第十二章DNA的复制、修复与重组DNA技术 DNA是储存遗传信息的物质,亲代的遗传信息如何真实地传给子代,这个问题的实质就 是DNA分子如何复制( replication)成完全相同的两个拷贝,即DNA的合成,可见通过复制 遗传信息得以在传代中保留 DNA分子中的遗传信息又如何表达呢?现知基因表达的第一步是通过转录 ( transcription),即DNA的碱基按互补配对(G-C,A-T,A-U)的原则转变为RN分子上相 应的碱基序列,接着RNA通过翻译( translation),以三个碱基的序列作为一个氨基酸的遗 传密码,从而决定蛋白质的一级结构。不同基因编码不同结构的蛋白质,表现出不同的功能, 因而体现出多种多样的生命现象。遗传信息从DNA经RNA流向蛋白质的过程,是 Crick于1958 年提出的,称为分子生物学的中心法则( central dogma)(图12-1)。1970年 Temin提出“逆 向转录”( reverse transcription)扩充了中心法则的范围 基因或DNA是遗传信息的携带者,在细胞分裂过程中,亲代细胞所含的遗传信息,完整 地传递到两个子代细胞。这个过程的实质问题是DNA分子如何复制成完全相同的两个拷贝, 有许多酶和蛋白质参与复制过程,通过正确和完整的复制,亲代DNA的遗传信息真实地传给 子代,这是遗传信息一代一代传递下去的分子基础,这也是本章的重点内容。但生物体内外 环境存在着使DNA分子损伤的因素,因此机体还必须有一套DNA修复的机制。最后还将介绍 些有关重组DMA技术的概念和方法 第一节DNA复制的几个基本原则 半保留复制 Watson和 Crick于1953年提出的DNA双螺旋模型,碱基互补配对的原则,为DNA分 子的复制提供了理论基础,即亲代的DNA双链,每股链都可以作为模板,按碱基互补配对 原则指导DNA新链的合成,这样合成的两个子代DNA分子,碱基序列与亲代分子完全一样 但一条链是来自亲代的DNA链,另一条链是新合成的链,此即为半保留复制 ( semiconservative replication)a用1N标记亲代的DNA链,而用N标记新合成的DNA链的 实验,证实子代的DNA分子,一股链含15N,另一股含14N
- -1 第十二章 DNA 的复制、修复与重组 DNA 技术 DNA 是储存遗传信息的物质，亲代的遗传信息如何真实地传给子代，这个问题的实质就 是 DNA 分子如何复制(replication)成完全相同的两个拷贝，即 DNA 的合成，可见通过复制， 遗传信息得以在传代中保留。 DNA 分 子 中 的 遗传 信 息 又 如何 表 达 呢？ 现 知 基 因表 达 的 第一 步 是 通 过转 录 (transcription)，即 DNA 的碱基按互补配对（G-C，A-T，A-U）的原则转变为 RNA 分子上相 应的碱基序列，接着 RNA 通过翻译（translation），以三个碱基的序列作为一个氨基酸的遗 传密码，从而决定蛋白质的一级结构。不同基因编码不同结构的蛋白质，表现出不同的功能， 因而体现出多种多样的生命现象。遗传信息从 DNA 经 RNA 流向蛋白质的过程，是 Crick 于 1958 年提出的，称为分子生物学的中心法则(central dogma)(图 12-1)。1970 年 Temin 提出“逆 向转录”(reverse transcription)扩充了中心法则的范围。 基因或 DNA 是遗传信息的携带者，在细胞分裂过程中，亲代细胞所含的遗传信息，完整 地传递到两个子代细胞。这个过程的实质问题是 DNA 分子如何复制成完全相同的两个拷贝， 有许多酶和蛋白质参与复制过程，通过正确和完整的复制，亲代 DNA 的遗传信息真实地传给 子代，这是遗传信息一代一代传递下去的分子基础，这也是本章的重点内容。但生物体内外 环境存在着使 DNA 分子损伤的因素，因此机体还必须有一套 DNA 修复的机制。最后还将介绍 一些有关重组 DNA 技术的概念和方法。 第一节 DNA 复制的几个基本原则 一、半保留复制 Watson 和 Crick 于 1953 年提出的 DNA 双螺旋模型，碱基互补配对的原则，为 DNA 分 子的复制提供了理论基础，即亲代的 DNA 双链，每股链都可以作为模板，按碱基互补配对 原则指导 DNA 新链的合成，这样合成的两个子代 DNA 分子，碱基序列与亲代分子完全一样。 但 一 条链 是 来自 亲 代的 DNA 链， 另 一条 链是 新 合成 的链 ， 此即 为半 保 留复 制 (semiconservative replication)。用 15N 标记亲代的 DNA 链，而用 14N 标记新合成的 DNA 链的 实验，证实子代的 DNA 分子，一股链含 15N，另一股含 14N
二、半不连续复制 DNA双螺旋的两股链是反向平行( antiparallel的,新合成的两股子链,一股的方向为5′ 3′,另一股为3′→5′。那么体内是否存在两种DNA聚合酶?一种催化核苷酸以5′→3 方向聚合,另一种以3′→5′方向聚合。但从现知所有的DNA聚合酶都只能催化5′→3 方向合成。这个问题直到1968年冈崎( Okazaki)发现大肠杆菌DNA复制过程中出现一些含 1000~2000个核苷酸的片段,一旦合成终止,这些片段即连成一条长链。这种小片段被称为 冈崎片段( Okazaki fragment)。因此,复制时亲代DNA分子中那股3′→5′方向的母链作为 模板,指导新链以5′→3′方向连续合成,此链称为前导链( leading strand)。在前导链延长 1000~2000个核苷酸后,另一母链也作为模板指导新链也是沿5′→3′合成1000~200个 核苷酸的小片段,这就是冈崎片段。随着链的延长,可以有许多个冈崎片段,这条称 为随从链( lagging strand)。可见,随从链为不连续复制,所以DNA为半不连续复制 (semi- discontinuous replication),如图122所示。复制后,这些冈崎片段由DNA连接酶的作 用而连接成完整的新链 三、RNA引物 目前所发现的DNA聚合酶都需要一个具3′-OH的引物,才能将合成原料dNTP一个 个接上去。因为DNA聚合酶不能催化两个游离的dNTP在DNA模板上进行聚合,如图123 所示。实验又发现抑制RNA聚合酶的药物如利福霉素( (rifampicin)能抑制DNA的复制。再者 在体外DNA复制实验中发现冈崎片段的5′端都有一小段4~12个核苷酸的RNA引物(RNA primer)。现知RNA聚合酶合成新链时不需要引物,能直接催化游离NIP聚合。可见RNA 引物为DNA聚合酶提供聚合新核苷酸所需的3′OH2RNA引物最后被DNA聚合酶Ⅰ除去, 留下的空隙也由该酶补满,缺口再由DNA连接酶封口。 在DNA的复制需要RNA引物呢,除了DNA聚合酶不能催化两个游离dNTP的聚合, 而RNA引物酶却具有此能力外,这种作用尚可尽量减少DNA复制起始处的突变。因为游离 核苷酸起始处的聚合最容易出现差错,若用RNA引物,即使出现差错,由于最后将被DNA 聚合酶Ⅰ切除,便可提高DNA复制的真实性 四、复制的真实性
- -2 二、半不连续复制 DNA 双螺旋的两股链是反向平行(antiparallel)的，新合成的两股子链，一股的方向为 5′ →3′，另一股为 3′→5′。那么体内是否存在两种 DNA 聚合酶?一种催化核苷酸以 5′→3′ 方向聚合，另一种以 3′→5′方向聚合。但从现知所有的 DNA 聚合酶都只能催化 5′→3′ 方向合成。这个问题直到 1968 年冈崎(Okazaki)发现大肠杆菌 DNA 复 制过程中出现一些含 1000 ~2000 个核苷酸的片段，一旦合成终止，这些片段即连成一条长链。这种小片段被称为 冈崎片段(Okazaki fragment)。因此，复制时亲代 DNA 分子中那股 3′→5′方向的母链作为 模板，指导新链以 5′→3′方向连续合成，此链称为前导链(1eading strand)。在前导链延长 1000 ~2000 个核苷酸后，另一母链也作为模板指导新链也是沿 5′→3′合成 1 000 ~2 000 个 核苷酸的小片段，这就是冈崎片段。随着链的延长，可以有许多个冈崎片段，这条称 为随从链(1agging strand)。可见，随从链为不连续复制，所以 DNA 为半不连续复制 (semi-discontinuous replication)，如图 12-2 所示。复制后，这些冈崎片段由 DNA 连接酶的作 用而连接成完整的新链。 三、RNA 引物 目前所发现的 DNA 聚合酶都需要一个具 3′-OH 的引物，才能将合成原料 dNTP 一个一 个接上去。因为 DNA 聚合酶不能催化两个游离的 dNTP 在 DNA 模板上进行聚合，如图 12-3 所示。实验又发现抑制 RNA 聚合酶的药物如利福霉素(rifampicin)能抑制 DNA 的复制。再者 在体外 DNA 复制实验中发现冈崎片段的 5′端都有一小段 4~12 个核苷酸的 RNA 引物(RNA primer)。现知 RNA 聚合酶合成新链时不需要引物，能直接催化游离 NTP 聚合。可见 RNA 引物为 DNA 聚合酶提供聚合新核苷酸所需的 3′-OH。RNA 引物最后被 DNA 聚合酶Ⅰ除去， 留下的空隙也由该酶补满，缺口再由 DNA 连接酶封口。 在 DNA 的复制需要 RNA 引物呢，除了 DNA 聚合酶不能催化两个游离 dNTP 的聚合， 而 RNA 引物酶却具有此能力外，这种作用尚可尽量减少 DNA 复制起始处的突变。因为游离 核苷酸起始处的聚合最容易出现差错，若用 RNA 引物，即使出现差错，由于最后将被 DNA 聚合酶Ⅰ切除，便可提高 DNA 复制的真实性。 四、复制的真实性
NA复制过程是非常复杂的,需要许多酶类和蛋白质因子参加。这既保证DNA复制的 速度,又保证产物的高度真实性。这也保证了自然界种族延续中生物遗传特性的相对稳定性。 第二节参与DNA复制的一些酶类和蛋白质 大肠杆菌的DNA聚合 DNA聚合酶( DNA polymerase)的作用是将脱氧核苷酸连接成DNA,所用底物必须是 四种脱氧核苷三磷酸(dNTP),Mg2存在和一个DNA模板,按模板的序列将配对的脱氧核 苷酸逐个接上去,并且需要一个具有3′-OH的RNA引物或DNA的3′-OH端。使3′OH 与合成上去的dNTP分子α-磷酸连接成3′,5′磷酸二酯键,合成方向为5′→3′,如图 12-4。 从大肠杆菌纯化得到3种DNA聚合酶(I,Ⅱ,Ⅲ)。 (一)DNA聚合酶I 1955年 Kornberg发现了DNA聚合酶I(简称为poI),故也称为 Kornberg酶,并因此 而获得诺贝尔奖金。DNA聚合酶Ⅰ是一条分子质量为103X103Da的多肽链。具有多种催化 功能。若用蛋白酶轻度水解可得一个分子质量68X103Da的大片段和一个分子质量为36X10 Da的小片段,常将大片段称为 Klenow片段,此片段具有两种催化活性,一为上述的聚合功 能,另一为3′→5′外切酶的活性,从3′端水解DNA产生3′单核苷酸,如图12-5所示 这种3′→5′外切酶活性对保证DNA复制的真实性具有重要的意义。DNA聚合酶在接 上新的核苷酸前,它能对3′末端的碱基进行识别。若为配错的碱基,即通过3′→5′外切 酶活性把配错的碱基切除,再使正确的碱基聚合上去,保证DNA复制的高度真实性,这种 功能也称校读功能( proof reading)。小片段则具5′→3′外切酶的活性,它能从5′→3′ 向一个挨一个切除,产物为5′单核苷酸,或跨过若干个核苷酸再进行酶解,从5′末端释 放一寡核苷酸。可除去冈崎片段5′端的RNA引物和在DNA损伤修复中起重要的作用。可 见,DNA聚合酶I为一条多肽链上具有三种酶的活性,也是一种多功能酶(图12-7) 但DNA聚合酶Ⅰ并不是大肠杆菌DNA复制中主要的DNA合成酶,它的主要作用,是切除 RNA引物、填补空缺和DNA损伤的修复。 DNA聚合酶I为一条多肽链上具有三种酶的活性,是一种多功能酶(图12-7) 鉴于 Klenow片段兼具聚合及3′→5′外切活性,能非常准确按模板碱基序列合成DNA
- -3 DNA 复制过程是非常复杂的，需要许多酶类和蛋白质因子参加。这既保证 DNA 复制的 速度，又保证产物的高度真实性。这也保证了自然界种族延续中生物遗传特性的相对稳定性。 第二节 参与 DNA 复制的一些酶类和蛋白质 一、 大肠杆菌的 DNA 聚合酶 DNA 聚合酶（DNA polymerase）的作用是将脱氧核苷酸连接成 DNA，所用底物必须是 四种脱氧核苷三磷酸(dNTP ) ，Mg 2+存在和一个 DNA 模板，按模板的序列将配对的脱氧核 苷酸逐个接上去，并且需要一个具有 3′-OH 的 RNA 引物或 DNA 的 3′-OH 端。使 3′-OH 与合成上去的 dNTP 分子α-磷酸连接成 3′，5′磷酸二酯键，合成方向为 5′→3′，如图 12-4。 从大肠杆菌纯化得到 3 种 DNA 聚合酶(Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ )。 (一) DNA 聚合酶Ⅰ 1955 年 Kornberg 发现了 DNA 聚合酶Ⅰ(简称为 polⅠ)，故也称为 Kornberg 酶，并因此 而获得诺贝尔奖金。DNA 聚合酶Ⅰ是一条分子质量为 103X103 Da 的多肽链。具有多种催化 功能。若用蛋白酶轻度水解可得一个分子质量 68X103 Da 的大片段和一个分子质量为 36X103 Da 的小片段，常将大片段称为 Klenow 片段，此片段具有两种催化活性，一为上述的聚合功 能，另一为 3′→5′外切酶的活性，从 3′端水解 DNA 产生 3′单核苷酸，如图 12-5 所示。 这种 3′→5′外切酶活性对保证 DNA 复制的真实性具有重要的意义。DNA 聚合酶在接 上新的核苷酸前，它能对 3′末端的碱基进行识别。若为配错的碱基，即通过 3′→5′外切 酶活性把配错的碱基切除，再使正确的碱基聚合上去，保证 DNA 复制的高度真实性，这种 功能也称校读功能(proof reading)。小片段则具 5′→3′外切酶的活性，它能从 5′→3′方 向一个挨一个切除，产物为 5′单核苷酸，或跨过若干个核苷酸再进行酶解，从 5′末端释 放一寡核苷酸。可除去冈崎片段 5′端的 RNA 引物和在 DNA 损伤修复中起重要的作用。可 见，DNA 聚合酶Ⅰ为一条多肽链上具有三种酶的活性，也是一种多功能酶(图 12-7)。 但 DNA 聚合酶Ⅰ并不是大肠杆菌 DNA 复制中主要的 DNA 合成酶，它的主要作用，是切除 RNA 引物、填补空缺和 DNA 损伤的修复。 DNA 聚合酶Ⅰ为一条多肽链上具有三种酶的活性，是一种多功能酶(图 12-7)。 鉴于Klenow片段兼具聚合及3′→5′外切活性，能非常准确按模板碱基序列合成DNA
所以此片段是分子生物学常用的工具酶。 (二)DNA聚合酶Ⅱ 由一条多肽链构成。此酶除具有聚合酶的活性外,还具有3′→5′外切酶活性。它在 生物体内的确切作用不详,可能也是在DNA损伤修复中起作用 三)DNA聚合酶Ⅲ 此酶是一个多聚酶,由10种不同亚基组成的(图12-8),称为DNA聚合酶Ⅲ全酶(DNA lymerase Ill holoenzyme)。它具有三个特点:①是一种非常高的续进性( processivity)酶。 所谓续进性即在DNA聚合酶与模板分离下来之前加入的核苷酸平均数。续进性≡5000。 而DNA聚合酶Ⅰ仅合成3~200个核苷酸即自模板上释放②DNA聚合酶Ⅲ催化活性比DNA 聚合酶Ⅰ高很多倍,每秒可催化1000个核苷酸的聚合,而DNA聚合酶I每秒仅催化16-20 个核苷酸聚合。③DNA聚合酶Ⅲ不但催化活性大、合成速度快,而且由于具有3′→5′外 切酶活性,产物真实性高。所以,大肠杆菌DNA聚合酶Ⅲ是DNA复制必需的酶。 DNA聚合酶Ⅲ聚合和校正功能分别存在于a和ε亚基 DNA聚合酶Ⅲ全酶分子质量约900X103Da,全酶成不对称的二聚体,围绕着DNA双螺 旋,每个单体都具有催化活性,一个作用于前导链,另一个作用于随从链,使DNA两股链 在同一位置同一时间进行合成 二、真核细胞的DNA聚合藤 真核细胞的DNA聚合酶有5种,即DNA聚合酶α、β、Y、8和ε。DNA聚合酶a 负责随从链的合成,DNA聚合酶δ和增殖细胞核抗原( proliferating cell nuclear antigen,PCNA) 负责前导链的合成。PCNA是作为DNA聚合酶δ活性所需的一种辅助蛋白,有与E. COli dNA 聚合酶Ⅲ的β亚基类似的结构和功能,形成环状的夹钳,大大地增强DNA聚合酶δ的续进 性。DNA聚合酶γ负责线粒体DNA( mitochondria dna, mt dNa)的复制,DNA聚合酶β和 e的功能为DNA的修复 、解旋、解链酶类 复制时DNA双螺旋要解开,才能在原来的母链上合成新链。复制在不断延伸,螺旋要 不断解开。若每秒钟复制1000个碱基对,则要解旋100次。这样必然在复制前方产生很大 的张力,使DNA缠结,这要靠DNA拓扑异构酶等来解决
- -4 所以此片段是分子生物学常用的工具酶。 (二) DNA 聚合酶Ⅱ 由一条多肽链构成。此酶除具有聚合酶的活性外，还具有 3′→5′外切酶活性。它在 生物体内的确切作用不详，可能也是在 DNA 损伤修复中起作用。 (三) DNA 聚合酶Ⅲ 此酶是一个多聚酶，由 10 种不同亚基组成的( 图 12- 8)，称为 DNA 聚合酶Ⅲ全酶(DNA po1ymerase Ⅲ ho1oenzyme)。它具有三个特点：①是一种非常高的续进性(processivity)酶。 所谓续进性即在 DNA 聚合酶与模板分离下来之前加入的核苷酸平均数。续进性≧500 000。 而 DNA 聚合酶Ⅰ仅合成 3~200 个核苷酸即自模板上释放。②DNA 聚合酶Ⅲ催化活性比 DNA 聚合酶Ⅰ高很多倍，每秒可催化 1 000 个核苷酸的聚合，而 DNA 聚合酶Ⅰ每秒仅催化 16~20 个核苷酸聚合。③DNA 聚合酶Ⅲ不但催化活性大、合成速度快，而且由于具有 3′→5′外 切酶活性，产物真实性高。所以，大肠杆菌 DNA 聚合酶Ⅲ是 DNA 复制必需的酶。 DNA 聚合酶Ⅲ聚合和校正功能分别存在于α和ε亚基。 DNA 聚合酶Ⅲ全酶分子质量约 900X103 Da，全酶成不对称的二聚体，围绕着 DNA 双螺 旋，每个单体都具有催化活性，一个作用于前导链，另一个作用于随从链，使 DNA 两股链 在同一位置同一时间进行合成。 二、真核细胞的 DNA 聚合酶 真核细胞的 DNA 聚合酶有 5 种，即 DNA 聚合酶α、β、γ、δ和ε。DNA 聚合酶α 负责随从链的合成，DNA 聚合酶δ和增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA) 负责前导链的合成。PCNA是作为DNA聚合酶δ活性所需的一种辅助蛋白，有与E.coli DNA 聚合酶Ⅲ的β亚基类似的结构和功能，形成环状的夹钳，大大地增强 DNA 聚合酶δ的续进 性。DNA 聚合酶γ负责线粒体 DNA(mitochondria DNA, mt DNA)的复制，DNA 聚合酶β和 ε的功能为 DNA 的修复。 三、解旋、解链酶类 复制时 DNA 双螺旋要解开，才能在原来的母链上合成新链。复制在不断延伸，螺旋要 不断解开。若每秒钟复制 1 000 个碱基对，则要解旋 100 次。这样必然在复制前方产生很大 的张力，使 DNA 缠结，这要靠 DNA 拓扑异构酶等来解决
(一)DNA解链藤 DNA复制时,复制开始部位的DNA双螺旋必须解开成单链,模板链上的碱基才能以碱 基配对原则,指导新链的合成。解开DNA双螺旋的酶有多种,称为DNA解链酶(DNA helicase),该酶具有ATP酶的活性,在ATP的存在下,该酶能解开DNA双链,每解开1对 碱基消耗2个ATP (二)单链DNA结合蛋白 单链DNA结合蛋白( single strand binding protein,SSB)或螺旋去稳定蛋白(heliⅸx destabilizing protein HDP),能与已被解链酶解开的单链DNA结合,以维持模板处于单链状 态,又可保护其不被核酸酶水解。单链DNA结合SSB后既可避免重新形成双链的倾向,又 可避免自身发夹螺旋的形成,还能使前端双螺旋的稳定性降低,易被解开。当DNA聚合酶 在模板上前进,逐个接上脱氧核苷酸时,SSB即不断脱离,又不断与新解开的链结合 (三)DNA拓扑异构藤 拓扑一词是指物体作弹性移位而又保持物体不变的性质。DNA拓扑异构酶( topoIso- erase)有两类:其中拓扑异构酶Ⅰ,曾有过多种其他名称如转轴酶、解缠酶等。它能切断 DNA双链中的一股,使DNA解链旋转时不致缠结,解除张力后又把切口封闭。拓扑异构酶 Ⅱ,又称旋转酶( gyrase),暂时切断DNA双链,使另一DNA双链经过此切口,随后又再封 闭切口。 四、引发体 引发体( primosome)是由多种蛋白质及酶组成,是DNA复制开始所必需的。引发体中的 某些蛋白质如DnaA能结合至DNA复制起始部位,DnaB具有解链酶的作用,DnaC辅助DnaB 结合到复制起始点,使起始部位的双链解开。而引发体中的引物酶( primase)在己解开起始部 位的DNA单链按碱基互补配对催化NTP聚合,合成一小片段的RNA,作为DNA合成的引 物,即沿此引物RNA的3′OH进行延伸。 五、DNA连接酶 DNA连接酶( DNA ligase)催化两段DNA链之间磷酸二酯键的形成。要求DNA链 3′端有游离的OH,而5′端带有磷酸根,连接过程需要ATP供能,如图12-9 DNA连接酶不能连接两分子单链的DNA,只能作用双链DNA分子中一股链上的缺口
- -5 (一) DNA 解链酶 DNA 复制时，复制开始部位的 DNA 双螺旋必须解开成单链，模板链上的碱基才能以碱 基配对原则，指导新链的合成。解开 DNA 双螺旋的酶有多种，称为 DNA 解链酶(DNA helicase)，该酶具有 ATP 酶的活性，在 ATP 的存在下，该酶能解开 DNA 双链，每解开 1 对 碱基消耗 2 个 ATP。 (二) 单链 DNA 结合蛋白 单链 DNA 结合蛋白(single strand binding protein，SSB) 或螺旋去稳定蛋白(helix destabilizing protein HDP)，能与已被解链酶解开的单链 DNA 结合，以维持模板处于单链状 态，又可保护其不被核酸酶水解。单链 DNA 结合 SSB 后既可避免重新形成双链的倾向，又 可避免自身发夹螺旋的形成，还能使前端双螺旋的稳定性降低，易被解开。当 DNA 聚合酶 在模板上前进，逐个接上脱氧核苷酸时，SSB 即不断脱离，又不断与新解开的链结合。 (三) DNA 拓扑异构酶 拓扑一词是指物体作弹性移位而又保持物体不变的性质。DNA 拓扑异构酶(topoisomerase)有两类：其中拓扑异构酶Ⅰ，曾有过多种其他名称如转轴酶、解缠酶等。它能切断 DNA 双链中的一股，使 DNA 解链旋转时不致缠结，解除张力后又把切口封闭。拓扑异构酶 Ⅱ，又称旋转酶(gyrase)，暂时切断 DNA 双链，使另一 DNA 双链经过此切口，随后又再封 闭切口。 四、引发体 引发体(primosome)是由多种蛋白质及酶组成，是 DNA 复制开始所必需的。引发体中的 某些蛋白质如 DnaA 能结合至 DNA 复制起始部位，DnaB 具有解链酶的作用，DnaC 辅助 DnaB 结合到复制起始点，使起始部位的双链解开。而引发体中的引物酶(primase)在已解开起始部 位的 DNA 单链按碱基互补配对催化 NTP 聚合，合成一小片段的 RNA，作为 DNA 合成的引 物，即沿此引物 RNA 的 3′-OH 进行延伸。 五、DNA 连接酶 DNA 连接酶(DNA 1igase)催化两段 DNA 链之间磷酸二酯键的形成。要求 DNA 链 3′端有游离的 OH，而 5′端带有磷酸根，连接过程需要 ATP 供能,如图 12-9。 DNA 连接酶不能连接两分子单链的 DNA，只能作用双链 DNA 分子中一股链上的缺口