen 和Rohwedder报道了从活性污泥的氯仿萃取液中测定到含3HB和其他3-羟酰基单体的杂聚物的 存在，使研究领域由PHB扩展到PHAs。1983年有专利报道了微生物合成PHBV共聚物，而且 它较PHB均聚物有某些更好的特性。此后，有关PHAs的研究报道越来越多。 能产生PHAs的微生物分布极广，包括光能和化能自养及异养菌计65个属中的近300种微生 物。积累有PHAs的微生物能很容易通过用苏丹黑或尼罗蓝染色来鉴别。目前研究较多的有：
产碱杆菌属( Ralstonia),假单胞菌属( Pseudonomas),甲基营养菌( Methylotrophs),固氮菌属 ( Azotobacter)和红螺菌属( Rhodospirillum)等,它们能分别利用不同的碳源产生不同的PHAs 早期研究真养产碱杆菌(R. eutrophus)中PHB代谢的主要目的在于将PHB消除以便利用该 菌生产单细胞蛋白,后来才转向PHAs的生物合成和积累的研究。兼性化能自养型细菌在一定 的条件下积累PHB可达细胞干重的90%以上,也能利用糖加丙酸或戊酸产生P(3HBco-3HV) 近来的研究发现改变基质该菌还能将4HB和5HV结合到3HB的结构中去,形成4HB或5HV单体 与3HB的共聚物。 在多数情况下微生物是利用糖加丙酸或戊酸产生PHBV的,并可通过改变二者的配比控制 共聚物中HB和HV的比例。但丙酸或戊酸价格较高,且对细菌有毒,因而在培养液中的浓度必 须控制很低,导致产率及转化率都不高,这些都是生产上的不利因素。90年代后发现,在分 类上属于红球菌属( Rhodococcus)、诺卡氏菌属( nocardia)和棒杆菌属( Corynebacterium中的 些菌能利用葡萄糖或其它单一碳源产生含HV和HB的PHAs。例如红球菌 NCIMB40126以葡萄 糖为碳源时,PHAs积累量可达31%,其HV与HB的摩尔比为7624;极端嗜盐菌Halo/erax mediterranei利用淀粉为唯一碳源可产生含75~17.7%HV的PHBV。此外,真养产碱杆菌H16 的异亮氨酸缺陷型突变株R8能从果糖或葡萄糖酸等碳源产生PHBV,以果糖为碳源时,共聚物 占细胞干重的47%,HV与HB的摩尔比为793。这些发现不仅给PHAs生物合成和调节机制的研 究增加新的内容,而且开辟了一条探索从廉价的单一碳源生产PHBV的新路 各种微生物利用不同碳源产生PHAs的发酵水平比较见表8-1- 表8-1-2各种微生物利用不同碳源合成PHVs的情况及水平比较 使用菌种 碳源 规模时间 菌浓PHB含量 alstonia eutrophus N9A 果糖 摇瓶 Azotobacter beijerinckii 葡萄糖 摇瓶 70.4 Methylocystis paras OBBP|甲烷 摇瓶170-180 Rhodobacter sphaeroides17023乙酸 摇瓶 36 Thiocustis violacea 2311 乙酸 摇瓶 Haloferax mediterranei 7.5~17%HV Rhodococcus sp NCIMB40126葡萄糖 含76%HV Pseudomonas acidovorans l,4丁二酸摇瓶 含99%4HB omobacterium violacein戊酸 1.2-1445-65 HV同聚物 E.cOb重组菌 XLI Blue 葡萄糖 2.5L 1166 Pseudomonas oleovorans 辛酸 葡萄糖+戊酸25L38-40 16 mol%HV otobacter vinelandii UWD蜜+戊酸 8.5~23 2.5L38-4019-2259-71 mol%HV Protomonas extorquens 75L1 通纯氧 气升罐 Ralstonia eutrophus变异株葡萄糖 220m310-120大于10070-80通用搅拌罐 Ralstonia latus变异株 蔗糖 15m3 76 PHB>60 g/L Erwinia sp.重组菌 蔗糖 PHB生产强度 10L 064g/Lh) (二)PHAs的代谢途径与调控
3 产碱杆菌属(Ralstonia)，假单胞菌属(Pseudonomas)，甲基营养菌(Methylotrophs)，固氮菌属 (Azotobacter)和红螺菌属(Rhodospirilum)等，它们能分别利用不同的碳源产生不同的PHAs。 早期研究真养产碱杆菌(R. eutrophus)中PHB代谢的主要目的在于将PHB消除以便利用该 菌生产单细胞蛋白，后来才转向PHAs的生物合成和积累的研究。兼性化能自养型细菌在一定 的条件下积累PHB可达细胞干重的90%以上，也能利用糖加丙酸或戊酸产生P(3HB-co-3HV)。 近来的研究发现改变基质该菌还能将4HB和5HV结合到3HB的结构中去，形成4HB或5HV单体 与3HB的共聚物。 在多数情况下微生物是利用糖加丙酸或戊酸产生PHBV的，并可通过改变二者的配比控制 共聚物中HB和HV的比例。但丙酸或戊酸价格较高，且对细菌有毒，因而在培养液中的浓度必 须控制很低，导致产率及转化率都不高，这些都是生产上的不利因素。90年代后发现，在分 类上属于红球菌属(Rhodococcus)、诺卡氏菌属(Nocardia)和棒杆菌属(Corynebacterium)中的一 些菌能利用葡萄糖或其它单一碳源产生含HV和HB的PHAs。例如红球菌NCIMB40126以葡萄 糖为碳源时，PHAs积累量可达31%，其HV与HB的摩尔比为76:24；极端嗜盐菌Haloferax mediteerranei 利用淀粉为唯一碳源可产生含7.5～17.7%HV的PHBV。此外，真养产碱杆菌H16 的异亮氨酸缺陷型突变株R8能从果糖或葡萄糖酸等碳源产生PHBV，以果糖为碳源时，共聚物 占细胞干重的47%，HV与HB的摩尔比为7:93。这些发现不仅给PHAs生物合成和调节机制的研 究增加新的内容，而且开辟了一条探索从廉价的单一碳源生产PHBV的新路。 各种微生物利用不同碳源产生PHAs的发酵水平比较见表8-1-2。 表8-1-2 各种微生物利用不同碳源合成PHVs的情况及水平比较 使用菌种 碳源 规模 时间/ h 菌浓 / gL -1 PHB含量 / % 备注 Ralstonia eutrophus N9A 果糖 摇瓶 70 96 Azotobacter beijerinckii 葡萄糖 摇瓶 70.4 Methylocystis parvas OBBP 甲烷 摇瓶 170-180 70 Rhodobacter sphaeroides 17023 乙酸 摇瓶 36 69.9 Thiocystis violacea 2311 乙酸 摇瓶 36 83.0 Haloferax mediterranei 淀粉 摇瓶 67 7.5～17 %HV Rhodococcus sp. NCIMB 40126 葡萄糖 摇瓶 24 31 含76 %HV Pseudomonas acidovorans 1,4-丁二酸 摇瓶 96 4.3 18 含99 %4HB Chromobacterium violaceum 戊酸 摇瓶 72 1.2-1.4 45-65 HV同聚物 E. coli 重组菌XL1 Blue 葡萄糖 2.5 L 42 116.6 76 Pseudomonas oleovorans 辛酸 12 L 48 1.5 41 Azotobacter vinelandii UWD 葡萄糖+戊酸 糖蜜+戊酸 2.5 L 2.5 L 38-40 38-40 6.8 19-22 78 59-71 16 mol%HV 8.5～23 mol%HV Protomonas extorquens 甲醇 0.75L 170 223 64 通纯氧 Ralstonia eutrophus 变异株 葡萄糖 35 m 3 220m3 110-120 大于100 70-80 气升罐 通用搅拌罐 Ralstonia latus 变异株 蔗糖 15 m 3 76 PHB＞60 g/L Erwinia sp. 重组菌 蔗糖 5 L 35 28 68 Hyphomicrobium zavarzinii subsp. chengduense nov. 甲醇 10 L 40-59 PHB生产强度 0.64 g/(Lh) (二)PHAs 的代谢途径与调控
研究表明,许多微生物在碳源过量而其它某种营养成份如氮、磷、镁或氧不足时,能在 胞内大量积累PHAs以作为碳源和能源的贮存物。当限制性营养物再次被提供时,PHAs能被胞 内酶降解后作为碳源和能源利用。由于所用微生物种类和生长条件不同,多聚体的分子量 般在2×105~3×106之间。细胞中积累的PHAs以单个粒子的形态存在,在 R. eutrophus中,每 个细胞含有8-10个颗粒,每个颗粒直径大小为02至0.5μm,这些颗粒在活细胞体内以非晶体形 式存在。在电子或相差显微镜中观察到这些内含物具有高度的折光性。颗粒外面包裹着一层 膜,该膜没有通常的生物膜那样的典型双层结构,膜中含有PHAs合成酶的降解酶系统。有关 真养产碱杆菌中可溶性PHAs聚合酶的研究表明,当培养状态过渡到限氮条件时该酶与PHAs 颗粒相连 不同微生物合成PHAs的途径不同,基质不同其合成途径也有差异,这正是微生物代谢多 样性的一种表现。图8-1-1为一些微生物利用不同基质合成PHAs的主要代谢途径。 烷、醇和脂肪酸 糖 (3)(4) (1)2)5)(6) COASH CoASH I/ ATP AMP+pp 脂酰CoA 乙酰CoA 丙酰CoA FADH 乙酰CoA 乙酰乙酰CoA NADH+H 烯酰CoA β氧化 3-酮酰CoA L什+)-羟丁酰 CoACt NADPH+H/NADPH+H 丁烯酰CoA NADP NADP L什+B-羟酰CoA D-)3-羟酰 CoA D-)3-羟丁酰CoA 羟戊酰CoA CoAsH COASH COASH ASH 图8-1-1不同微生物中从不同基质合成PHAs的主要途径 (1)真养产碱杆菌及多数细菌从糖合成PHB (2)深红红螺菌从糖合成PHB (3)食油假单胞菌等从中链烃、醇及酸合成具有与基质链长有关的HA单位的PHAs (4)一株产碱杆菌从长链偶碳数脂肪酸合成PHB (5)铜绿假单胞菌等从糖质碳源(如葡萄糖酸)合成具中链HA单位的PHAs (6)真养产碱杆菌等利用糖加丙酸合成PHBV 在真养产碱杆菌、拜氏固氮菌以及许多微生物中,PHB是从乙酰辅酶A通过三步反应合成 的。一是由生物合成的β-酮基硫酯酶(乙酰辅酶A乙酰转移酶,EC2.3.1.9)催化两个乙酰辅酶A 的C-C结合;二是由依赖 NADPH的乙酰乙酰辅酶A还原酶(羟基丁酰辅酶A脱氢酶,EC1.1.1.36) 催化立体选择性的反应,从乙酰乙酰辅酶A产生D(-)-3-羟基丁酰辅酶A:三是由PHB聚合酶将 D-(-)-3-羟基丁酰辅酶A连接到PHB正在增长的链上 PHB生物合成途径中的前两个酶,即β-酮基硫酯酶和乙酰乙酰辅酶A还原酶,已被在数种 细菌中进行了详细的研究。在真养产碱杆菌中,β-酮基硫酯酶作为PHB生物合成途径中的第 个酶,以辅酶A为关键调节因子来控制PHB的合成。在该菌中检测到两个具有不同基质专一性 的βB-酮基硫酯酶,任一个酶在PHB合成中都可起作用。在真养产碱杆菌中还检测到两个不同的 乙酰乙酰辅酶A还原酶,它们在基质和辅酶的专一性方面不同,依赖于 NADPH的还原酶才参
4 研究表明，许多微生物在碳源过量而其它某种营养成份如氮、磷、镁或氧不足时，能在 胞内大量积累PHAs以作为碳源和能源的贮存物。当限制性营养物再次被提供时，PHAs能被胞 内酶降解后作为碳源和能源利用。由于所用微生物种类和生长条件不同，多聚体的分子量一 般在2×105～3×106之间。细胞中积累的PHAs以单个粒子的形态存在，在R. eutrophus中，每 个细胞含有8-10个颗粒，每个颗粒直径大小为0.2至0.5 m，这些颗粒在活细胞体内以非晶体形 式存在。在电子或相差显微镜中观察到这些内含物具有高度的折光性。颗粒外面包裹着一层 膜，该膜没有通常的生物膜那样的典型双层结构，膜中含有PHAs合成酶的降解酶系统。有关 真养产碱杆菌中可溶性PHAs聚合酶的研究表明，当培养状态过渡到限氮条件时该酶与PHAs 颗粒相连。 不同微生物合成PHAs的途径不同，基质不同其合成途径也有差异，这正是微生物代谢多 样性的一种表现。图8-1-1为一些微生物利用不同基质合成PHAs的主要代谢途径。 NADP+ NADP H+H+ NADP+ NADP H+H+ 烷、醇和脂肪酸 CoASH ATP AMP +ppi D(－)3－羟酰CoA P HA D(－)3－羟丁酰CoA CoASH P HB 乙酰CoA FDA FADH2 NADH+H+ 2 NAD+ H O 乙酰CoA 乙酰乙酰CoA CoASH NADH+H+ 丁烯酰CoA L(+)3－羟丁酰CoA NAD+ 2 H O 2 H O 糖 丙酰CoA D(－)3－羟戊酰CoA CoASH P HBV 丙酸 CoASH ATP AMP +ppi CoASH CoASH CoASH 烯酰CoA 3－酮酰CoA 脂酰CoA L(+)3-羟酰CoA 2 H O β-氧化 (3)(4) (5) (6) (4) (1)(6) (2) (1)(2)(5)(6) (6) 图8-1-1 不同微生物中从不同基质合成PHAs的主要途径 (1)真养产碱杆菌及多数细菌从糖合成PHB (2)深红红螺菌从糖合成PHB (3)食油假单胞菌等从中链烃、醇及酸合成具有与基质链长有关的HA单位的PHAs (4)一株产碱杆菌从长链偶碳数脂肪酸合成PHB (5)铜绿假单胞菌等从糖质碳源(如葡萄糖酸)合成具中链HA单位的PHAs (6)真养产碱杆菌等利用糖加丙酸合成PHBV 在真养产碱杆菌、拜氏固氮菌以及许多微生物中，PHB是从乙酰辅酶A通过三步反应合成 的。一是由生物合成的-酮基硫酯酶(乙酰辅酶A乙酰转移酶，EC2.3.1.9)催化两个乙酰辅酶A 的C-C结合；二是由依赖NADPH的乙酰乙酰辅酶A还原酶(羟基丁酰辅酶A脱氢酶，EC1.1.1.36) 催化立体选择性的反应，从乙酰乙酰辅酶A产生D-(-)-3-羟基丁酰辅酶A；三是由PHB聚合酶将 D-(-)-3-羟基丁酰辅酶A连接到PHB正在增长的链上。 PHB生物合成途径中的前两个酶，即-酮基硫酯酶和乙酰乙酰辅酶A还原酶，已被在数种 细菌中进行了详细的研究。在真养产碱杆菌中，-酮基硫酯酶作为PHB生物合成途径中的第一 个酶，以辅酶A为关键调节因子来控制PHB的合成。在该菌中检测到两个具有不同基质专一性 的-酮基硫酯酶，任一个酶在PHB合成中都可起作用。在真养产碱杆菌中还检测到两个不同的 乙酰乙酰辅酶A还原酶，它们在基质和辅酶的专一性方面不同，依赖于NADPH的还原酶才参