或双链DNA分子双股的缺口。如DNA经限制性内切核酸酶切割后,两个片段的粘性末端相 配,DNA连接酶能使之连接。即使是两段平齐DNA,DNA连接酶也能使之连接。在DNA 复制过程中,当RNA引物清除后,靠DNA聚合酶Ⅰ填补空缺,冈崎片段之间的缺口靠DNA 连接酶作用而连成完整的一条新链。DNA连接酶在DNA损伤修复中亦起重要作用,并且是 一种重要的工具酶 第三节DNA复制过程 、复制的起始 大肠杆菌复制时有特定的起始部位称为orC,长度为245bp。有3个串连排列的核苷酸 序列,每个由13个核苷酸组成。其序列基本相同为 GATCTNTINTTTT,而且GATC在oriC 部位出现11次,orC还有4个DnaA结合位点,是4个9bp序列的反向重复,这些序列都 是高度保守的(图12-10。) DnaA先结合至复制起始点,然后发动了复杂的变化。DnaB和DnaC亦参加进去,从而 使双链解开,DNA结合蛋白便与单链DNA结合。接着引物酶按碱基配对原则合成一小段的 RNA引物,此引物的3′-OH可供DNA聚合酶Ⅲ将第一个dNTP加到3′-OH上而形成3 5′磷酸二酯键。复制是从oriC开始,同时向两个方向进行的,称为双向复制( bi-directional replication) 复制开始后由于DNA双链解开,在两股单链上进行复制。在电子显微镜下观察DNA 复制前进部位伸展成叉状,称为复制叉( (replication fork,如图12-12 复制的延长 在DNA聚合酶Ⅲ的作用下,新合成的DNA链不断延长。大肠杆菌的冈崎片段长度为1 000~2000个核苷酸,即前导链合成1000~2000个核苷酸后,随从链便开始合成。在延长过 程中,由于拓扑异构酶的作用,避免了在复制叉前方的DNA打结。 复制的终止 在DNA延长阶段结束后,原核生物的RNA引物被DNA聚合酶Ⅰ切除。留下的空隙, 由DNA聚合酶Ⅰ进行补满,即从另一冈崎片段的3′-OH按5′→3′根据碱基配对原则 将一个个的dNTP补上去。最后的缺口再由DNA连接酶将相邻的两个核苷酸借磷酸二酯键 连起来,即成完整的一条新链,DNA的复制即告完成,如图12-15
- -6 或双链 DNA 分子双股的缺口。如 DNA 经限制性内切核酸酶切割后，两个片段的粘性末端相 配，DNA 连接酶能使之连接。即使是两段平齐 DNA，DNA 连接酶也能使之连接。在 DNA 复制过程中，当 RNA 引物清除后，靠 DNA 聚合酶Ⅰ填补空缺，冈崎片段之间的缺口靠 DNA 连接酶作用而连成完整的一条新链。DNA 连接酶在 DNA 损伤修复中亦起重要作用，并且是 一种重要的工具酶。 第三节 DNA 复制过程 一、复制的起始 大肠杆菌复制时有特定的起始部位称为 oriC，长度为 245bp。有 3 个串连排列的核苷酸 序列，每个由 13 个核苷酸组成。其序列基本相同为 GATCTNTTNTTTT，而且 GATC 在 oriC 部位出现 11 次，oriC 还有 4 个 DnaA 结合位点，是 4 个 9bp 序列的反向重复，这些序列都 是高度保守的（图 12-10。） DnaA 先结合至复制起始点，然后发动了复杂的变化。DnaB 和 DnaC 亦参加进去，从而 使双链解开，DNA 结合蛋白便与单链 DNA 结合。接着引物酶按碱基配对原则合成一小段的 RNA 引物，此引物的 3′-OH 可供 DNA 聚合酶Ⅲ将第一个 dNTP 加到 3′-OH 上而形成 3′， 5′磷酸二酯键。复制是从 oriC 开始，同时向两个方向进行的，称为双向复制(bi-directional replication)。 复制开始后由于 DNA 双链解开，在两股单链上进行复制。在电子显微镜下观察 DNA 复制前进部位伸展成叉状，称为复制叉(replication fork)，如图 12-12。 二、 复制的延长 在 DNA 聚合酶Ⅲ的作用下，新合成的 DNA 链不断延长。大肠杆菌的冈崎片段长度为 1 000~2 000 个核苷酸，即前导链合成 1 000~2 000 个核苷酸后，随从链便开始合成。在延长过 程中，由于拓扑异构酶的作用，避免了在复制叉前方的 DNA 打结。 三、复制的终止 在 DNA 延长阶段结束后，原核生物的 RNA 引物被 DNA 聚合酶Ⅰ切除。留下的空隙， 由 DNA 聚合酶Ⅰ进行补满，即从另一冈崎片段的 3′-OH 按 5′→3′根据碱基配对原则， 将一个个的 dNTP 补上去。最后的缺口再由 DNA 连接酶将相邻的两个核苷酸借磷酸二酯键 连起来，即成完整的一条新链，DNA 的复制即告完成，如图 12-15
四、真核生物端粒DNA的复制 真核生物线性染色体的两个末端称为端粒( (telomere)。按上述DNA复制机制新合成子链 5′端的那段RNA引物被切除后,必留下一个空缺,假如每次细胞分裂或DNA复制都是如 此,端粒将会不断缩短,最终导致关键基因的丧失及种系灭绝的危险,但事实并非如此。那 么真核生物一定存在着某种阻止端粒缩短的机制。 (一)端粒DNA的结构和端粒藤 对端粒DNA序列的分析,发现端粒DNA的3′端是由数百个串联重复GT丰富的短的 寡核苷酸序列,如四膜虫的重复序列为- GGGGTI-,人为- AGGGTT-。端粒DNA序列虽不含 功能基因,但对维持染色体的稳定性起着重要作用。如果端粒丧失,染色体之间可能出现端 -端融合、降解、重排乃至染色体丢失等变化,最后细胞衰亡。 近年来,发现了一种能防止端粒缩短的酶,称为端粒酶( telomerase),该酶由蛋白质和RNA 两部分组成,其中RNA作为合成端粒DNA的模板,端粒酶是目前所知唯一携带RNA模板 的逆转录酶,具有种属特异性,例如四膜虫的端粒酶,其RNA部分含159个核苷酸,其中 有一段序列为5′ CAACCCCAA-3′可作为合成端粒DNA3′端GT丰富序列- GGGGTI模 板。人端粒酶的RNA含450个碱基,其中 CUAACCCUAAO-为合成- AGGI-的模板。这 样可防止细胞分裂时DNA复制端粒的缩短。 端粒、端粒酶和细胞的衰老有密切关系。有人将端粒称为分子钟或有丝分裂钟。但是恶 性肿瘤细胞当端粒缩短到某种程度,端粒酶活性又重新出现,对端粒进行补偿,使之永不衰 亡,形成恶性增殖。 (二)端粒酶的作用机制 第四节DNA的损伤与修复 DNA是储存遗传信息的物质。从生物遗传角度来讲,要求在复制过程中保持遗传密码的 稳定性,物种才能得以延续。哺乳动物单倍体细胞的基因组由29X10° bp dnA组成。动物 生中,从受精卵细胞到个体死亡,这些遗传密码要经过千万次的复制。在物种进化的长河中 DNA复制的次数更是难以计数,而且生物体内外环境都存在着使DNA损伤( dnA damage) 的因素。可见,除DNA复制的高度真实性外,还要求某种修复DNA损伤的机制。每一遗传 信息都以不同拷贝储存在DNA两条互补链上。因此,若一条链有损伤,可被修复酶切除
- -7 四、真核生物端粒 DNA 的复制 真核生物线性染色体的两个末端称为端粒(telomere)。按上述 DNA 复制机制新合成子链 5′端的那段 RNA 引物被切除后，必留下一个空缺，假如每次细胞分裂或 DNA 复制都是如 此，端粒将会不断缩短，最终导致关键基因的丧失及种系灭绝的危险，但事实并非如此。那 么真核生物一定存在着某种阻止端粒缩短的机制。 (一) 端粒 DNA 的结构和端粒酶 对端粒 DNA 序列的分析，发现端粒 DNA 的 3′端是由数百个串联重复 GT 丰富的短的 寡核苷酸序列，如四膜虫的重复序列为-GGGGTT-，人为-AGGGTT-。端粒 DNA 序列虽不含 功能基因，但对维持染色体的稳定性起着重要作用。如果端粒丧失，染色体之间可能出现端 -端融合、降解、重排乃至染色体丢失等变化，最后细胞衰亡。 近年来，发现了一种能防止端粒缩短的酶，称为端粒酶(telomerase)，该酶由蛋白质和 RNA 两部分组成，其中 RNA 作为合成端粒 DNA 的模板，端粒酶是目前所知唯一携带 RNA 模板 的逆转录酶，具有种属特异性，例如四膜虫的端粒酶，其 RNA 部分含 159 个核苷酸，其中 有一段序列为 5′-CAACCCCAA-3′可作为合成端粒 DNA3′端 GT 丰富序列-GGGGTT-模 板。人端粒酶的 RNA 含 450 个碱基，其中-CUAACCCUAAC-为合成-AGGGTT-的模板。这 样可防止细胞分裂时 DNA 复制端粒的缩短。 端粒、端粒酶和细胞的衰老有密切关系。有人将端粒称为分子钟或有丝分裂钟。但是恶 性肿瘤细胞当端粒缩短到某种程度，端粒酶活性又重新出现，对端粒进行补偿，使之永不衰 亡，形成恶性增殖。 (二) 端粒酶的作用机制 第四节 DNA 的损伤与修复 DNA 是储存遗传信息的物质。从生物遗传角度来讲，要求在复制过程中保持遗传密码的 稳定性，物种才能得以延续。哺乳动物单倍体细胞的基因组由 2.9X109 bp DNA 组成。动物一 生中，从受精卵细胞到个体死亡，这些遗传密码要经过千万次的复制。在物种进化的长河中， DNA 复制的次数更是难以计数，而且生物体内外环境都存在着使 DNA 损伤（DNA damage） 的因素。可见，除 DNA 复制的高度真实性外，还要求某种修复 DNA 损伤的机制。每一遗传 信息都以不同拷贝储存在 DNA 两条互补链上。因此，若一条链有损伤，可被修复酶切除