第二十一章基因诊断与基因治疗 基因诊断与基因治疗能够在比较短的时间从理论设想变为现实,主要是由于分子生物学 的理论及技术方法,特别是重组DNA技术的迅速发展,使人们可以在实验室构建各种载体、 克隆及分析目标基因。所以对疾病能够深入至分子水平的研究,并已取得了重大的进展。因 此在20世纪70年代末诞生了基因诊断( gene diagnosis};随后于1990年美国实施了第一个基 因治疗( gene therapy)的临床试验方案。可见,基因诊断和基因治疗是现代分子生物学的理论和 技术与医学相结合的范例。 第一节基因诊断 基因诊断的含义 传统对疾病的诊断主要是以疾病的表型改变为依据,如患者的症状、血尿各项指标的变 化,或物理检査的异常结果,然而表型的改变在许多情况下不是特异的,而且是在疾病发生 的一定时间后才出现,因此常不能及时作出明确的诊断。现知各种表型的改变是由基因异常 造成的,也就是说基因的改变是引起疾病的根本原因。基因诊断是指采用分子生物学的技术 方法来分析受检者的某一特定基因的结构(DNA水平)或功能(RNA水平)是否异常,以此 来对相应的疾病进行诊断。基因诊断有时也称为分子诊断或DNA诊断( dnA diagnosis)基因 诊断是病因的诊断,既特异又灵敏,可以揭示尚未出现症状时与疾病相关的基因状态,从而 可以对表型正常的携带者及某种疾病的易感者作出诊断和预测,特别对确定有遗传疾病家族 史的个体或产前的胎儿是否携带致病基因的检测具有指导意义 基因诊断的原理及方法 (一)基因诊断的原理 疾病的发生不仅与基因结构的变异有关,而且与其表达功能异常有关。基因诊断的基本 原理就是检测相关基因的结构及其表达功能特别是RNA产物是否正常。由于DNA的突变、 缺失、插入、倒位和基因融合等均可造成相关基因结枃变异,因此,可以直接检测上述的变 化或利用连锁方法进行分析,这就是DNA诊断 对表达产物mRNA质和量变化的分析为RNA诊断( RNA diagnosis) (二)基因诊断的方法
1 第二十一章 基因诊断与基因治疗 基因诊断与基因治疗能够在比较短的时间从理论设想变为现实，主要是由于分子生物学 的理论及技术方法，特别是重组 DNA 技术的迅速发展，使人们可以在实验室构建各种载体、 克隆及分析目标基因。所以对疾病能够深入至分子水平的研究，并已取得了重大的进展。因 此在 20 世纪 70 年代末诞生了基因诊断(gene diagnosis)；随后于 1990 年美国实施了第一个基 因治疗(gene therapy)的临床试验方案。可见，基因诊断和基因治疗是现代分子生物学的理论和 技术与医学相结合的范例。 第一节 基因诊断 一. 基因诊断的含义 传统对疾病的诊断主要是以疾病的表型改变为依据，如患者的症状、血尿各项指标的变 化，或物理检查的异常结果，然而表型的改变在许多情况下不是特异的，而且是在疾病发生 的一定时间后才出现，因此常不能及时作出明确的诊断。现知各种表型的改变是由基因异常 造成的，也就是说基因的改变是引起疾病的根本原因。基因诊断是指采用分子生物学的技术 方法来分析受检者的某一特定基因的结构（DNA 水平）或功能（RNA 水平）是否异常，以此 来对相应的疾病进行诊断。基因诊断有时也称为分子诊断或 DNA 诊断(DNA diagnosis)。基因 诊断是病因的诊断，既特异又灵敏，可以揭示尚未出现症状时与疾病相关的基因状态，从而 可以对表型正常的携带者及某种疾病的易感者作出诊断和预测，特别对确定有遗传疾病家族 史的个体或产前的胎儿是否携带致病基因的检测具有指导意义。 二. 基因诊断的原理及方法 （一）基因诊断的原理 疾病的发生不仅与基因结构的变异有关，而且与其表达功能异常有关。基因诊断的基本 原理就是检测相关基因的结构及其表达功能特别是 RNA 产物是否正常。由于 DNA 的突变、 缺失、插入、倒位和基因融合等均可造成相关基因结构变异，因此，可以直接检测上述的变 化或利用连锁方法进行分析，这就是 DNA 诊断。 对表达产物 mRNA 质和量变化的分析为 RNA 诊断(RNA diagnosis)。 （二）基因诊断的方法
基因诊断是以核酸分子杂交( nucleic acid molecular hybridization)和聚合酶链反应(PCR) 为核心发展起来的多种方法,同时配合DNA序列分析,近年新兴的基因芯片可能会发展成为 一种很有用的基因诊断方法 1.DNA诊断 常用检测致病基因结构异常的方法有下列几种 (1)斑点杂交:根据待测DNA样本与标记的DNA探针杂交的图谱,可以判断目标基因 或相关的DNA片段是否存在,根据杂交点的强度可以了解待测基因的数量 (2)等位基因特异的寡核苷酸探针(alle- specific oligonucleotide probe, ASO probe)杂交: 是一种检测基因点突变的方法,根据点突变位点上下游核苷酸序列,人工合成约19个核苷酸 长度的片段,突变的碱基位于当中,经放射性核素或地高辛标记后可作为探针,在严格杂交 条件下,只有该点突变的DNA样本,才出现杂交点,即使只有一个碱基不配对,也不可能形 成杂交点。一般尚合成正常基因同一序列,同一大小的寡核苷酸片段作为正常探针。如果受 检的DNA样本只能与突变ASO探针,不与正常ASO探针杂交,说明受检二条染色体上的基 因都发生这种突变,为突变纯合子;如果既能与突变ASO探针又能与正常ASO探针杂交, 说明一条染色体上的基因发生突变,另一条染色体上为正常基因,为这种突变基因的杂合子; 如果只能与正常ASO探针杂交,不能与突变ASO杂交,说明受检者不存在该种突变基因, 如图21-1所示。 若与PCR方法联合应用,即 PCR/ASO探针杂交法( PCR/ASO probe hybridization),是 种检测基因点突变的简便方法,先用PCR方法扩增突变点上下游的序列,扩增产物再与ASO 探针杂交,可明确诊断突变的纯合子和杂合子。此法对一些已知突变类型的遗传病,如地中 海贫血、苯丙酮尿症等纯合子和杂合子的诊断很方便。也可分析癌基因如H-ras和抑癌基因如 p53的点突变。 3)单链构象多态性( single strand conformation polymorphism,SSCP)分析相同长度的单 链DNA因其序列不同,甚至单个碱基不同,所形成的构象不尽相同,在非变性聚丙烯酰胺凝 胶电泳时速度就不同,若单链DNA用放射性核素标记,显影后即可区分电泳条带。一般先设 计引物对突变点所在外显子进行扩增,PCR产物经变性成单链后进行电泳分析。 PCR/SSCP方
2 基因诊断是以核酸分子杂交(nucleic acid molecular hybridization)和聚合酶链反应（PCR） 为核心发展起来的多种方法，同时配合 DNA 序列分析，近年新兴的基因芯片可能会发展成为 一种很有用的基因诊断方法。 1. DNA 诊断 常用检测致病基因结构异常的方法有下列几种。 ⑴ 斑点杂交：根据待测 DNA 样本与标记的 DNA 探针杂交的图谱，可以判断目标基因 或相关的 DNA 片段是否存在，根据杂交点的强度可以了解待测基因的数量。 ⑵ 等位基因特异的寡核苷酸探针（allele-specific oligonucleotide probe, ASO probe）杂交： 是一种检测基因点突变的方法，根据点突变位点上下游核苷酸序列，人工合成约 19 个核苷酸 长度的片段，突变的碱基位于当中，经放射性核素或地高辛标记后可作为探针，在严格杂交 条件下，只有该点突变的 DNA 样本，才出现杂交点，即使只有一个碱基不配对，也不可能形 成杂交点。一般尚合成正常基因同一序列，同一大小的寡核苷酸片段作为正常探针。如果受 检的 DNA 样本只能与突变 ASO 探针，不与正常 ASO 探针杂交，说明受检二条染色体上的基 因都发生这种突变，为突变纯合子；如果既能与突变 ASO 探针又能与正常 ASO 探针杂交， 说明一条染色体上的基因发生突变，另一条染色体上为正常基因，为这种突变基因的杂合子； 如果只能与正常 ASO 探针杂交，不能与突变 ASO 杂交，说明受检者不存在该种突变基因， 如图 21-1 所示。 若与 PCR 方法联合应用，即 PCR/ASO 探针杂交法(PCR/ASO probe hybridization)，是一 种检测基因点突变的简便方法，先用 PCR 方法扩增突变点上下游的序列，扩增产物再与 ASO 探针杂交，可明确诊断突变的纯合子和杂合子。此法对一些已知突变类型的遗传病，如地中 海贫血、苯丙酮尿症等纯合子和杂合子的诊断很方便。也可分析癌基因如 H-ras 和抑癌基因如 p53 的点突变。 ⑶ 单链构象多态性（single strand conformation polymorphism, SSCP）分析相同长度的单 链 DNA 因其序列不同，甚至单个碱基不同，所形成的构象不尽相同，在非变性聚丙烯酰胺凝 胶电泳时速度就不同，若单链 DNA 用放射性核素标记，显影后即可区分电泳条带。一般先设 计引物对突变点所在外显子进行扩增，PCR 产物经变性成单链后进行电泳分析。PCR/SSCP 方
法,能快速、灵敏、有效地检测DNA突变点,如图21-2,此法可用检测点突变的遗传疾病, 如苯丙酮尿症、血友病等,以及点突变的癌基因和抑癌基因 (4)限制性内切酶图谱( restriction map)分析,如果DNA突变后改变了某一核酸限制性 内切酶的识别位点,使原来某一识别位点消失,或形成了新的识别位点,那么相应限制性内 切酶片段的长度和数目会发生改变。一般基因组DNA经该种限制性内切酶水解,再做 Southern 印迹,根据杂交片段的图谱,可诊断该点突变,如图21-3所示。如果用PCR扩增该突变点的 外显子,PCR产物经该种酶消化后,进行琼脂糖电泳,溴乙锭染色后可直接观察片段的大小 及数目。此法可用于检测有些限制性内切酶识别位点消失的遗传疾病,如镰状细胞贫血。或 基因缺失的疾病如α地中海贫血症,单纯性生长激素缺乏症等。 (5)限制性片段长度多态性( restriction fragment length polymorphism,RFLP)遗传连锁分 析人群中个体间DNA的序列存在差异,据估计每100-200个核苷酸中便有1个发生突变,这 种现象称为DNA多态性。有些DNA多态性可改变某一限制性内切酶的识别位点,因而产生 了DNA限制性片段长度多态性。RFLP按孟德尔方式遗传,在某一特定的家庭中,如果某一 致病基因与特定的多态性片段连锁,可以遗传给子代,因此这一多态性片段可作为遗传标记 来判断该家庭成员或胎儿的基因组中是否携带该致病基因,见图21-4,此法可用于诊断甲型 血友病、苯丙酮尿症、享延顿舞蹈病等 (6)DNA序列分析对致病有关的DNA片段进行序列测定,是诊断基因异常(已知和未知) 最直接和准确的方法 2.RNA诊断 RNA诊断主要是分析基因的表达功能,检测转录物的质和量,以判断基因转录效率的高 低,以及转录物的大小 (1)RNA印迹( Northern blot)RNA印迹是检测基因是否表达,表达产物mRNA的大小的 可靠方法,根据杂交条带的强度,可以判断基因表达的效率。 (2)RI-PCR是一种检测基因表达产物mRNA灵敏的方法,若与荧光定量PCR结合可对 RT-PCR产物量进行准确测定 三.基因诊断的应用
3 法，能快速、灵敏、有效地检测 DNA 突变点，如图 21-2，此法可用检测点突变的遗传疾病， 如苯丙酮尿症、血友病等，以及点突变的癌基因和抑癌基因。 ⑷ 限制性内切酶图谱（restriction map）分析，如果 DNA 突变后改变了某一核酸限制性 内切酶的识别位点，使原来某一识别位点消失，或形成了新的识别位点，那么相应限制性内 切酶片段的长度和数目会发生改变。一般基因组 DNA 经该种限制性内切酶水解，再做 Southern 印迹，根据杂交片段的图谱，可诊断该点突变，如图 21-3 所示。如果用 PCR 扩增该突变点的 外显子，PCR 产物经该种酶消化后，进行琼脂糖电泳，溴乙锭染色后可直接观察片段的大小 及数目。此法可用于检测有些限制性内切酶识别位点消失的遗传疾病，如镰状细胞贫血。或 基因缺失的疾病如α地中海贫血症，单纯性生长激素缺乏症等。 ⑸ 限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism ,RFLP）遗传连锁分 析人群中个体间 DNA 的序列存在差异，据估计每 100-200 个核苷酸中便有 1 个发生突变，这 种现象称为 DNA 多态性。有些 DNA 多态性可改变某一限制性内切酶的识别位点，因而产生 了 DNA 限制性片段长度多态性。RFLP 按孟德尔方式遗传，在某一特定的家庭中，如果某一 致病基因与特定的多态性片段连锁，可以遗传给子代，因此这一多态性片段可作为遗传标记， 来判断该家庭成员或胎儿的基因组中是否携带该致病基因，见图 21-4，此法可用于诊断甲型 血友病、苯丙酮尿症、享延顿舞蹈病等。 ⑹ DNA 序列分析对致病有关的 DNA 片段进行序列测定，是诊断基因异常（已知和未知） 最直接和准确的方法。 2. RNA 诊断 RNA 诊断主要是分析基因的表达功能，检测转录物的质和量，以判断基因转录效率的高 低，以及转录物的大小。 ⑴RNA 印迹（Northern blot）RNA 印迹是检测基因是否表达，表达产物 mRNA 的大小的 可靠方法，根据杂交条带的强度，可以判断基因表达的效率。 ⑵RT-PCR 是一种检测基因表达产物 mRNA 灵敏的方法，若与荧光定量 PCR 结合可对 RT-PCR 产物量进行准确测定。 三. 基因诊断的应用
(一)遗传疾病 现知遗传疾病有数千种,但多数遗传疾病属少见病例,有些遗传疾病在不同民族,不同 地区的人群中发病率不同,例如镰状细胞贫血( sickle cell anemia),非洲黑色人种发病率高, 而囊性纤维化症( cystic fibrosis)常见于美国白色人种,这二种遗传疾病在我国为罕见病例。 中国较常见的遗传疾病有地中海贫血、甲型血友病、乙型血友病、苯丙酮尿症、杜氏肌营养 不良症(DMD)、葡萄糖-6磷酸脱氢酶(G-6PD)缺乏症、唐氏综合症(Dow' syndrome) 等 根据不同遗传疾病的分子基础,可采用不同的技术方法进行诊断,不但可对有症状患者 进行检测,而且对遗传疾病家族中未发病的成员乃至胎儿甚至胚胎着床前( preimplantation) 进行诊断是否携带有异常基因,这对婚育具有指导意义 地中海贫血(地贫)是世界上最常见和发生率最高的一种单基因遗传疾病( monogenIc disease),由于一种或几种珠蛋白合成障碍导致a类与β类珠蛋白不平衡造成的,临床以贫血 黄疸、肝脾肿大及特殊外貌为特征,地贫最常见的有两类:α地贫和β地贫。 α地贫(a- thalassemias)的分子基础主要为α珠蛋白基因缺失,也有部分病例是由于碱基 突变造成的。可采用限制性内切酶图谱方法检测a珠蛋白基因的缺失 人a珠蛋白基因簇位于16号染色体,长度29kb,包含7个连锁的a类基因或假基因。 α基因(α1及α2编码序列相同,仅非编码序列稍有差别,产物相同),该基因簇上有2个 Eco RI 识别位点,经 EcoRI酶解,进行 Southem印迹,用标记的a基因片段作探针,得到一条23kl 的杂交条带,BmH识别位点有4个,但只有14kb片段能与mRNA基因探针杂交,见图21-5。 Hb bart’s胎儿水肿综合征:由于该病患儿二条16号染色体的4个α珠蛋白基因均缺失, 不能合成α链,胎儿全身水肿、肝脾肿大、四肢短小,常于妊娠30-40周死亡或早产后半小 时内死亡。样本DNA经限制性内切酶图谱分析不能显示a珠蛋白基因区带,RNA诊断也测 定不出有a珠蛋白基因的mRNA。 缺失型HBH病:由于一条16号染色体上的两个a珠蛋白基因均缺失,另一条16号染色 体上则缺失一个α珠蛋白基因,并缺失3.7k长度的DNA片段(右侧缺失型)或42kb片段 (左侧缺失型),DNA诊断只产生19kb长度的 EcoRI片段,或10 kb bamh片段
4 （一）遗传疾病 现知遗传疾病有数千种，但多数遗传疾病属少见病例，有些遗传疾病在不同民族，不同 地区的人群中发病率不同，例如镰状细胞贫血（sickle cell anemia）,非洲黑色人种发病率高， 而囊性纤维化症（cystic fibrosis）常见于美国白色人种，这二种遗传疾病在我国为罕见病例。 中国较常见的遗传疾病有地中海贫血、甲型血友病、乙型血友病、苯丙酮尿症、杜氏肌营养 不良症（DMD）、葡萄糖-6 磷酸脱氢酶（G-6PD）缺乏症、唐氏综合症（Down’s syndrome） 等。 根据不同遗传疾病的分子基础，可采用不同的技术方法进行诊断，不但可对有症状患者 进行检测，而且对遗传疾病家族中未发病的成员乃至胎儿甚至胚胎着床前（preimplantation） 进行诊断是否携带有异常基因，这对婚育具有指导意义。 地中海贫血（地贫）是世界上最常见和发生率最高的一种单基因遗传疾病（monogenic disease）,由于一种或几种珠蛋白合成障碍导致α类与β类珠蛋白不平衡造成的，临床以贫血、 黄疸、肝脾肿大及特殊外貌为特征，地贫最常见的有两类：α地贫和β地贫。 α地贫(α-thalassemias)的分子基础主要为α珠蛋白基因缺失，也有部分病例是由于碱基 突变造成的。可采用限制性内切酶图谱方法检测α珠蛋白基因的缺失。 人α珠蛋白基因簇位于 16 号染色体，长度 29 kb，包含 7 个连锁的α类基因或假基因。 α基因（α1 及α2 编码序列相同，仅非编码序列稍有差别,产物相同），该基因簇上有 2 个 EcoRI 识别位点，经 EcoRI 酶解，进行 Southern 印迹，用标记的α基因片段作探针，得到一条 23 kb 的杂交条带，BamHI 识别位点有 4 个，但只有 14 kb 片段能与 mRNA 基因探针杂交，见图 21-5。 Hb Bart’s 胎儿水肿综合征：由于该病患儿二条 16 号染色体的 4 个α珠蛋白基因均缺失， 不能合成α链，胎儿全身水肿、肝脾肿大、四肢短小，常于妊娠 30－40 周死亡或早产后半小 时内死亡。样本 DNA 经限制性内切酶图谱分析不能显示α珠蛋白基因区带，RNA 诊断也测 定不出有α珠蛋白基因的 mRNA。 缺失型 HBH 病：由于一条 16 号染色体上的两个α珠蛋白基因均缺失，另一条 16 号染色 体上则缺失一个α珠蛋白基因，并缺失 3.7 kb 长度的 DNA 片段（右侧缺失型）或 4.2 kb 片段 （左侧缺失型），DNA 诊断只产生 19 kb 长度的 EcoRI 片段，或 10kb BamHI 片段
标准型a地贫:一条16号染色体上2个a珠蛋白基因全部缺失。而另一条16号染色体 上具有2个正常的a珠蛋白基因,DNA诊断结果, EcoRI和BamH都出现与正常一样的23kb 或14kb的条带,但杂交条带的放射性自显影较正常人浅。 β地贫(β thalassemias)的基因诊断:β地贫的分子基础不同于a地贫,β珠蛋白基因通 常并不缺失,而是由于基因点突变或个别碱基的插入或缺失。每一民族和人群β珠蛋白基因 点突变部位不尽相同,都有特定的类型谱。 (二)感染性疾病 过去对感染性疾病( infectious diseases)的诊断,一是直接分离检查病原体,或者对患者血 清学或生物化学的分析。有些病原体不容易分离,有些需经过长期培养才能获得。血清学对 病原体抗体的检测虽然很方便,但是病原体感染人体后需要间隔一段时间后才出现抗体,并 且血清学检査只能确定是否接触过该种病原体,但不能确定是否有现行感染,对潜伏病原体 的检查有困难 对感染性疾病的基因诊断具有快速、灵敏、特异等优点。80年代建立的PCR技术已广泛 应用于对病原体的检测。一般根据各病原体特异和保守的序列设计引物,有的还合成ASO探 针,对病原体的DNA可用PCR技术直接检查,而对RNA病毒,则采用 RT-PCR。现在市场 已经有许多种病原体的测定药盒供应,每一盒包含扩增某种病原体的特异引物,所需的酶以 及配妥的各种反应试剂,并附有可行的操作方法步骤 1.病毒性感染: 多种病毒性感染都可采用基因诊断检测相应的病原体,如甲型、乙型、丙型和丁型肝炎 病毒,人免疫缺陷病毒、可萨奇病毒、脊髓灰质类病毒、腺病毒、EB病毒、疱疹病毒、人巨 细胞病毒、乳头状病毒……等。最近新发现的SARS冠状病毒,在基因组(RNA)序列确定 后,便很快建立了 RT-PCR的基因诊断法 2.细菌性感染: 可应用基因诊断检测多种致病性的细菌,如结核分枝杆菌、痢疾性大肠杆菌、霍乱弧菌 淋球菌、绿脓杆菌……等。 3.寄生虫:
5 标准型α地贫：一条 16 号染色体上 2 个α珠蛋白基因全部缺失。而另一条 16 号染色体 上具有 2 个正常的α珠蛋白基因，DNA 诊断结果，EcoRI 和 BamHI 都出现与正常一样的 23 kb 或 14 kb 的条带，但杂交条带的放射性自显影较正常人浅。 β地贫(β-thalassemias)的基因诊断：β地贫的分子基础不同于α地贫，β珠蛋白基因通 常并不缺失，而是由于基因点突变或个别碱基的插入或缺失。每一民族和人群β珠蛋白基因 点突变部位不尽相同，都有特定的类型谱。 （二）感染性疾病 过去对感染性疾病(infectious diseases)的诊断，一是直接分离检查病原体，或者对患者血 清学或生物化学的分析。有些病原体不容易分离，有些需经过长期培养才能获得。血清学对 病原体抗体的检测虽然很方便，但是病原体感染人体后需要间隔一段时间后才出现抗体，并 且血清学检查只能确定是否接触过该种病原体，但不能确定是否有现行感染，对潜伏病原体 的检查有困难。 对感染性疾病的基因诊断具有快速、灵敏、特异等优点。80 年代建立的 PCR 技术已广泛 应用于对病原体的检测。一般根据各病原体特异和保守的序列设计引物，有的还合成 ASO 探 针，对病原体的 DNA 可用 PCR 技术直接检查，而对 RNA 病毒，则采用 RT-PCR。现在市场 已经有许多种病原体的测定药盒供应，每一盒包含扩增某种病原体的特异引物，所需的酶以 及配妥的各种反应试剂，并附有可行的操作方法步骤。 1. 病毒性感染： 多种病毒性感染都可采用基因诊断检测相应的病原体，如甲型、乙型、丙型和丁型肝炎 病毒，人免疫缺陷病毒、可萨奇病毒、脊髓灰质类病毒、腺病毒、EB 病毒、疱疹病毒、人巨 细胞病毒、乳头状病毒……等。最近新发现的 SARS 冠状病毒，在基因组（RNA）序列确定 后，便很快建立了 RT-PCR 的基因诊断法。 2. 细菌性感染： 可应用基因诊断检测多种致病性的细菌，如结核分枝杆菌、痢疾性大肠杆菌、霍乱弧菌、 淋球菌、绿脓杆菌……等。 3. 寄生虫：