液1ml定容至100ml（含磷量为10ug/ml）为稀释液。定磷试剂：3mol/L硫酸：水：2.5%钼酸铵：10%VitC=l：2：1：1（V/V），配制时按上述顺序加试剂。溶液临用时配制（注：正常颜色显浅黄色，如呈现棕黄色或深绿色，则不能使用）。四、操作步骤1、制备匀浆：称取新鲜猪肝约5克置于研钵内，加入等量冰冷的0.9%NaCI溶液，及时剪碎，研磨成匀浆。或将新鲜猪肝与等量冰冷的0.9%NaCI溶液一同置于均质机中，均质后获得匀浆。2、抽提：将肝匀浆5ml置于离心管内，立即加入8%三氯乙酸5ml，用玻璃棒搅匀，离心一→取沉淀，加入95%乙醇5ml一→玻璃棒搅匀，用带长玻璃管的棉塞塞紧离心管口一→沸水浴2min→冷却，离心5min一→取沉淀，加入10%NaCl溶液4ml，再加入氨水，调pH4-5→沸水浴中加热8min，冷却，离心一取上清液，逐滴加入等量95%乙醇，出现白色沉淀，静置10min，离心一→取白色核酸钠沉淀。3、标准曲线的制定：取12支洗净烘干的试管，按下表加标准磷溶液和水及定磷试剂，两份平行。将试管内溶液立即混匀，于45C恒温水浴内保温25min，取出冷却至室温，于660nm处测定光密度。取两管平均值，以标准磷含量（μg）为横坐标，光密度为纵坐标，绘制定磷标准曲线。124试剂35600.20.40.60.81.0标准磷溶液（ml）32.22.82.62.42.0H20 (ml)3333定磷试剂（ml）3345℃C恒温水浴保温25minA6604、测定总磷量：4.1配制RNA样品溶液：精确称取已恒重的RNA200mg左右，以0.05-0.5mol/LNaOH溶液湿透，用玻璃棒研磨至似浆糊状的浊液，用重蒸馏水定容至100ml，配制得溶液含RNA约为2000μg/mL。4.2样品的消化、总磷量和回收率测定：取5支凯氏烧瓶，按下表操作，定
液 1ml 定容至 100ml（含磷量为 10μg/ml）为稀释液。 定磷试剂：3mol/L 硫酸：水：2.5%钼酸铵：10%VitC=1：2：1：1（V/V）， 配制时按上述顺序加试剂。溶液临用时配制(注：正常颜色显浅黄色，如呈现棕 黄色或深绿色，则不能使用)。 四、操作步骤 1、制备匀浆：称取新鲜猪肝约 5 克置于研钵内，加入等量冰冷的 0.9% NaCl 溶 液，及时剪碎，研磨成匀浆。或将新鲜猪肝与等量冰冷的 0.9% NaCl 溶液一同置 于均质机中，均质后获得匀浆。 2、抽提：将肝匀浆 5 ml 置于离心管内，立即加入 8%三氯乙酸 5 ml，用玻璃棒 搅匀，离心→取沉淀，加入 95％乙醇 5 ml→玻璃棒搅匀，用带长玻璃管的棉塞 塞紧离心管口→沸水浴 2 min→冷却，离心 5 min→取沉淀，加入 10％NaCl 溶液 4 ml，再加入氨水，调 pH 4-5→沸水浴中加热 8 min，冷却，离心→取上清液， 逐滴加入等量 95％乙醇，出现白色沉淀，静置 10 min，离心→取白色核酸钠沉 淀。 3、标准曲线的制定： 取 12 支洗净烘干的试管，按下表加标准磷溶液和水及定磷试剂，两份平行。 将试管内溶液立即混匀，于 45℃恒温水浴内保温 25min，取出冷却至室温，于 660 nm 处测定光密度。取两管平均值，以标准磷含量（μg）为横坐标，光密度 为纵坐标，绘制定磷标准曲线。 试剂 1 2 3 4 5 6 标准磷溶液（ml） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 H2O（ml） 3 2.8 2.6 2.4 2.2 2.0 定磷试剂（ml） 3 3 3 3 3 3 45℃恒温水浴保温 25min A660 4、测定总磷量： 4.1 配制 RNA 样品溶液：精确称取已恒重的 RNA 200mg 左右，以 0.05-0.5mol/L NaOH 溶液湿透，用玻璃棒研磨至似浆糊状的浊液，用重蒸馏水定 容至 100ml，配制得溶液含 RNA 约为 2000μg/mL。 4.2 样品的消化、总磷量和回收率测定：取 5 支凯氏烧瓶，按下表操作，定
容至50ml后，取5支试管继续操作。0134试剂、处理1RNA(ml).-1标准磷原液（ml)---猪肝核酸提取物x---00H20(ml)1-22225mol/LH2SO4 (ml)溶液呈黄褐色，冷却168-200℃消化60min，222230%过氧化氢（滴）168-200℃C继续消化至溶液透明，冷却沸水浴中加热10min（分解焦磷酸），冷却505050用水定容（ml)503333取定容液（ml)0蒸馏水（ml）---3333定磷试剂（ml)45℃C水浴中保温25min，冷至室温，测定A660A660计算总磷量（μg）注：样品管（1，2）和标准管（3，4）均以0管为空白对照。按测得样品的光吸收值从纵坐标曲线上查出磷的ug数，再乘以稀倍数即得样品的总磷量（以每ml溶液中磷的ug数计算较为方便）。照同样的方法可求得标准原液中磷的ug数。再除以原液中磷的ug数，即得回收率。总磷量除以回收率就是样品中实际总磷量。5、无机磷的测定取4支离心管编号，按下表操作。由标准曲线查出无机磷的g数，再乘以稀释倍数，即得样品的无机磷量。RNA样品总磷量（μg/ml）=（样品管中查出的磷量/3）×50-回收率表、无机磷的测定123试剂、处理X猪肝核酸2RNA/ml2H20 /ml444沉淀剂/ml
容至 50ml 后，取 5 支试管继续操作。 试剂、处理 0 1 3 4 RNA(ml) - 1 - - 标准磷原液（ml） - - 1 - 猪肝核酸提取物 - - - x H2O(ml) 1 - 0 0 5mol/L H2SO4 (ml) 2 2 2 2 168-200℃消化 60min，溶液呈黄褐色，冷却 30%过氧化氢（滴） 2 2 2 2 168-200℃继续消化至溶液透明，冷却 沸水浴中加热 10min（分解焦磷酸），冷却 用水定容（ml） 50 50 50 50 取定容液（ml） 3 3 3 3 蒸馏水（ml） - - - 0 定磷试剂（ml） 3 3 3 3 45℃水浴中保温 25min，冷至室温，测定 A660 A660 计算总磷量（μg） 注：样品管（1，2）和标准管（3，4）均以 0 管为空白对照。 按测得样品的光吸收值从纵坐标曲线上查出磷的μg数,再乘以稀倍数即得样 品的总磷量（以每 ml 溶液中磷的 μg 数计算较为方便）。照同样的方法可求得标 准原液中磷的 μg 数。再除以原液中磷的 μg 数，即得回收率。总磷量除以回收率 就是样品中实际总磷量。 5、无机磷的测定 取 4 支离心管编号，按下表操作。 由标准曲线查出无机磷的 μg 数，再乘以稀释倍数，即得样品的无机磷量。 RNA 样品总磷量（μg/ml）= （样品管中查出的磷量/3）×50÷回收率 表、无机磷的测定 试剂、处理 1 2 3 猪肝核酸 X RNA /ml —— 2 H2O /ml 2 —— —— 沉淀剂 /ml 4 4 4