杂交动力学 杂交过程的第一步是两条核酸单链随机碰撞形成局 部双链,如果此局部双链周围的碱基不配对则会重新 解离,继续碰撞,一且找到正确的互补区,两侧的序 列迅速配对形成完整的双链分子,后一步反应是一个 自发过程。 影响因素主要有 (1)探针浓度、长度和复杂性 探针浓度越高,复性速度越快。 探针越长,扩散速度越慢,复杂性越高,配对难度越 大
二、杂交动力学 杂交过程的第一步是两条核酸单链随机碰撞形成局 部双链，如果此局部双链周围的碱基不配对则会重新 解离，继续碰撞，一旦找到正确的互补区，两侧的序 列迅速配对形成完整的双链分子，后一步反应是一个 自发过程。 影响因素主要有： (1) 探针浓度、长度和复杂性 探针浓度越高，复性速度越快。 探针越长，扩散速度越慢，复杂性越高，配对难度越 大
(2)离子强度 高离子强度溶液中,其正离子可中和DNA链磷酸 基团的负电荷,消除其间的静电斥力,有利于杂交分 子的形成。 (3)温度 通常杂交温度在低于Tm20-25℃温度下进行。不 含变性剂甲酰胺时,大多数杂交反应在68℃进行。当 含50%甲酰胺时,在42℃进行。 寡核苷酸探针“般在低于T值5℃-10℃下进行 4)杂交促进剂 用硫酸葡聚糖,其微粒的表面可以吸附DNA探针 分子,使接触面积增大,有利于杂交反应
(2) 离子强度 高离子强度溶液中，其正离子可中和DNA链磷酸 基团的负电荷，消除其间的静电斥力，有利于杂交分 子的形成。 (3) 温度 通常杂交温度在低于Tm 20~25℃温度下进行。不 含变性剂甲酰胺时，大多数杂交反应在68℃进行。当 含50%甲酰胺时，在42℃进行。 寡核苷酸探针一般在低于Tm值5℃~10℃下进行。 (4) 杂交促进剂 用硫酸葡聚糖，其微粒的表面可以吸附DNA探针 分子，使接触面积增大，有利于杂交反应
(5)杂交条件的严谨性 所谓严谨性 ( stringency,是指杂交反应体系, 避免非同源性或部分同源性的核酸序列形成杂交复 合物的严格程度。反应温度升高,离子强度降低, 会增加反应的严谨性,适用于匹配好的或序列完全 同源的核酸的杂交反应,或用于检测点突变;反之, 则适用于匹配差或序列不完全同源的核酸杂交反应
(5) 杂交条件的严谨性 所谓严谨性(stringency)，是指杂交反应体系， 避免非同源性或部分同源性的核酸序列形成杂交复 合物的严格程度。反应温度升高，离子强度降低， 会增加反应的严谨性，适用于匹配好的或序列完全 同源的核酸的杂交反应，或用于检测点突变；反之， 则适用于匹配差或序列不完全同源的核酸杂交反应
第二节核酸探针 核酸探针是指带有放射性同位素、生物素或其他 活性物质标记的某种特定的DNA或RNA片段。 核酸探针的类型 ()基因组DNA探针 用克隆化的基因片段作探针应尽可能选用基因的编 码序列(外显子) cDNA探针 与mRNA互补的DNA链称cDNA,特异性高,是 种较理想的核酸探针
第二节 核酸探针 核酸探针是指带有放射性同位素、生物素或其他 活性物质标记的某种特定的DNA或RNA片段。 一、核酸探针的类型 ㈠ 基因组DNA探针 用克隆化的基因片段作探针应尽可能选用基因的编 码序列(外显子)。 ㈡ cDNA探针 与mRNA互补的DNA链称cDNA，特异性高，是 一种较理想的核酸探针
RNA探针 RNA探针有下述优点: ①杂交体的稳定性高,杂交反应条件严格,特异性更 高 ②RNA单链不存在双链DNA探针的互补双链的复性 杂交效率较高。 ③RNA无高度重复序列,非特异杂交少。 ④杂交后用RNa消化未杂交的RNA探针,可降低杂 交本底
㈢ RNA探针 RNA探针有下述优点： ①杂交体的稳定性高，杂交反应条件严格，特异性更 高。 ②RNA单链不存在双链DNA探针的互补双链的复性， 杂交效率较高。 ③RNA无高度重复序列，非特异杂交少。 ④杂交后用RNase消化未杂交的RNA探针，可降低杂 交本底