载体DNA用量×插入DNA大小（kb）插入DNA（摩尔比率）X插入DNA用量（ng）=载体DNA载体的大小（kb)举例而言，一个连接反应中，如果所用的载体为3kb大小，其用量是100ng，插入DNA的大小为0.5kb则插入DNA的用量为：插入DNA(ng)=100×(0.5/3.0)×(3/1)=50(ng)（二）克隆质粒结构与质粒图谱阅读法1.克隆质粒结构：复制起始位点Ori，即控制复制起始的位点。抗生素抗性基因：可以便于加以检测，如Amp+Kan等。多克隆位点：MCS克隆携带外源基因片段。2.阅读质粒图谱的基本四步法：首先看Ori的位置，了解质粒的类型。Ori的箭头指向复制方向，其他元件标注的箭头多指转录方向（正向）。第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记。常用的标记有：（1）Amp’：水解β-内酰胺环，解除氨苄的毒性。tet：可以阻止四环素进入细胞。cam'：生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。neo（kan）：氨基糖苷磷酸转移酶，使G418（卡那霉素衍生物）失活。hyg：使潮霉素β失活。第三步：看多克隆位点（MCS）。它具有多个限制酶的单一切点，便于外源基因的插入。如果在这些位点处有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，而便于筛选。MCS决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。第四步：再看外源DNA插入片段大小。质粒一般只能容纳小于1OKb的外源DNA片段。一般来说，外源DNA片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。（三）pET-28a质粒而针对PCR产物的克隆，目前一般的实验室都采用pET-28a质粒进行克隆。三、材料与仪器移液器，吸头，恒温水浴锅，恒温摇床，高速离心机，温度计，微量移液器（10、100、1000μL量程各一支），0.5mL/1.5mL离心管或200μLPCR管，PE手套或乳胶手套，制冰机。15
15 举例而言，一个连接反应中，如果所用的载体为 3kb 大小，其用量是 100ng，插入 DNA 的大小为 0.5kb 则插入 DNA 的用量为： 插入 DNA(ng)=100×(0.5/3.0)×(3/1)=50(ng) （二）克隆质粒结构与质粒图谱阅读法 1. 克隆质粒结构： 复制起始位点 Ori，即控制复制起始的位点。 抗生素抗性基因：可以便于加以检测，如 Amp+ Kan+等。 多克隆位点：MCS 克隆携带外源基因片段。 2. 阅读质粒图谱的基本四步法： 首先看 Ori 的位置，了解质粒的类型。Ori 的箭头指向复制方向，其他元件标注的箭头 多指转录方向（正向）。 第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记。常用的标记有：（1）Ampr： 水解 β -内酰胺环，解除氨苄的毒性。tetr ：可以阻止四环素进入细胞。camr：生成氯霉素羟 乙酰基衍生物，使之失去毒性。neor（kanr）：氨基糖苷磷酸转移酶，使 G418（卡那霉素衍生 物）失活。hygr：使潮霉素 β 失活。 第三步：看多克隆位点（MCS）。它具有多个限制酶的单一切点，便于外源基因的插入。 如果在这些位点处有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，而便于筛选。MCS 决定 能不能放目的基因以及如何放置目的基因。 第四步：再看外源 DNA 插入片段大小。质粒一般只能容纳小于 10Kb 的外源 DNA 片 段。一般来说，外源 DNA 片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。 （三）pET-28a 质粒 而针对 PCR 产物的克隆，目前一般的实验室都采用 pET-28a 质粒进行克隆。 三、材料与仪器 移液器，吸头，恒温水浴锅，恒温摇床，高速离心机，温度计，微量移液器(10、100、 1000 μL 量程各一支)，0.5mL/1.5mL 离心管或 200 μL PCR 管，PE 手套或乳胶手套，制冰机
5Not l(166ag1(166Hind 1ll(173)Salli179SaenECOR11192BamH I(198)Nhe (231)Bpu1102(80)Nde I(238)Dra ll(5127)[Nco(296)Xbal(335)Bgll(401)1origin(4903-5358)SgrA(442)Sph((598)1Pvu I(4426)Sgf (4426)6Sma(4300)8Mu(1123)lacl(773-1852)Bcl(1137)ueClal(4117)1BstEII1304;Nru (4083)pET-28a(+)Apa(1334)(5369bp）/BsSHi(1534)Ec057(3772)ECORV(1573)Hpa(1629)AlwNI(3640)PshA I(1968)BssS((3397)Bgl (2187)BspLU11(3224)Sap(3108)7FspI(2205)Bst1107(2995)psp51l(2230)Tth111l(2969)pET28a载体基本信息出品公司：EMDBiosciences(Novagen)别名：pet28a,pet28a,pET-28a(+)质粒类型：大肠杆菌蛋白表达表达水平：高克隆方法：多克隆位点，限制性内切酶载体大小：5369bp5'测序引物及序列：T7:5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3"3'测序引物序列：T7t:5'-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3载体标签：N-His,N-Thrombin,N-T7,C-His载体抗性：卡那霉素表达宿主菌：BL21(DE3)BLR(DE3)BL21(DE3)pLySSN端含有Thrombin蛋白酶切位点；pET28a，b，c的差异仅仅存备注：在于多克隆位点处。产品目录号：69864-3稳定性：瞬时表达Transient组成型：组成型Constitutive非病毒病毒/非病毒：图11pET-28a质粒结构四、实验试剂pET-28a质粒结构，PCR产物（SIX1基因），BamHl，Xho1，T4DNA连接酶。16
16 图 1 pET-28a 质粒结构 四、 实验试剂 pET-28a 质粒结构，PCR 产物（SIX1 基因），BamH1，Xho1，T4DNA 连接酶
五、实验操作1.双酶切体系（10μL），在灭菌的微量离心管（Eppendorf管）中制备如下反应体系pET-28a质粒（PCR产物）300ng（500ng）1μLBamH1Xho11μL1μL10Xbufferdd H2O补齐至10μL37℃反应20min，琼脂糖凝胶电泳验证并回收片段（胶回收试剂盒）2.连接反应pET-28a质粒双酶切回收片段1μL2μLPCR产物双酶切回收片段1μLT4DNA连接酶1μL10×bufferdd H2O补齐至10μL轻弹离心管数次混匀，并短暂离心收集液体。将上述制备好的连接反应体系在16℃水浴中连接90分钟或4℃过夜（12-16h）。3.结果鉴定以琼脂糖凝胶电泳对连接结果进行鉴定。注意事项：1，连接目的片段和载体时注意摩尔比例以及连接酶的用量。2.本实验所需试剂以微量单位计算，使用移液器务必准确小心。六、思考题：1.T4连接酶的作用机理。2.你认为连接位点会不会有突变？有什么方法证明吗？3.目的片段和载体连接的效率取决于什么？17
17 五、 实验操作 1. 双酶切体系（10L）,在灭菌的微量离心管（Eppendorf 管）中制备如下反应体系 pET-28a 质粒 （PCR 产物） 300ng（500ng） BamH1 1μL Xho1 1μL 10×buffer 1μL dd H2O 补齐至 10L 37℃反应 20min，琼脂糖凝胶电泳验证并回收片段（胶回收试剂盒） 2. 连接反应 pET-28a 质粒双酶切回收片段 1μL PCR 产物双酶切回收片段 2μL T4 DNA 连接酶 1μL 10×buffer 1μL dd H2O 补齐至 10L 轻弹离心管数次混匀，并短暂离心收集液体。将上述制备好的连接反应体系在 16℃水浴 中连接 90 分钟或 4℃过夜（12-16h）。 3. 结果鉴定 以琼脂糖凝胶电泳对连接结果进行鉴定。 注意事项： 1. 连接目的片段和载体时注意摩尔比例以及连接酶的用量。 2. 本实验所需试剂以微量单位计算，使用移液器务必准确小心。 六、思考题： 1. T4 连接酶的作用机理。 2. 你认为连接位点会不会有突变？有什么方法证明吗？ 3. 目的片段和载体连接的效率取决于什么？
实验四重组质粒的转化一、实验目的学习感受态E.coli的制作方法，并应用该方法将实验三获得的重组载体转化E.coli感受态细胞，从而获得抗药性的含目的基因的转化子，为下面的实验奠定基础。二、实验原理（一）遗传物质的传递方式遗传物质的传递，一般常用接合转移、细胞融合、转导、转染、转化等方法进行。转化是指某一细胞系由于接受了外源DNA，而导致其原来的性状发生改变，这种性状的改变包括遗传型与表型的改变。转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。转化缓冲液中的DNA形成不易被DNA酶所降解的羟基-钙磷酸复合物，此复合物粘附于感受态细胞表面。42℃短时间热处理（热休克），可以促进细胞吸收DNA复合物。将处理后的细菌放置在非选择性培养液中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型（如Amp抗性）得到表达。然后再涂布于含有氨苄青霉素的选择性平板上，37℃培养过夜形成单克隆。在这个过程中包含两种筛选方法，一种是抗性筛选，一种是蓝白斑筛选。载体中含有耐药基因，可以使转化成功的受体细胞具有抗药性，能够在含有相应药物的琼脂平板上形成单克隆菌落。通过这种方法就可以筛选转化成功的受体细胞。而能进行蓝白筛选是因为载体中有一段大肠杆菌β-半乳糖苷酶的启动子和编码其N端氨基酸（α肽链）的片断基因。宿主具有编码β半乳糖苷酶的C端基因。当二者产物组合在一起，就具有活性酶的产生，此现象称为α互补。在诱导物IPTG（乳糖类似物，不会被β-半乳糖苷酶催化降解）的作用下，由α互补形成的具有功能活性的β-半乳糖苷酶，可分解培养物中的X-gal（它能将无色的化合物X-gal切割成半乳糖和蓝色底物），使其呈蓝色反应。如果外源基因插入位于LacZ基因内部的多克隆酶切位点中，就会破坏α肽链的阅读框，从而不能合成与受体菌内的β-半乳糖苷酶相互补的活性α肽链，导致不能编码β-半乳糖苷酶，菌落呈正常的白色。而没有插入外源片断的则是蓝色的。因此，按照菌落的颜色就可以确定载体上是否插入了外源基因。（二）受体菌的改造与选择作为基因工程的载体受体系统来说，最重要的是改造和构建载体，这里就不介绍了。对受体而言，改造的目的在于提高转化效率和一定的安全性。选择和改造一个适合的受体，应从如下几个方面考虑：18
18 实验四 重组质粒的转化 一、实验目的 学习感受态 E.coli 的制作方法，并应用该方法将实验三获得的重组载体转化 E.coli 感受 态细胞，从而获得抗药性的含目的基因的转化子，为下面的实验奠定基础。 二、实验原理 （一）遗传物质的传递方式 遗传物质的传递，一般常用接合转移、细胞融合、转导、转染、转化等方法进行。转化 是指某一细胞系由于接受了外源 DNA，而导致其原来的性状发生改变，这种性状的改变包括 遗传型与表型的改变。 转化是指质粒 DNA 或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。转化缓冲液中的 DNA 形成不易被 DNA 酶所降解的羟基-钙磷酸复合物，此复合物粘附于感受态细胞表面。42℃ 短 时间热处理（热休克），可以促进细胞吸收 DNA 复合物。将处理后的细菌放置在非选择性培 养液中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型(如 Amp 抗性) 得到表达。然后再 涂布于含有氨苄青霉素的选择性平板上，37℃ 培养过夜形成单克隆。在这个过程中包含两种 筛选方法，一种是抗性筛选，一种是蓝白斑筛选。载体中含有耐药基因，可以使转化成功的 受体细胞具有抗药性，能够在含有相应药物的琼脂平板上形成单克隆菌落。通过这种方法就 可以筛选转化成功的受体细胞。而能进行蓝白筛选是因为载体中有一段大肠杆菌 β-半乳糖苷 酶的启动子和编码其 N 端氨基酸（α 肽链）的片断基因。宿主具有编码 β 半乳糖苷酶的 C 端 基因。当二者产物组合在一起，就具有活性酶的产生，此现象称为 α 互补。在诱导物 IPTG （乳糖类似物，不会被 β-半乳糖苷酶催化降解）的作用下，由 α 互补形成的具有功能活性的 β-半乳糖苷酶，可分解培养物中的 X-gal（它能将无色的化合物 X-gal 切割成半乳糖和蓝色底 物），使其呈蓝色反应 。如果外源基因插入位于 LacZ 基因内部的多克隆酶切位点中，就会破 坏 α 肽链的阅读框，从而不能合成与受体菌内的 β-半乳糖苷酶相互补的活性 α 肽链，导致不 能编码 β-半乳糖苷酶，菌落呈正常的白色。而没有插入外源片断的则是蓝色的。因此，按照 菌落的颜色就可以确定载体上是否插入了外源基因。 （二）受体菌的改造与选择 作为基因工程的载体受体系统来说，最重要的是改造和构建载体，这里就不介绍了。对 受体而言，改造的目的在于提高转化效率和一定的安全性。选择和改造一个适合的受体，应 从如下几个方面考虑：
1.限制与修饰系统（restrictionmodification）最好选择R，M或R、M的突变体菌株。限制：区别自已与非已的DNA，对外源的DNA产生限制作用，从而降解外源DNA。修饰：对自已的DNA加以修饰，使其不因限制作用而降解。在限制修饰系统中，限制与修饰作用分别借助于限制性内切酶和修饰甲基化酶来完成。例如：原始菌中是R+、M的大肠杆菌，可改造成为：R'、M与R'、M。用RM作受体菌，可提高转化效率103，但通常情况下，RM这一类受体菌用得较多。当然对于R、M的受体，也不是不可以做，只不过是转化效率较低，对于转化难度高的克隆或做基因文库要求99%基因进库，一般要10/μg，若转化效率为103-4，要有100～1000μg的DNA量，还不如提高转化效率100～1000有意义。2.重组系统（Recombination）外源DNA的分子与受体染色体DNA发生重组的机率很少，特别是recA"的菌株仅约10~，这种机率对转化效率（10°）来讲是微不足道的，而且rec*的菌株做受体菌往往比rec的菌株做受体菌转化效率要高得多（这可能是rec菌株的生理条件较难以控制，因此人们喜欢选用rec*的菌株做起始转化)；但是一旦这种极少数机率给碰上了，也就是说外源DNA和受体染色体DNA发生了重组，这也是很麻烦的事情。所以为了安全起见，人们往往在rec受体起始转化，筛选到正确的转化子后，又要把重组载体再转到rec受体菌中去保存。一般来讲：rect、rec的菌株培养物的光密度值也不同：例：rec(X1776)OD550=0.2(约75×107cell/mL)ODss=0.5(约5×107 cell /mL)rec(DHI)3.有明显的选择性差异有了明显的遗传表型差异，就便于重组子的检测。在大肠杆菌系统中，特别是质粒重组的DNA克隆技术，用得最多的是抗药性标记的选择，本实验就是应用了载体的Amp。在选择遗传性状差异的受体菌时，根据载体、供体特性，也有选择营养缺陷型，或特异性显色做为选择重组子的依据。但无论选择那一种遗传性状，有一点应该引起注意的是：回复突变频率高的受体菌，假阳性转化子的比率也较高，这在检测重组子的工作要特别注意。对于找不到合适的具有明显差异的受体菌的情况下，检测重组子可以通过快速抽提，酶切鉴定或菌落原位杂交等方法。4.选择能够发展感受态细胞的菌株做受体菌所谓感受态就是受体菌具有能接受外源DNA（周围环境中的DNA分子）能力的一种生理状态。在细菌中能够发展感受态的细胞是很少的，一般认为占细菌总数的0.1%～1%，而且19
19 1. 限制与修饰系统(restriction—modification) 最好选择 R -，M +或 R -、M -的突变体菌株。 限制：区别自己与非己的 DNA，对外源的 DNA 产生限制作用，从而降解外源 DNA。 修饰；对自己的 DNA 加以修饰，使其不因限制作用而降解。 在限制修饰系统中，限制与修饰作用分别借助于限制性内切酶和修饰甲基化酶来完成。 例如：原始菌中是 R +、M -的大肠杆菌，可改造成为：R -、M -与 R -、M +。用 R -M +作受体菌， 可提高转化效率 103，但通常情况下，R -M -这一类受体菌用得较多。 当然对于 R +、M -的受体，也不是不可以做，只不过是转化效率较低，对于转化难度高的 克隆或做基因文库要求 99％基因进库，一般要 106 /μg，若转化效率为 103-4，要有 100～1000μg 的 DNA 量，还不如提高转化效率 100～1000 有意义。 2．重组系统(Recombination) 外源 DNA 的分子与受体染色体 DNA 发生重组的机率很少，特别是 recA-的菌株仅约 10-6， 这种机率对转化效率（106）来讲是微不足道的，而且 rec+的菌株做受体菌往往比 rec-的菌株 做受体菌转化效率要高得多（这可能是 rec-菌株的生理条件较难以控制，因此人们喜欢选用 rec+的菌株做起始转化）；但是一旦这种极少数机率给碰上了，也就是说外源 DNA 和受体染 色体 DNA 发生了重组，这也是很麻烦的事情。所以为了安全起见，人们往往在 rec+受体起始 转化，筛选到正确的转化子后，又要把重组载体再转到 rec -受体菌中去保存。 一般来讲：rec+、rec-的菌株培养物的光密度值也不同： 例：rec+ ( Xl776) OD550＝0.2(约 75×107 cell／mL) rec- (DHl) OD55＝0.5(约 5×107 cell／mL) 3．有明显的选择性差异 有了明显的遗传表型差异，就便于重组子的检测。在大肠杆菌系统中，特别是质粒重组 的 DNA 克隆技术，用得最多的是抗药性标记的选择，本实验就是应用了载体的 Ampr。在选 择遗传性状差异的受体菌时，根据载体、供体特性，也有选择营养缺陷型，或特异性显色做 为选择重组子的依据。但无论选择那一种遗传性状，有一点应该引起注意的是：回复突变频 率高的受体菌，假阳性转化子的比率也较高，这在检测重组子的工作要特别注意。 对于找不到合适的具有明显差异的受体菌的情况下，检测重组子可以通过快速抽提，酶 切鉴定或菌落原位杂交等方法。 4．选择能够发展感受态细胞的菌株做受体菌 所谓感受态就是受体菌具有能接受外源 DNA(周围环境中的 DNA 分子)能力的一种生理 状态。在细菌中能够发展感受态的细胞是很少的，一般认为占细菌总数的 0.1％～1％，而且