实验二血红蛋白的测定 (氰化法)【原理】血红蛋白在铁氰化钾和氰化钾的作用下，生成极为稳定的氰化高铁血红蛋白（红色），其颜色深浅与血红蛋白的含量成正比。氰化高铁血红蛋白在540nm波长下，毫克分子消光系数为44，据此，用分光光度法测其光密度，运用消光系数作血红蛋白的定量测定。其化学反应式如下：血红蛋白铁鼠化钾、高铁血红蛋白 氯化钾、氰化高铁血红蛋白【仪器】1.10uI血色素吸管（或定量毛细管）。2. 5ml 或10ml带盖试管。3.721或72型分光光度计。【试剂】称取碳酸氢钠140mg、铁氰化钾200mg、氰化钾50mg，用蒸馏水溶解并稀释到1000ml。贮存于棕色试剂瓶内，在4℃冰箱保存，至少可稳定数月到一年。【操作步骤】1.吸取2.5ml试剂于5ml带盖试管中，加10u1入血液，混匀后放置15分钟2.选用0.5cm光径比色杯，于540nm波长下，以试剂调节仪器零点，测定各样品管之光密度，将所测得之光密度乘以73.6即为血红蛋白之含量（g/100ml)。计算公式如下：DNX.25164458_= Dwlx×73.6Ct=X44×0.510000C=待测之血红蛋白含量（g%）Dircx=在540mm波长下测得之氰化高铁血红蛋白之光密度251=测定时血液的稀释倍数（血10ul加入试剂2.5ml中）44=氰化高铁血红蛋白的毫克分子消光系数。0.5=比色杯光径64458=血红蛋白的分子量1000=将mg/L换算成g/100ml的数字【评价】年龄缺乏（g/100ml正常（g/100ml6月~6岁<11.0>11.06~14岁>12.0成年男子≤13.0成年女子<12.0>12.0
实验二 血红蛋白的测定（氰化法） 【原理】血红蛋白在铁氰化钾和氰化钾的作用下，生成极为稳定的氰化高铁血红蛋白（红 色），其颜色深浅与血红蛋白的含量成正比。氰化高铁血红蛋白在 540nm 波长下，毫克分子 消光系数为 44，据此，用分光光度法测其光密度，运用消光系数作血红蛋白的定量测定。 其化学反应式如下： 血红蛋白 铁氰化钾 高铁血红蛋白 氰化钾 氰化高铁血红蛋白 【仪器】 1．10μl 血色素吸管（或定量毛细管）。 2．5ml 或 10ml 带盖试管。 3．721 或 72 型分光光度计。 【试剂】称取碳酸氢钠 140mg、铁氰化钾 200mg、氰化钾 50mg，用蒸馏水溶解并稀释 到 1000ml。贮存于棕色试剂瓶内，在 4℃冰箱保存，至少可稳定数月到一年。 【操作步骤】 1．吸取 2.5ml 试剂于 5ml 带盖试管中，加 10μl 入血液，混匀后放置 15 分钟。 2．选用 0.5cm 光径比色杯，于 540nm 波长下，以试剂调节仪器零点，测定各样品管之 光密度，将所测得之光密度乘以 73.6 即为血红蛋白之含量（g/100ml）。 计算公式如下： Ct=待测之血红蛋白含量（g%） D 540 HiC N =在 540nm 波长下测得之氰化高铁血红蛋白之光密度 251=测定时血液的稀释倍数（血 10μl 加入试剂 2.5ml 中） 44=氰化高铁血红蛋白的毫克分子消光系数。 0.5=比色杯光径 64458=血红蛋白的分子量 10000=将 mg/L 换算成 g/100ml 的数字 【评价】 年 龄 缺乏（g/100ml） 正常（g/100ml） 6 月~6 岁 ＜11.0 ＞11.0 6~14 岁 ＜12.0 ＞12.0 成年男子 ＜13.0 ＞13.0 成年女子 ＜12.0 ＞12.0 Ct= = D 540 HiC N×73.6 44×0.5 10000 × D 64458 540 HiC N× 251
【附】1．本法为国际血液学标准化委员会（ICSH）所推荐，具有操作简便、不需要标准、结果准确可靠等优点。2．应用本法进行血红蛋白的测定，所用分光光度计的波长必需事先经过校正。3．实验条件改变，如更换了光电池或灯炮、电压不稳、试剂换了批号等等均会引起光密度的改变。为了获得正确结果，可用标准液校正或采用色泽近似的无机盐人工永久标准液来核对，这也是一种行之有效的方法。4．如以上二点难以实现，宜采用标准曲线法或直接比较法进行。5．血样放入试剂后所形成的氰化高铁血红蛋白极为稳定，经试验，在4℃冰箱存放70天之久前后结果仍能保持一致。为此，可将各地采集的样品在加入到试剂后，在2~10℃环境中，集中到中心实验室进行比色测定。6.有材料证实，取血部位对测定结果有明显影响。耳垂血的血红蛋白含水量量高于指尖血。7．血色素吸管必须保持洁净与干燥，每做一份后应用水洗净后，用无水乙醇洗，最后用乙醚洗。否则取量不准，影响结果
【附】 1．本法为国际血液学标准化委员会（ICSH）所推荐，具有操作简便、不需要标准、结 果准确可靠等优点。 2．应用本法进行血红蛋白的测定，所用分光光度计的波长必需事先经过校正。 3．实验条件改变，如更换了光电池或灯炮、电压不稳、试剂换了批号等等均会引起光 密度的改变。为了获得正确结果，可用标准液校正或采用色泽近似的无机盐人工永久标准液 来核对，这也是一种行之有效的方法。 4．如以上二点难以实现，宜采用标准曲线法或直接比较法进行。 5．血样放入试剂后所形成的氰化高铁血红蛋白极为稳定，经试验，在 4℃冰箱存放 70 天之久前后结果仍能保持一致。为此，可将各地采集的样品在加入到试剂后，在 2~10℃环 境中，集中到中心实验室进行比色测定。 6．有材料证实，取血部位对测定结果有明显影响。耳垂血的血红蛋白含水量量高于指 尖血。 7．血色素吸管必须保持洁净与干燥，每做一份后应用水洗净后，用无水乙醇洗，最后 用乙醚洗。否则取量不准，影响结果
实验三尿中还原型抗坏血酸测定【原理】抗坏血酸（维生素C）具有一C-C一基，有还原性。还原型抗坏血酸能还bHOH原染料2，6-二氯酚靛酚，该染料在酸性溶液中呈红色，被还原后红色失去。还原型抗坏血酸还原染料后，本身被氧化成脱氢型抗坏血酸。一定量的尿样一二氯酚靛酚被抗坏血酸还原的反应如下：抗坏血酸、2，6-二氯二对酚胺2，6-二氟酚靛酚（酸液中呈粉红色）（还原）（无色）【仪器】1.微量滴定管（1ml或2ml)。2.50ml三角瓶。【试剂】1．1%草酸溶液：称取草酸10g，以去离子水溶解并稀释到1000ml。。0.02%2，6-二氯酚靛酚溶液：溶解2，6-二氯酚靛酚50mg于含有52mg碳酸氢钠的200ml热水中，冷却后稀释到250ml，过滤后装在棕色瓶内，储存冰箱中，每星期至少标定一次。标定方法如下：取5ml标准抗坏血酸溶液，加1%草酸5ml，用上液滴定之。至粉红色能存在 15秒钟为终点。所用上液的体积相当于0.1mg抗坏血酸。由此求出每毫升溶液相当于抗坏血酸多少毫克.标准抗坏血酸溶液（20μg/ml）：溶解20mg抗坏血酸结晶于1%草酸中，稀释到100ml，再取其中5ml稀释到50ml，取出5ml迅速用染料标定。【操作方法】1.用吸管吸取尿液2~5ml，放入50ml三角瓶内，加1%草酸5ml。2.立即用标定过的2，6-二氯酚靛酚染料溶液滴定之，直至淡粉红色能存在15秒钟为止。记录染料的用量。【计算】尿中还原型抗坏血酸排出量（mg）=染料用量×每 ml 染料相当于抗坏血酸 mg 数X总尿量滴定时尿液用量【评价】不足正常充裕成人负荷尿4小时<3mg3~10mg>10mg（口服500mg抗坏血酸）
实验三 尿中还原型抗坏血酸测定 【原理】抗坏血酸（维生素 C）具有—C= C—基，有还原性。还原型抗坏血酸能还 OHOH 原染料 2，6-二氯酚靛酚，该染料在酸性溶液中呈红色，被还原后红色失去。还原型抗坏血 酸还原染料后，本身被氧化成脱氢型抗坏血酸。一定量的尿样二氯酚靛酚被抗坏血酸还原的 反应如下： 2，6-二氯酚靛酚 抗坏血酸 2，6-二氯二对酚胺 （酸液中呈粉红色） （还原） （无色） 【仪器】 1．微量滴定管（1ml 或 2ml）。 2．50ml 三角瓶。 【试剂】 1．1%草酸溶液：称取草酸 10g，以去离子水溶解并稀释到 1000ml。 2．0．02% 2，6-二氯酚靛酚溶液：溶解 2，6-二氯酚靛酚 50mg 于含有 52mg 碳酸氢钠 的 200ml 热水中，冷却后稀释到 250ml，过滤后装在棕色瓶内，储存冰箱中，每星期至少标 定一次。标定方法如下：取 5ml 标准抗坏血酸溶液，加 1%草酸 5ml，用上液滴定之。至粉 红色能存在 15 秒钟为终点。所用上液的体积相当于 0.1mg 抗坏血酸。由此求出每毫升溶液 相当于抗坏血酸多少毫克。 3．标准抗坏血酸溶液（20μg/ml）：溶解 20mg 抗坏血酸结晶于 1%草酸中，稀释到 100ml， 再取其中 5ml 稀释到 50ml，取出 5ml 迅速用染料标定。 【操作方法】 1．用吸管吸取尿液 2～5ml，放入 50ml 三角瓶内，加 1%草酸 5ml。 2．立即用标定过的 2，6-二氯酚靛酚染料溶液滴定之，直至淡粉红色能存在 15 秒钟为 止。记录染料的用量。 【计算】 尿中还原型抗坏血酸排出量（mg）＝ 染料用量×每 ml 染料相当于抗坏血酸 mg 数 滴定时尿液用量 ×总尿量 【评价】 不足 正常 充裕 成人负荷尿 4 小时 ＜3mg 3~10mg ＞10mg （口服 500mg 抗坏血酸）