土壤中的微生物,大约70%~90%是细菌。鈿菌适宜 在酸碱庋接近中性的潮湿土壤中生长,绝大多数分布在距 地表约3~8cm的土壤层。因此,土壤取样时,一般要铲去 表层土。在城市,常见的是公园里、街道旁、花盆中的土 壤;在农村,则容易收集到农田或篥园的土壤。你打算选 择什么样的土壤做实验呢? [资料二]样品的稀释 样品的稀释程度将直接影响平板上生长的菌落数目。 为什么分离不同的微生物要采用不 实际操作中,通常选用一定稀释范的样品液进行培养,以 同的稀释度? 保证获得菌落数在30~300之间、适于计数的平板。 测定土壤中细菌的总量和测定土壤 测定土壤中细菌的数量,一般选用10·、105和10°倍的 中能分解尿素的细菌的数量,选用稀释液进行平板培养;测定放线菌的数量,一般选用10、 的稀释范国相同吗?如果不同,你10和10倍稀释:测定真菌的数量,一般选用10、10°和 打算选用多大的稀释范围? l0倍稀释。根据这些数据,请你思考旁栏中的问題。 当你第一次做这个实验的时候,可以将稀释的范围放 宽一点。例如,可以将103~10倍的稀释液分别涂布到平 板上培养,以保证能从中选择出菌落数在30~300间的平 板进行计数。 [资料三]微生物的培养与观察 不同种类的微生物,往往需要不同的培养温度和培养 时间。细菌一般在30~37℃的温度下培养1~2d;放线菌 一般在25~28℃的温度下培养5~7d;而霉菌一般在25 28℃的温度下培养3~4d。本实验中,我们可以每隔24h 统计一次菌落数目,选取菌落数目稳定时的记录作为结果 观察是科学研究的基本功。敏 这样可以防止因培养时间不足而导致遗渦菌落的数目。 锐的观察力来源于实践中一点 一般来说,在一定的培养条件下(相同的培养基、温 滴的积累 度及培养时间),同种微生物表現出稳定的菌落特征。这些 形 菜4 标点状 形 丝状 不规状假根状 边播状 突起 阅面观 三扁平 隆起 凸透状 垫状 脐突状 边缘 (部分 完整 波状 裂片状 蚀状 曲状 图2-8菌落的特征示意图 24专题2微生物的培养与应用
特征包括菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等方面(图 2-8)。请仔细观察你所分离到的菌落,最好以表格的形式 将不同菌落的特征记录下来。 操作提示 请你根据自己设计的实验方案进行操作。操作中,应 待别注意以下一些问题。 (一)无菌操作 做这个实验前,请你先复习课题1中学习过的无菌 操作方法。此外,本课题中的无菌操作还须注意以下几研究未知的微生物,一定要注 点 意进行规范的无菌操作,以防 1.取土样用的小铁铲和盛土样的信封在使用前都需要 被致病的微生物感染。实验后 定要洗手。 灭菌。 2.应在火焰旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒 入烧瓶中,塞好棉塞。 3.在稀释土壤溶液的过程中,每一步都要在火焰旁操 作 (二)做好标记 本实验使用的平板和试管比较多。为避免混淆,最 好在使用前就做好标记。例如,在标记培养皿时(图2-9) 应注明培养基种类、培养日期以及平板上培养样品的稀 释度。 在进行系列稀释的时候,为避免试管相互混淆,可以 将已经进行过稀释操作的试管,按稀释度递增的顺序,依 次放置在试管架的另一行。这样,试管的位置就能清楚地 表示出稀释进行到哪一步。 图2-9培养皿的标记 (三)规划时间 对于耗时较长的生物实验,我们需要事先规划时间, 以便提高工作效率,在操作时更加有条不紊。例如,在本 实验中,我们可以在第一天进行实验器材的灭菌以及制备 培养基的工作,第二天进行稀释涂布平板的操作,第三、四、 五天进行实验结果的观察与记录。 结果分析与评价 1.结合对照,分析培养物中是否有杂菌污染以及选择 培养基是否筛选出一些菌落? 2.是否获得了某一稀释度下,菌落数目在30~300的 ,课题2土中分解素的细菌的分离与计数25
平板。在这一稀释度下,是否至少有两个平板的菌落数相 接近? 3你统计的每克土壤中含有能分解尿素的细菌的菌落 数是多少?与其他同学的结果接近吗?如果差异很大,可 能是什么原因引起的? 课题延伸 本课题对能分解尿素的细菌进行了初步的筛选。但是, 这只是分离纯化菌种的第一步。对分离的菌种作进一步的 鉴定,还需要借助生物化学的方法。 在细菌分解尿素的化学反应中,细菌合成的脲酶将尿 脉酶阴性 素分解成了氨。氨会使培养基的碱性增强,pH升高。因 此,我们可以通过检测培养基pH的变化来判断该化学反 豚酶阳性 应是否发生。 图2-10脲酶的检测 在以尿素为惟一氮源的培养基中加入酚红指示剂,培 养某种细菌后,如果pH升高,指示剂将变红(图2-10)。 这样,我们就可以准确地鉴定该种细菌能够分解尿素。 细菌的数目还可以通过滤膜法 相关链接 来测定。以测定饮用水中大肠 杆菌的数目为例。将已知体积 活菌计数技术广泛应用于土壤含菌量的测定、食品卫 的水过滤后,将滤膜放在伊红 生和水源污染度的检验等方面。如果你感兴趣,可以从下 美蓝培养基(参见附录3)上培 养。在该培养基上,大肠杆菌的 列项目中选做一个 菌落呈现黑色。可以根据培养 (一)空气中微生物总数的检测 基上黑色菌落的数目,计算出 二)水中细菌总数的检测 水样中大肠杆菌的数量。 (三)牛奶中细菌的分离与计数 (四)土壤中真菌(或放线菌)的分离与计数 练习 1.请你描述一个细菌在琼脂平板上生成一个肉眼可见的菌落的过程,并描述活菌计数的方法与原理。 2.反刍动物,如牛和山羊,具有特殊的器官—瘤胃。在瘤胃中生活着多种微生物,其中许多微生物 能以尿素作傕一氮源。请你设计一个实验,从瘤胃中分离出能够分解尿素的微生物。 26专题2微生物的培养与应用
课题分解纤维素的微生物的分离 课题肯景 纤维素,一种由荀葫糖首尾相连 CHANI CHOIl CHOH 而成的高分子化合物,是地球上含量最 小 丰富的多糖美物质。植物的根、茎、叶 IOH 等器官都含有大量的纤维素。地球上的 纤维素的结构式 :植物每年产生的纤维素超过70亿吨,其 :中40%~60%能被土壤中某些微生物分解利用,这是因为它们能够产生纤维素酶。 对这些微生物的研究与应用,使人们能够利用秸秆等废弃物生产酒精,用纤维素 酶处理服装面杆等。而要研究这些微生物,首先要将它们从土壤中种类众多的微生物 :中分离出来。在本课题中,我们将探讨如何分离土壤中能够分解纤维索的微生物 基础知识 (一)纤维素与纤维素酶 棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物(图2 11),此外,木材、作物秸秆等也富含纤维素。许多商品纤 成熟棉桃的 维素都是由天然纤维素制得的,如水溶性的羧甲基纤维素 钠( CMC-Na)、不溶于水的微晶纤维素( Avicel)等。 纤维素酶是一种复合酶,一般认为它至少包括三种组 分,即C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶,前两种酶使纤维素分解 成纤维二糖,第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。正是在 这三种酶的协同作用下,纤维素最终被水解成葡萄糖,为 微生物的生长提供营养,同样,也可以为人类所利用。下 面我们通过一个小实验来体会纤维素酶的作用。 图2-11成熟的棉株 在2支20mL的试管中,分别放入1×6cm的滤纸条, 再分别加入叫H为48.物质的量浓度为0mO的醋酸一1U表示1个酶活力单位,是指 醋酸钠缓冲液l0mL、llmL。在加λI0mL缓冲液的试管 在温度为25℃,其他反应条 中加入1mL纤维素酶(70-80UmL)。将2支试管固定在 件,如pH等,均为最适的情况 50mL的锥形瓶中,在床上以140r/min的转速振荡反应 下,在1min内转化 I mmol的 底物所需的酶量。 Ih,观察结罘。你也可以用报纸、复印纸做这个实验。如 课题3分解纤维素的微生物的分离
果没有摇床,你可以采用定时人工振荡的方法。时间足够 长时,你会观察到滤纸被完全分解(图2-12)。 (二)纤维素分解菌的筛选 在寻找微生物的过程中,人们希望能用一些简便直接 的方法,找到所需要的微生物,同时筛掉不需要的微生物, 就好像用筛子筛沙一样。在筛选纤维素分解菌的过程中,人 们发明了刚果红染色法,这种方法能够通过颜色反应直接 对微生物进行筛选。 刚果红( Congo red,简称CR)是一种染料,它可以 与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物,但并不和水 图2-12纤维素酶水解滤纸试验,右解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。当我们在含有纤 边的试管中加入了纤维素酶,而左边维素的培养基中加入刚果红时,刚果红能与培养基中的纤 的没有加人 维素形成红色复合物。当纤维素被纤维素酶分解后,刚果 红一纤维素的复合物就无法形成,培养基中会出现以纤维 素分解菌为中心的透明圈(图2-13)。这样,我们就可以通 过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌 实验设计 请你根据实验流程图(图2-14)和提供的三个资料,思 考有关问题,然后进行实验设计,并写出详细的实验方案。 图2-13四种纤维素分解菌在刚果 土壤取样一选择培养 梯度稀释 红培养基上形成的透明圈 将样品涂布到鉴别纤维 本实验流程与课商2中的实验流程 挑选产生透明圈的菌落 素分解菌的培养基上 有哪些异同? 庄:*选择培养这一步可以省略。 图2-14分离分解纤维素的微生物的实验流程示意图 [资料一]土壤取样 根据经验,纤维素分解菌大多分布在富含纤维素的环 为什么要在富含纤维素的环境中寻 找纤维素分解菌? 境中,因此,采集土样时,可以选择纤维素丰富的环境, 如树林中多年落叶形成的腐殖土,多年积累的枯枝败叶, 等等。你还可以将富含纤维素的物质,如滤纸等,埋在土 将滤纸星在土壤中有什么作用?你壤中。经过30d左右,再从已腐烂的滤纸上筛选纤维素分 认为滤纸应该埋进土壤多深? 解菌。 28专题2微生物的培养与应用