稀释涂布平板法则是将菌液进行一系列的梯度稀释, 然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表 面,进行培养。在稀释度足够高的菌液里,聚集在一起的 微生物将被分散成单个细胞,从而能在培养基表面形成单 个的菌落。 系列稀释操作 I mL I ml I nl I mL. I nL 1.将分别盛有 9mL水的6支试管灭 菌,并按10~10的 顺序编号。 菌液 2.用移液管吸 取1mL培养的菌液, ml 注入第二支试管中。 稀释液稀释液稀释液稀释液稀释液稀释液 用手指轻压移液管上的橡皮头,吹吸三次,使菌液与水充分混匀 3.从10倍稀释的试管中吸取1mL稀释液,注入10倍稀释的试管中,重复第2步的操作。依 次类推,直到完成最后一支试管的稀释。 注意:移液管需要经过灭菌。操作时,试管口和移液管应在离火焰1~2cm处。 涂布平板操作 涂布器 ② 2.取少量菌液(不 超过0.m),滴加 到培养基表面。 4.用涂布器将菌液均 1.将涂布器浸在盛 匀地涂布在培养基表 有酒精的烧杯中。 3.将沾有少量酒精的涂布器在火焰上面。涂布时可转动培养 引燃,待酒精燃尽后,冷却8-10s。皿,使涂布均匀。 注意:1.将涂布器末端浸在盛有体积分数为70%的酒精的烧杯中。取出时,要让多余的酒精 在烧杯中滴尽,然后将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃。 2.操作中一定要注意防火!不要将过热的涂布器放在盛放酒精的烧杯中,以免引燃其中的酒精。 讨论 涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求,想一想, 第2步应如何进行无菌操作? 题1微生物的实验室培养19
将接种后的培养基和一个未接种的培养基都放入37℃ 恒温箱中,培养12h和24h后,分别观察并记录结果 结果分析与评价 1.未接种的培养基表面是否有菌落生长?如果有菌落 生长,说明了什么? 2.在接种大肠杆菌的培养基上,你是否观察到了独立 的菌落?这些菌落的颜色、形状和大小相似吗? 3.培养12h和24h后,观察到的实验结果相同吗? 如果不同,请分析产生差异的原因。 4.如果你在培养基上观察到了不同形态的菌落,你能 分析出可能是由哪些原因引起的吗? 5.你是如何记录实验结果的?与其他同学交流互评。 课题延伸 为了保持菌种的纯净,需要进行菌种的保藏。对于频繁 使用的菌种,我们可以采用临时保藏的方法。首先,将菌种 接种到试管的固体斜面培养基上,在合适的温度下培养。当 菌落长成后,将试管放入4℃的冰箱中保藏(图2-5)。以 后每3~6个月,都要重新将菌种从旧的培养基上转移到新 图2-5菌种的斜面保藏 鲜的培养基上。但是,这种方法保存的时间不长,菌种容 易被污染或产生变异。 对于需要长期保存的菌种,可以采用甘油管藏的方法。 在3mL的甘油瓶中,装入1mL甘油后灭菌。将1mL培养 的菌液转移到甘油瓶中,与甘油充分混匀后,放在-20℃的 冷冻箱中保存。 6。0非0。 练习 ee。。。06。。0.。 请你想一想,日常生活中保存食品的方法培养技术在设计思路和具体操作上的异同。 有哪些?这些方法是如何阻止或抑制微生物生长 3.巴斯德设计的鹅颈瓶实验有力地驳斥了 自然发生论”,证明微生物只能从微生物产生, 2.无土栽培技术是用人工配制成的培养液来不能从没有生命的物质自然产生。请你解释其实 栽培植物;植物组织培养技术则是将植物体的组织:验原理,并分析这个实验对于微生物学的进步 接种在培养基上进行离体培养;而在本课题中,我微生物学的研究方法以及食品保存等方面所产生 们着重学习了微生物的培养技术。请你比较这三种的影响。 20专题2微生物的培养与应用
课题2 土壤中分解尿素的细菌 的分离与计数 课题背景 尿素是一种重要的农业氨肥。但是,尿素并不 :能査接被农作物吸收。只有当土壤中的细菌将原素 分解成氨之后,才能被植物利用。土壤中的细菌之 尿素分子的立体结构 所以能分解尿素,是因为它们能合成脲酶 脉醇 尿素[CONH2)2]最初是从人的乐液中发现的。CO(NH)2“-CO2+NH1+HO 当时,人们普遍相信有机物只能由有生命活力的生 物产生,而无法通过化学方法合成。但是,1828年,德国化学家维勒( F Wohler)成 功地通过无机物的化学反应合成了尿素,揭开了历史上人工合成有机物的新篇幸。此 :后,原素的生产走向了工业化,原素也逐步成为农业生产中重要的肥。 本课題以土壤中能分解尿素的细菌为研究对象,要达到两个主要目的:(1)从 :土壞中分离出能够分解尿素的细菌;(2)统计每克土壤祥品中究党含冇多少这样的 :细菌 研究思路 (一)筛选菌株 DNA多聚酶链式反应(PCR)是一种在体外将少量DNA 大量复制的技术(参见专题5课题2)。此项技术的自动化, 要求使用耐高温的DNA聚合酶。这种酶要能忍受93℃左右 的高温。如果请你来寻找这种耐高温的酶,你会去哪里寻找? 科学家是从水生耐热细菌7( Thermus aquaticus)中影 分离到耐高温的 Taq DNA聚合酶的。g细菌是美国微生 物学家托马斯·布鲁克( T. Brock)于1966年在美国黄石 国家公园的一个热泉(图2-6)中发现的。这说明,在寻找意 目的菌株时,要根据它对生存环境的要求,到相应的环境 图26美国黄石国家公园的 中去寻找。 一个热泉 为什么πq细菌能从热泉中被筛选出来昵?这是因为 热泉70-80℃的高温条件淘汰了绝大多数微生物,而使耐 热的Tg细菌脱颖而出。实验室中微生物的筛选,也应用了 同样的原理,即人为提供有利于目的菌株生长的条件(包 括营养、温度、pH等),同时抑制或阻止其他微生物生长 课题2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
本课题使用的培养基 请你裉据这一恐路,分析旁栏中本课题将用到的培养 KH PO. 基配方,回答下面的问题。 Na, HPO g 1.在该培养基的配方中,为微生物的生长提供碳源和 MgSO4·7HO 0.2g 氮源的分别是什么物质? 葡萄糖 10.0g 2.绝大多数微生物都能利用而萄糖,但是,只有能合 尿素 1.0g 15.0g 成脲酶的微生物才能分解尿素。请你分析该培养基的配方 琼脂 将上述物质溶解后,用自来水 想一想这种培养基对微生物是否具有选择作用?如果具有, 定容到1000mL 又是如何进行选择的? 在微生物学中,将允许特定种类的微生物生长,同时 抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基,称做选择培养 基 ( selective media)。 (二)统计菌落数目 在课题1中,我们学习了稀释涂布平板法。这一方法 常用来统计样品中活菌的数目。当样品的稀释度足够高时, 培养基表面生长的一个菌落,来源于样品稀释液中的一个 想一想,如何从平板上的菌落数推 活菌。通过统计平板上的菌落数,就能推测出样品中大约 测出每克样品中的菌落数? 含有多少活菌。为了保证结果准确,一般选择菌落数在30 300的平板进行计数。 两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细 菌数。在对应稀释倍数为l0的培养基中,得到以下两种统 计结果。 1.第一位同学在该浓度下涂布了一个平板,统计的菌 落数为230 2.笫二位同学在该浓度下涂布了三个平板,统计的菌 落数分別为21、212和256,该同学以这三个平板上菌落数 的平均值163作为统计结果。 你认为哪位学的结果接近真实值?你认为这两位同 每克样品中的苗落数 学的实验需要改进吗?如果需要,如何改进? =(C÷V)×M 值得注意的是,统计的菌落数往往比活菌的实际数目 其中,C代表某一稀释度下平板 低。这是因为当两个或多个细胞连在一起时,平板上观察 上生长的平均菌落数,V代表涂 到的只是一个菌落。因此,统计结果一般用菌落数而不是 布平板时所用的稀释液的体积 (mL).M代表稀释倍数。 活菌数来表示。除了上述的活菌计数法外,显微镜直接计 数也是测定微生物数量的常用方法。 (三)设置对照 设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实 验结果的影响,提高实验结果的可信度。请你分析下面的 实例,想一想如何设置本实验的对照。 22专题2微生物的培养与应用
在做本课题的实验时,A同学从对应10倍稀释的培养 基中筛选出大约150个菌落。但是,其他同学在同样的种释对照实验是指除了被测试的条 度下只选择出大约50个菌落。 件以外,其他条件都相同的实 其他同学认为A同学的结罘有问題。他们分析可能是A 验,其作用是比照实验组,排除 同学的培养基被杂菌污染了,或者培养基中混入了其他含氪 任何其他可能原因的干扰,证 物质,因而导致不能分解尿素的綱菌也能在该培养基上生长。 明确实是所测试的条件引起相 应的结果。 但是,A闷学确信自己的实验操作准确无误,与其他 同学的结果之所以不相同,是因为自己所选用的土壤样品 不同。但是,A同学在设计实脸的时候并没有设置对照,因 而此时也拿不出令同学们信服的证据。 你能通过设置对照,帮助A同学排除上述两个可能影 响实验结果的因素吗? 实验设计 实验设计包括对实验方案,所需仪器、材料、用具和 药品,具体的实施步骤以及时间安排等的综合考虑和安排。 一般来说,实验设计做得周密细致,做实验时就能有条不 紊,将精力集中在具体的操作上。 请你根据实验流程示意图(图2-7)和提供的三个资料, 思考有关问题,然后进行实验设计,并写出详细的实验方案。 9m无菌水 10g土样90mL 无菌水 ③ 一回的一(一6 (10 图2-7样品的稀释和稀释液的取样培养流程示意图 [资料一]土壤取样 土壞有“微生物的天然培养基”之称。同其他生物环 境相比,土壤中的微生物,数量最大,种类最多。在富含 有机质的土壤表层,有更多的微生物生长 课题2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数23