实验二人源过氧化氢酶重组克隆的构建 实验目的 ▣ 掌握目的基因与载体连接并导入宿主菌的技术方法 掌握蓝白斑筛选阳性重组克隆的原理和操作 目的基因与质粒载 将重组质粒载体 鉴定连接和转化结 体连接 转化入宿主菌 果，筛选出阳性 重组克隆
实验二 人源过氧化氢酶重组克隆的构建 实验目的 掌握目的基因与载体连接并导入宿主菌的技术方法 掌握蓝白斑筛选阳性重组克隆的原理和操作 目的基因与质粒载 体连接 将重组质粒载体 转化入宿主菌 鉴定连接和转化结 果，筛选出阳性 重组克隆
人源过氧化氢酶重组酵母工程菌的构建过程 大量复制 PMD19T-CAT CAT基因 鉴定 筛选 重组克隆质粒 转化大肠杆菌 pMD19T-CAT pMD19T (克隆载体) 用来克隆和扩增DNA片段（基因）的载体，带有松弛 的复制子，能带动外源基因在宿主细胞中复制扩增。 么 酶切下 CAT基因 使目的基因能够表达的载体，其在克隆载体基本骨架的基 础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等）。 pPICZaA (表达载体) 鉴定 线性化 88 筛选 重组表达质粒 电转化酵母 大量复制 转化大肠杆菌 pPICZaA-CAT pPICZaA-CAT
人源过氧化氢酶重组酵母工程菌的构建过程 酶切下 CAT基因 转化 大肠杆菌 电转化 酵母 转化 大肠杆菌 CAT基因 pMD19T pPICZαA 线性化 重组表达质粒 pPICZαA-CAT pMD19T-CAT 重组克隆质粒 （克隆载体） （表达载体） 用来克隆和扩增DNA片段（基因）的载体，带有松弛 的复制子，能带动外源基因在宿主细胞中复制扩增。 使目的基因能够表达的载体，其在克隆载体基本骨架的基 础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等）。 大量复制 pPICZαA-CAT 大量复制 pMD19T-CAT 鉴定 筛选 鉴定 筛选
实验材料 ▣ 目的基因DNA、T载体、感受态细胞DH5a 1DNA Ligation Kit T4 DNA Ligase) ②LB-Amp培养基平板、X-gal(5-溴-4-氯-3-吲1哚- B-D-半乳糖苷)、IPTG(异丙基硫代-B-D-半乳糖苷) ③琼脂糖、TAE、Yea-Red染料 ▣ 移夜器、EP管、Tips、细胞推棒 ▣ 水浴锅、摇床、电泳仪、电泳槽
实验材料 目的基因DNA、T载体、感受态细胞DH5α ① DNA Ligation Kit （ T4 DNA Ligase ） ② LB-Amp培养基平板、X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚- β-D-半乳糖苷)、IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷） ③ 琼脂糖、TAE、Yea-Red染料 移夜器、 EP管、Tips 、细胞推棒 水浴锅、摇床、电泳仪、电泳槽
T载体克隆连接的原理 T载体是一种高效克隆PCR产物的专用质粒载体，为线性化载体，无需 酶切可直接与具有A末端的PCR产物连接，属于非定向克隆。 大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都具有在PCR产物的3'末端添加一 个“A"的特性，而T载体在线性化平末端载体的两端分别又人工加上一个额外 的T碱基，所以可与PCR克隆产物的A末端互补配对，实现与PCR产物的高效 连接和克隆。 PCR产物 T载体
T载体克隆连接的原理 T载体是一种高效克隆 PCR 产物的专用质粒载体，为线性化载体，无需 酶切可直接与具有A末端的PCR产物连接，属于非定向克隆。 大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都具有在PCR产物的3’末端添加一 个“A”的特性，而T载体在线性化平末端载体的两端分别又人工加上一个额外 的T碱基, 所以可与PCR克隆产物的A末端互补配对，实现与PCR产物的高效 连接和克隆。 PCR 产 物 T 载体
基因工程载体的特性要求 1.具有对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性），能运送外源基因高效转入受体细胞 2.在宿主细胞内可自主地复制且不影响受体细胞正常的生命活动 3.分子量小，拷贝数多 4.具有多种单一的酶切位点或多克隆位点(multiple cloning site,MCS) 5.具有合适的选择性标记，便于筛选阳性克隆 抗生素抗性基因：Amp'上生化标记基因：acZ(B-半乳糖苷酶基因)
基因工程载体的特性要求 1. 具有对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）,能运送外源基因高效转入受体细胞 2. 在宿主细胞内可自主地复制且不影响受体细胞正常的生命活动 3. 分子量小，拷贝数多 4. 具有多种单一的酶切位点或多克隆位点(multiple cloning site，MCS) 5. 具有合适的选择性标记，便于筛选阳性克隆 抗生素抗性基因: Ampr ； 生化标记基因： lacZ（β-半乳糖苷酶基因）