称为互补( Complementary)DNA或cDNA 随着DNA合成技术的发展,目标基因也可以根据所需蛋白质的氨基酸序列完全用化学 方法合成,即使人工合成基因的核苷酸序列与天然基因不完全一致,但是它们编码得到的蛋 白质却是完全一样的。全化学合成基因的一个重要应用领域是蛋白质工程,用于对天然蛋白 质的结构进行改性和修饰,也可以用于生产完全人工设计的蛋白质。应用蛋白质工程生产的 蛋白质将具有天然蛋白质所没有的性质,如良好的稳定性、更好的专一性和催化效率及新的 催化能力等。 11.3.2载体DNA 分离得到了目标基因后,基因重组的第二步就是把目标基因装配到载体DNA,质粒就是 一种典型的载体。载体的定义是:在细胞群体中为目标基因片段提供增殖场所的DNA分子 载体应该具有以下性质 1)在宿主细胞中具有自我复制的能力 2)能够与各种分子量的外来DNA片段结合而又不会影响本身的复制能力 3)载体DNA经过细胞外重组后仍然能够顺利进入宿主细胞 4)载体DNA应该含有至少一个选择性标记,这样可以迅速而又可靠地筛选出含有载体DNA 的细胞; 5)对于一种或几种限制性内切酶,载体DNA上只有一个目标切点 表11.3.1常用的质粒及其性质 质粒名称 分子量拷贝数|自我转移能力「表型特征 (10°da)染色体 Col质ColE1 10-18 不能大肠杆菌EI(膜的变化) Col e2 10-18 不能 [大肠杆菌EII(Dase) ColE 10-18 不能 大肠杆菌EIII(核糖体 RNase) 性质粒|F 1-2 Flac R质粒[R1o0 70 能能能 F性须( f pilus) F性须,Lac操纵子 Cml, str, sul, tet Tet, st PSC101 粒[229的20不能高贝数 pBR345[0.7 约20不能 Colel改型 除质粒外,噬菌体λ、噬菌体M3及粘粒( Cosmids或称为装配型质粒)也能用于Ecol 的基因重组。噬菌粒载体是有M13噬菌体和质粒结合而成的新型载体,它克服了M3噬菌体 克隆外源DNA的能力十分有限(小于1,500bp)的缺点,而且分子量小,易于体外操作 些基因工程常用的质粒和噬菌体列于表11.3.1和表11.3.2。下面将以重组 E. coli为例介 绍质粒的结构。 质粒的分子量以小一些为宜。小分子量的质粒有利于操作,克隆了外源DNA片段(一般 不会超过15kb)后仍可有效地转化到宿主细胞。小分子量的质粒一般具有较高的拷贝数 而且降低了限制性内切酶具有多重识别位点的机率 质粒可以通过转化进入E.col,一个被转化的E.coli细胞只能接受一个质粒,而我 们需要的是含有大量相同质粒的细胞,这样就能利用大量的目标基因合成蛋白质。因此质粒 必须能够在生长中的E.coli细胞中增殖。为此在质粒的设计中必须插入一个含有大约 6
6 称为互补（Complementary）DNA 或 cDNA。 随着 DNA 合成技术的发展，目标基因也可以根据所需蛋白质的氨基酸序列完全用化学 方法合成, 即使人工合成基因的核苷酸序列与天然基因不完全一致，但是它们编码得到的蛋 白质却是完全一样的。全化学合成基因的一个重要应用领域是蛋白质工程，用于对天然蛋白 质的结构进行改性和修饰，也可以用于生产完全人工设计的蛋白质。应用蛋白质工程生产的 蛋白质将具有天然蛋白质所没有的性质，如良好的稳定性、更好的专一性和催化效率及新的 催化能力等。 11.3.2 载体 DNA 分离得到了目标基因后，基因重组的第二步就是把目标基因装配到载体 DNA，质粒就是 一种典型的载体。载体的定义是： 在细胞群体中为目标基因片段提供增殖场所的 DNA 分子。 载体应该具有以下性质： 1） 在宿主细胞中具有自我复制的能力； 2） 能够与各种分子量的外来 DNA 片段结合而又不会影响本身的复制能力； 3） 载体 DNA 经过细胞外重组后仍然能够顺利进入宿主细胞； 4） 载体 DNA 应该含有至少一个选择性标记，这样可以迅速而又可靠地筛选出含有载体 DNA 的细胞； 5） 对于一种或几种限制性内切酶，载体 DNA 上只有一个目标切点。 表 11.3.1 常用的质粒及其性质 质粒名称 分子量 (106 dal) 拷贝数 染色体 自我转移能力 表型特征 Col 质 粒 ColE1 4.2 10-18 不能 大肠杆菌 EI(膜的变化) Col E2 5.0 10-18 不能 大肠杆菌 EII(Dnase) ColE3 5.0 10-18 不能 大肠杆菌 EIII(核糖体 RNase) 性质粒 F 62 1-2 能 F 性须(F pilus) F’lac 95 1-2 能 F 性须,Lac 操纵子 R 质粒 R100 70 1-2 能 Cmlr ,Strr ,Sulr ,Tetr R64 78 少数 能 Tetr , Strr R6K 25 12 能 Ampr , Strr PSC101 5.8 1-2 不能 Tetr 重组体 质粒 pDM500 9.8 约 20 不能 黑腹果蝇组蛋白基因 pBR322 2.9 约 20 不能 高拷贝数 pBR345 0.7 约 20 不能 ColE1 改型 除质粒外，噬菌体、噬菌体 M13 及粘粒(Cosmids 或称为装配型质粒)也能用于 E.coli 的基因重组。噬菌粒载体是有 M13 噬菌体和质粒结合而成的新型载体，它克服了 M13 噬菌体 克隆外源 DNA 的能力十分有限（小于 1,500bp）的缺点，而且分子量小，易于体外操作。一 些基因工程常用的质粒和噬菌体列于表 11.3.1 和表 11.3.2。下面将以重组 E. coli 为例介 绍质粒的结构。 质粒的分子量以小一些为宜。小分子量的质粒有利于操作，克隆了外源 DNA 片段（一般 不会超过 15kb）后仍可有效地转化到宿主细胞。小分子量的质粒一般具有较高的拷贝数， 而且降低了限制性内切酶具有多重识别位点的机率。 质粒可以通过转化进入 E. coli，一个被转化的 E. coli 细胞只能接受一个质粒，而我 们需要的是含有大量相同质粒的细胞，这样就能利用大量的目标基因合成蛋白质。因此质粒 必须能够在生长中的 E. coli 细胞中增殖。为此在质粒的设计中必须插入一个含有大约
600bp长度的核苷酸片段的复制源区或称为复制起点( Origin of replication),该源区的 作用是控制细胞内质粒的复制和调节质粒的拷贝数,使胞内的质粒拷贝数保持在适当的水 平。对于E.coli而言,拷贝数在25-250的范围内比较适当。在某些情况下,会产生温度 敏感的突变株,当温度改变时会引起质粒的过量复制,使质粒拷贝数不断增加直至细胞死亡。 表11.31常用的噬菌体及其性质 噬菌体λ 载体名称 载体类型 克隆位点 克隆能力(kb)重组体的识别 插入型载体 0-10.1 NM641 插入型载体 EcoRI 0-9.7 清亮噬菌斑 Cheron 4 替换型载体 7.9-18.8 EMbL 3 替换型载体 BamHI 10.4-20.1 gtWES、1T5-622替换型载体 2.4-13.3 对Colb不敏感 入1059 BamHI 8.0-21.0 粘粒载体 「载体名称复制子分子量「选择记号 克隆位点 T克隆能力 (kb) pBI Amp, Kan BamHI, Clal,EcoRI, HindIII,32-45 PstI smal pHC79 pMBI6. Amp, Tet BamHI, Clal, EcoRl, HindIII,29-46 PstI sma l pHS262 BamHl, ecoRl. HindI olE115.8 I BamHI, EcoRI, BglII, SalI21-37 ColEl| 5.4 BamhI, hindiii. sali 1-47 MuA-10 pMBI. Tet EcoRI Ball, pyul, pvull 噬菌粒载体 菡粒质粒。单链噬菌体『辅助嗽菌体「大肠杆崮寄主菌株 pUC8 71/18 pRSAlO1 M13变异株 XS127,XS101 pUC118/pUC119 pUC18/pUC19 M13 M13KO7 MV1184 M13KO7 -l-Blue Lac:不能合成半乳糖苷酶;Bio:不能合成生物素;Spiˉ:对P噬菌粒的抑制作用呈抗性 Amp:氨苄青霉素抗性;Kan:卡那霉素抗性Tet:四环素抗性. 质粒中必须含有选择性标记。最常用的是含有抗生素抗性标记,这样只要将基因工程 细胞放到含有一定浓度抗生素的培养基中培养,就只有含质粒细胞才能生长,而无质粒的细 胞将被抗生素杀死。这种方法既能正确、快捷地筛选出含质粒细胞,加速实验室硏究的进程, 又能够在基因工程菌的大规模培养中使用。只要在培养基中加入一定浓度的抗生素就能够始 终保持只有含质粒细胞才能生长。选择性标记的另一种方法是筛选出营养缺陷型的宿主细 胞,使宿主细胞只能在添加了该细胞生长所必需的某种物质的培养基中才能生长,而在重组 的质粒中则包含产生该酶的基因,使得质粒所表达的酶能够弥补营养缺陷型宿主细胞不能合 成该种酶的缺陷,因此含质粒细胞可以在不加该酶的培养基中生长,无质粒细胞则不能 如果基因工程菌的目标产品是蛋白质,蛋白质的产量与质粒的拷贝数有关,但是两者 并不一定严格成正比关系,例如,当质粒的拷贝数从25增加到50时,蛋白质产量可能会增 加一倍,如拷贝数进一步增加到100,蛋白质的增加量就不到一倍了。有些质粒属于低拷贝 数质粒,因为在细胞分裂前质粒DNA只能复制12次,每个细胞中就只有几个质粒。有些是 松弛型质粒,质粒DNA可以重复复制只止达到适当的拷贝数,细胞内的质粒数可以达到
7 600bp 长度的核苷酸片段的复制源区或称为复制起点（Origin of replication），该源区的 作用是控制细胞内质粒的复制和调节质粒的拷贝数，使胞内的质粒拷贝数保持在适当的水 平。对于 E. coli 而言，拷贝数在 25-250 的范围内比较适当。在某些情况下，会产生温度 敏感的突变株，当温度改变时会引起质粒的过量复制，使质粒拷贝数不断增加直至细胞死亡。 表 11.3.1 常用的噬菌体及其性质 噬菌体 载体名称 载体类型 克隆位点 克隆能力(kb) 重组体的识别 BV2 插入型载体 BamHI 0-10.1 No NM641 插入型载体 EcoRI 0- 9.7 清亮噬菌斑 Cheron 4 替换型载体 EcoRI 7.9-18.8 Lac - ,Bio- EMBL 3 替换型载体 BamHI 10.4-20.1 Spi- gtWES.T5-622 替换型载体 EcoRI 2.4-13.3 对 ColIb 不敏感 1059 替换型载体 BamHI 8.0-21.0 Spi- 粘粒载体 载体名称 复制子 分子量 (kb) 选择记号 克隆位点 克隆能力 (kb) c2XB pMBI 6.8 Ampr ,Kanr BamHI,ClaI,EcoRI,HindIII, PstI,SmaI 32-45 pHC79 pMBI 6.4 Ampr ,Tetr BamHI,ClaI,EcoRI,HindIII, PstI,SmaI 29-46 pHS262 ColE1 2.8 Kanr BamHI,EcoRI,HindII 34-50 pJC74 ColE1 15.8 Ampr BamHI,EcoRI,BglII,SalI 21-37 pJB8 ColE1 5.4 Ampr BamHI,HindIII,SalI 31-47 MuA-10 pMBI 4.8 Tetr EcoRI,BalI,PvuI,PvuII 32-48 噬菌粒载体 噬菌粒 质粒 单链噬菌体 辅助噬菌体 大肠杆菌寄主菌株 pMBL8 pUC8 f1 IR1 71/18 pRSA101 VX M13 M13 变异株 XS127,XS101 pUC118/pUC119 pUC18/pUC19 M13 M13K07 MV1184 pBS pUC f1 M13K07 XL-1-Blue Lac- :不能合成半乳糖苷酶;Bio- :不能合成生物素;Spi- :对 P2 噬菌粒的抑制作用呈抗性. Amp r :氨苄青霉素抗性;Kanr :卡那霉素抗性 Tetr :四环素抗性. 质粒中必须含有选择性标记。最常用的是含有抗生素抗性标记，这样只要将基因工程 细胞放到含有一定浓度抗生素的培养基中培养，就只有含质粒细胞才能生长，而无质粒的细 胞将被抗生素杀死。这种方法既能正确、快捷地筛选出含质粒细胞，加速实验室研究的进程， 又能够在基因工程菌的大规模培养中使用。只要在培养基中加入一定浓度的抗生素就能够始 终保持只有含质粒细胞才能生长。选择性标记的另一种方法是筛选出营养缺陷型的宿主细 胞，使宿主细胞只能在添加了该细胞生长所必需的某种物质的培养基中才能生长，而在重组 的质粒中则包含产生该酶的基因，使得质粒所表达的酶能够弥补营养缺陷型宿主细胞不能合 成该种酶的缺陷，因此含质粒细胞可以在不加该酶的培养基中生长，无质粒细胞则不能。 如果基因工程菌的目标产品是蛋白质，蛋白质的产量与质粒的拷贝数有关，但是两者 并不一定严格成正比关系，例如，当质粒的拷贝数从 25 增加到 50 时，蛋白质产量可能会增 加一倍，如拷贝数进一步增加到 100，蛋白质的增加量就不到一倍了。有些质粒属于低拷贝 数质粒，因为在细胞分裂前质粒 DNA 只能复制 1-2 次，每个细胞中就只有几个质粒。有些是 松弛型质粒，质粒 DNA 可以重复复制只止达到适当的拷贝数，细胞内的质粒数可以达到