融合细脆的克降化：目的：利用单个细胞培养的技术选育出遗传稳定的，能表达特定性状的细胞系。方法：有限稀释法、半固体培养基法、显微操作法、荧光激活分选法。1）有限稀释法：通过适当的稀释达到分离单个细胞的目的。（细胞计数-——基本一孔—培养液稀释后微孔板培养细胞-生成集落后检测再次克隆化一单细胞克隆）2）半固体培养基法：在半固体培养基中培养细胞，单细胞可以形成集落，然后吸出集落移种扩增。3）显微操作法：借助倒置显微镜，用弯头毛细管将细胞逐个吸出，分别进行培养，形成单细胞集落。荧光激活分选法：应用荧光激活分选仪进行。4
融合细胞的克隆化： 目的：利用单个细胞培养的技术选育出遗传稳定的，能表 达特定性状的细胞系。 方法：有限稀释法、半固体培养基法、显微操作法、荧光 激活分选法。 1）有限稀释法：通过适当的稀释达到分离单个细胞的目 的。（细胞计数——培养液稀释后微孔板培养——基本一孔一 细胞——生成集落后检测——再次克隆化——单细胞克隆） 2）半固体培养基法：在半固体培养基中培养细胞，单细 胞可以形成集落，然后吸出集落移种扩增。 3）显微操作法：借助倒置显微镜，用弯头毛细管将细胞 逐个吸出，分别进行培养，形成单细胞集落。 4）荧光激活分选法：应用荧光激活分选仪进行
5、重组工程细胞系（一）、重组细胞：特指利用基因工程手段制做的表达外源蛋白的细胞。（二）、重组细胞的构建过积合适表达载体选择外源基因获得酶切、连接获得插入外源基因的表达载体转入受体细胞鉴定、筛选含有外源基因的细胞株
5、重组工程细胞系 （一）、重组细胞： 特指利用基因工程手段制做的表达外源蛋白的细胞。 （二）、重组细胞的构建过程： 获得插入外源基因的表达载体 转入受体细胞 鉴定、筛选含有外源基因的细胞株 外源基因获得 合适表达载体选择 酶切、连接
（三）、克隆化基因在哺乳动物培养细胞中的表达优点：对于真核蛋白，能进行翻译后修饰，保持表达蛋白的活性、稳定性、及抗原性。缺点：操作复杂、条件苛刻、费用较高
（三）、克隆化基因在哺乳动物培养细胞中的表达： 优点：对于真核蛋白，能进行翻译后修饰，保持 表达蛋白的活性、稳定性、及抗原性。 缺点：操作复杂、条件苛刻、费用较高
三、基因工程细胞的构建和筛选哺乳动物细胞基因表达控制元件：（1）启动子：包含两种识别序列，TATAbox及上游启动子元件。启动子上具有mRNA的帽区位点即转录起始部位。（2）增强子元件：顺式作用的DNA序列，约100一200bp。特征：是一种较大元件，可包含重复序列，可独立发挥功能可距启动子很远将其活化，作用与序列方向无关！发挥作用为位置不依赖方式，具有组织特异性：有些增强子是条件诱导型的
哺乳动物细胞基因表达控制元件： （1）启动子：包含两种识别序列，TATA box及上游启动 子元件。启动子上具有mRNA的帽区位点即转录起始部位。 （2）增强子元件：顺式作用的DNA序列，约100－200bp。 特征： 是一种较大元件，可包含重复序列，可独立发挥功能 可距启动子很远将其活化，作用与序列方向无关； 发挥作用为位置不依赖方式，具有组织特异性； 有些增强子是条件诱导型的。 三、基因工程细胞的构建和筛选
（3）、翻译起始信号与终止信号AUG; UAA、UAG、 UGA, poly(A)。（4）、剪接信号：RNA转录后修饰过程，切除内含子
• （3）、翻译起始信号与终止信号： • AUG； UAA、UAG、 UGA，poly(A)。 • （4）、剪接信号： • RNA转录后修饰过程，切除内含子