以英文版教案为主，中文版教案为辅考马斯亮蓝法测定蛋白质含量一、实验目的熟练掌握考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的方法。二、实验原理在酸性溶液中考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合，最大吸收峰从465nm移至595nm，利用这个原理可定量的测定微量蛋白质的浓度。考马斯亮兰G-250+蛋白质—H+→染料一蛋白质复合物最大吸收波长从（元max465nm）转变为（元max595nm）三、实验器材和试剂1、主要器材722s可见分光光度计2、试剂：标准牛血清白蛋白溶液：配制成0.1mg/ml的溶液未知浓度蛋白质溶液染料溶液：称取0.1g考马斯亮蓝G—250溶于50ml95%乙醇中，再加浓磷酸100ml，然后用水稀释至1000ml，摇匀备用。此溶液需过滤方可使用。四、操作步骤1、制作标准曲线未知管号012345样品0.2标准蛋白质溶液（ml）o0.40.60.81.01.00蒸馏水（ml)1.00.80.60.40.20染料溶液（ml）5.05.05.05.05.05.05.0O.D.595nm按表分别向各支试管内加入各种试剂，充分混匀，5min后在595mn处以0号管调零点，测定各管光密度值（OD）。以光密度为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标绘制标准曲线。2、样品测定取1ml未知浓度蛋白质溶液（约含25-250ug蛋白质），加入染料溶液5ml
以英文版教案为主，中文版教案为辅 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量 一、实验目的 熟练掌握考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的方法。 二、实验原理 在酸性溶液中考马斯亮蓝 G-250 与蛋白质结合，最大吸收峰从 465nm 移至 595nm,利用这个原理可定量的测定微量蛋白质的浓度。 考马斯亮兰 G-250 + 蛋白质 ⎯⎯H +→ 染料－蛋白质 复合物 最大吸收波长从（ max 465nm ）转变为（ max595nm ） 三、实验器材和试剂 1、主要器材 722s 可见分光光度计 2、试剂： 标准牛血清白蛋白溶液：配制成 0.1mg/ml 的溶液 未知浓度蛋白质溶液 染料溶液：称取 0.1g 考马斯亮蓝 G—250 溶于 50ml95%乙醇中，再加浓磷酸 100ml，然后用水稀释至 1000ml，摇匀备用。此溶液需过滤方可使用。 四、操作步骤 1、制作标准曲线 管 号 0 1 2 3 4 5 未知 样品 标准蛋白质溶液（ml） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.0 蒸馏水（ml） 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 染料溶液（ml） 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 O.D.595nm 按表分别向各支试管内加入各种试剂，充分混匀，5min 后在 595mn 处以 0 号管调零点，测定各管光密度值（OD）。以光密度为纵坐标，蛋白质浓度为横坐 标绘制标准曲线。 2、样品测定 取 1ml 未知浓度蛋白质溶液（约含 25-250μg 蛋白质），加入染料溶液 5ml
混匀，5min后测其595nm的光密度值，对照标准曲线求得其蛋白质浓度。实验注意事项1、考马斯亮蓝G-250染料溶解性较差，因此在染液配制的过程中，需要过滤。2、如果需要精确测定，就必须在试剂加入后5-20min内测定光吸收值。这段时间内颜色最稳定。3、测定过程中，蛋白-染料复合物有少量吸附于比色杯壁上，实验证明此复合物的吸附量可以忽略。测定完成后，可以用乙醇将比色杯洗干净。4、本法操作简单，反应时间短，染料一蛋白质颜色稳定，抗干扰性强。缺点是：对于测定那些与标准蛋白质氨基酸组成有较大差异的蛋白质有一定误差。该法适合测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。思考题1、简述蛋白质定量测定的各种方法？2、简述双缩腺法和染料法测定蛋白质含量的特点？3、根据下列所给的条件和要求，选择蛋白质定量测定的方法：a：样品不易溶解，但要求结果比较精确b：要求在短时间内测定60个样品C：要求和迅速的测定一系列样品中的蛋白质含量
混匀，5min 后测其 595nm 的光密度值，对照标准曲线求得其蛋白质浓度。 实验注意事项 1、考马斯亮蓝 G-250 染料溶解性较差，因此在染液配制的过程中，需要过滤。 2、如果需要精确测定，就必须在试剂加入后 5-20min 内测定光吸收值。这段时 间内颜色最稳定。 3、测定过程中，蛋白-染料复合物有少量吸附于比色杯壁上，实验证明此复合物 的吸附量可以忽略。测定完成后，可以用乙醇将比色杯洗干净。 4、本法操作简单，反应时间短，染料—蛋白质颜色稳定，抗干扰性强。缺点是： 对于测定那些与标准蛋白质氨基酸组成有较大差异的蛋白质有一定误差。该法适 合测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。 思考题 1、简述蛋白质定量测定的各种方法？ 2、简述双缩脲法和染料法测定蛋白质含量的特点？ 3、根据下列所给的条件和要求，选择蛋白质定量测定的方法： a：样品不易溶解，但要求结果比较精确 b：要求在短时间内测定 60 个样品 c：要求和迅速的测定一系列样品中的蛋白质含量
BiochemLab2Extractionandquantificationof nucleicacidsfromanimaltissue(swineliver)AimTo extractand partially-purifynucleic acids fromanimaltissue.PrincipleDNA,in animal tissue, forms nucleoprotein.Nucleoprotein canbe precipitated bytrichloroaceticacid (TCA),and theattached lipids removed byhot ethanol.Nucleic acid then dissolved fromnucleoprotein by1o % sodium chloride(NaCl).Finally,sodium nucleic acid precipitated byethanol.ReagentsPhosphorstockstandardsolution(1mgP/mL):Dissolve0.2195gpotassiumdihydrogenphosphate(KH2POa)in50mLdistilledwater (DW).Pleasepreparethissolutionwithvolumetric flask.2.Phosphor working standard solution (PWS,1Oμg P/ml):dilution 1mLphosphor stockstandard solution to100 mL with DW.Please prepare this solution with volumetric flask.3Phosphor reagents (PR): 3mol/L sulphuric acid : DW : 2.5%(NH4)2MoO4: 10%VitC=1:2:1:1(V/V).Fresh prepared.The colorof PR should be light-yellow.Dark-yellow or dark-green PRshould be discarded.Procedures1.Freshswine livetissuehomogenized withequal volumeofcold 0.9%NaClsolution.2.5.0mLhomogeneoustissuewith5.0mL8%TCA,vortexfor30sec.aCentrifugeat 5000RPMfor5min,collect theprecipitate.APrecipitatedissolvedwith5.0mL95%ethanol,vortex for30 sec,capped withPasteurpipet(glass dropper)cottoncap,boiling waterbathfor2min,centrifugeaftercooling,collecttheprecipitate
Biochem Lab 2 Extraction and quantification of nucleic acids from animal tissue (swine liver) Aim To extract and partially-purify nucleic acids from animal tissue. Principle DNA, in animal tissue, forms nucleoprotein. Nucleoprotein can be precipitated by trichloroacetic acid (TCA), and the attached lipids removed by hot ethanol. Nucleic acid then dissolved from nucleoprotein by 10 % sodium chloride (NaCl). Finally, sodium nucleic acid precipitated by ethanol. Reagents 1. Phosphor stock standard solution (1 mg P/mL): Dissolve0.2195 g potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) in 50 mL distilled water (DW). Please prepare this solution with volumetric flask. 2. Phosphor working standard solution (PWS, 10μg P/ml): dilution 1 mL phosphor stock standard solution to 100 mL with DW. Please prepare this solution with volumetric flask. 3. Phosphor reagents (PR): 3mol/L sulphuric acid : DW : 2.5%(NH4)2MoO4: 10%VitC=1:2:1:1 (V/V). Fresh prepared. The colorof PR should be light-yellow. Dark-yellow or dark-green PR should be discarded. Procedures 1. Fresh swine live tissue homogenized with equal volume of cold 0.9% NaCl solution. 2. 5.0 mL homogeneous tissue with 5.0 mL 8 % TCA, vortex for 30 sec. 3. Centrifuge at 5000 RPM for 5 min, collect the precipitate. 4. Precipitate dissolved with 5.0 mL 95 % ethanol, vortex for 30 sec, capped with Pasteur pipet(glass dropper) cotton cap, boiling water bath for 2 min, centrifuge after cooling, collect the precipitate
5.4mL 10% NaCl solution added to the precipitate, vortex, adjust pH to 4-5 with drops ofammonium hydroxide(NH3 H,O), boiling water bath for 2 min, centrifuge after cooling,collect the supernatant.6.Dropwise toaddequal volumeof95% ethanol, set for10minafter cotton-like precipitateformed, centrifugeandcollecttheprecipitate.Pre-Lab Questions1.Theprincipleandoperationprotocolofcentrifugation.2.Whatkinds of ingredients were removed during theextraction procedures?And how?
5. 4mL 10% NaCl solution added to the precipitate, vortex, adjust pH to 4-5 with drops of ammonium hydroxide(NH3·H2O), boiling water bath for 2 min, centrifuge after cooling, collect the supernatant. 6. Dropwise to add equal volume of 95 % ethanol, set for 10 min after cotton-like precipitate formed, centrifuge and collect the precipitate. Pre-Lab Questions 1. The principle and operation protocol of centrifugation. 2. What kinds of ingredients were removed during the extraction procedures? And how?
以英文版教案为主，中文版教案为辅动物组织中核酸的制备与含量测定一、实验目的1.了解并掌握核酸的提取制备的原理和方法2.掌握利用核酸定磷法测定核酸含量的方法二、实验原理动物组织细胞中的核糖核酸（DNA）大部分与蛋白质结合形成核蛋白。可用三氯乙酸沉淀出核蛋白，并用95%乙醇加热除去附着在沉淀上的脂类物质，然后用10%氯化钠从核蛋白中分离出核酸（钠盐形式），此核酸钠盐，加入乙醇可以被沉淀析出。在酸性环境中，定磷试剂中的钼酸铵以钼酸形式与样品中的磷酸反应生成磷钼酸，当有还原剂存在时磷钼酸立即转变成蓝色还原产物一钼蓝。还原剂> HsP(Mo:010)4+12 H0HPO4+12H2MoO4钼蓝Amax650-660nm钼蓝最大的光吸收在波长处。当使用抗坏血酸为还原剂时，测定的最适范围为1-10μg无机磷。测定样品核酸的总量，需先将它用硫酸或高氯酸消化成无机磷再进行测定。总磷量减去未消化样品中测得的无机磷量，即得核酸含磷量，由此可计算出核酸含量。三、器材与试剂1、器材：均质机、离心机、水浴锅、分析天平、离心机、恒温水浴锅、200℃C烘箱、硬质玻璃试管、722S分光光度计等2、主要试剂：新鲜猪肝0.9%NaCl、8%三氯醋酸、95%乙醇、浓氨水（必要时稀释）、10%NaCl、5mol/LH2SO04、30%H2O2标准磷溶液：将磷酸二氢钾（KH2PO4）预先于105C烘至恒重，然后放在干燥器内使温度降至室温。精确称取0.2195克（含磷50mg），用重蒸馏水溶解，定容至50ml（含磷量为1mg/ml）作为原液，冰箱贮藏，备用。测定时取出贮藏
以英文版教案为主，中文版教案为辅 动物组织中核酸的制备与含量测定 一、实验目的 1.了解并掌握核酸的提取制备的原理和方法 2.掌握利用核酸定磷法测定核酸含量的方法 二、实验原理 动物组织细胞中的核糖核酸（DNA）大部分与蛋白质结合形成核蛋白。可 用三氯乙酸沉淀出核蛋白，并用 95%乙醇加热除去附着在沉淀上的脂类物质，然 后用 10%氯化钠从核蛋白中分离出核酸（钠盐形式），此核酸钠盐，加入乙醇可 以被沉淀析出。 在酸性环境中，定磷试剂中的钼酸铵以钼酸形式与样品中的磷酸反应生成磷 钼酸，当有还原剂存在时磷钼酸立即转变成蓝色还原产物—钼蓝。 H3PO4 + 12 H2MoO4 ⎯还原剂 ⎯⎯→ H3P(MO3O10)4 + 12 H2O 钼蓝 Amax 650-660nm 钼蓝最大的光吸收在波长处。当使用抗坏血酸为还原剂时，测定的最适范围 为 1-10μg 无机磷。 测定样品核酸的总量，需先将它用硫酸或高氯酸消化成无机磷再进行测定。 总磷量减去未消化样品中测得的无机磷量，即得核酸含磷量，由此可计算出核酸 含量。 三、器材与试剂 1、器材：均质机、离心机、水浴锅、分析天平、离心机、恒温水浴锅、200℃烘 箱、硬质玻璃试管、722S 分光光度计等 2、主要试剂： 新鲜猪肝 0.9%NaCl、8%三氯醋酸、95%乙醇、浓氨水（必要时稀释）、10% NaCl、5mol/L H2SO4、30%H2O2 标准磷溶液：将磷酸二氢钾（KH2PO4）预先于 105℃烘至恒重，然后放在 干燥器内使温度降至室温。精确称取 0.2195 克（含磷 50mg），用重蒸馏水溶解， 定容至 50ml（含磷量为 1mg/ml）作为原液，冰箱贮藏，备用。测定时取出贮藏