PCR反应体系（25uL）10×PCR缓冲液2.5μL2mmol/LdNTPs2.5μL25mmol/LMgCl22.5μL12.5pmol/L上游引物1.0μL12.5pmol/L下游引物1.0μL1.0μL100-200ng/L模板DNA0.5UTaqDNA聚合酶ddH,O加至25μL在冰上配制PCR反应物溶液。振荡混匀，短时离心。2.PCR扩增反应按以下步骤分别在PCR仪中进行30个循环的PCR扩增反应：95℃预变性5min95℃变性30s63.8℃退火30s30个循环72℃延伸45s72℃延伸10min4℃保存3.结果检测用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。五、注意事项：1、加样时要精确用移液器；2、检查PCR仪是否热盖；3、试剂冰浴融化后要离心；4、分装后需离心均匀。六、思考题1.PCR效率的高低取决于什么？2.为什么要稀释引物？3.PCR反应必须热盖吗？为什么？10
10 PCR 反应体系（25 uL） 10×PCR 缓冲液 2.5L 2mmol/L dNTPs 2.5L 25 mmol/L MgCl2 2.5L 12.5pmol/L 上游引物 1.0L 12.5pmol/L 下游引物 100-200ng/L 模板 DNA 1.0L 1.0L Taq DNA 聚合酶 0.5U ddH2O 加至 25L 在冰上配制 PCR 反应物溶液。振荡混匀，短时离心。 2. PCR 扩增反应 按以下步骤分别在 PCR 仪中进行 30 个循环的 PCR 扩增反应： 95℃ 预变性 5min 95℃ 变性 30s 63.8℃ 退火 30s 30 个循环 72℃ 延伸 45s 72℃ 延伸 10min 4℃ 保存 3. 结果检测 用琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物。 五、注意事项： 1、加样时要精确用移液器； 2、检查 PCR 仪是否热盖； 3、试剂冰浴融化后要离心； 4、分装后需离心均匀。 六、思考题 1. PCR 效率的高低取决于什么？ 2. 为什么要稀释引物？ 3. PCR 反应必须热盖吗？为什么？
实验二水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA一、实验目的学习水平式琼脂糖凝胶电泳，检测DNA的纯度，DNA的构型，含量以及分子量的大小二、实验原理这是基因工程操作中最常规的实验方法，它简便易行，只需少量的DNA就能检测。电泳后的凝胶结果，通过漠化乙啶染色，然后与已知分子大小和含量的DNAMarker比较，则不仅可比较准确的估算出样品DNA的含量，还可估算出其分子量的大小，在提取的DNA样品不太纯的情况下，该法甚至比分光光度比色法还要准确。其原理是漠化乙锭在紫外光照射下能发射荧光，当DNA样品在琼脂糖凝胶中电泳时，琼脂糖凝胶中的EB就插入DNA分子中形成荧光络合物；使DNA发射的荧光增强几十倍。而荧光的强度正比于DNA的含量，如将已知浓度的标准样品作琼脂糖凝胶电泳对照，就可比较出待测样品的浓度。电泳后的琼脂糖凝胶块直接在紫外灯照射下拍照，只需要5～10ngDNA，就可以从照片上比较鉴别。如肉眼观察，可检测到0.010.1uμg的DNA。现在用核酸染料代替EB，污染减少。在凝胶电泳中，DNA分子的迁移速度与分子量的对数值成反比关系。质粒DNA样品用单一切点的限制性内切酶酶切处理后，再与已知分子量大小的标准DNA片段进行电泳对照，观察其迁移距离，就可获知该样品的分子量大小。凝胶电泳不仅可以分离不同分子量的DNA，也可以鉴别分子量相同，但构型不同的DNA分子。在抽提质粒DNA过程中，由于各种因素的影响，使超螺旋的共价闭合环状结构的质粒DNA(SC)的一条链断裂，变成开环状(OC)分子，如果二条链发生断裂，就转变为线状(L）分子。这三种构型的分子有不同的迁移率。在一般情况下，超螺旋型(SC)迁移速度最快，其次为线状(L)分子，最慢的为开环状(OC)分子。提取到的质粒DNA样品中还有染色体DNA或RNA，在琼脂凝胶电泳上也可以分别观察到电泳区带，由此可分析样品的纯度。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应，前者由分子所带净电荷量的多少而定，后者则主要与分子大小及其构型有关。DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电荷，在电场中向正极移动，在用电泳法测定DNA分子大小时，应当尽量减少电荷效应。增加凝胶的浓度可以在一定程度上降低电荷效应，使分子的迁移速度主要由分子受凝胶阻滞程度的差异所决定，提高分辨率。同时适当减低电泳时的电压，也可使分子筛效应相对增强而提高分辨率。11
11 实验二 水平式琼脂糖凝胶电泳法检测 DNA 一、实验目的 学习水平式琼脂糖凝胶电泳，检测 DNA 的纯度，DNA 的构型，含量以及分子量的大小。 二、实验原理 这是基因工程操作中最常规的实验方法，它简便易行，只需少量的 DNA 就能检测。电 泳后的凝胶结果，通过溴化乙啶染色，然后与已知分子大小和含量的 DNA Marker 比较，则 不仅可比较准确的估算出样品 DNA 的含量，还可估算出其分子量的大小，在提取的 DNA 样 品不太纯的情况下，该法甚至比分光光度比色法还要准确。其原理是溴化乙锭在紫外光照射 下能发射荧光，当 DNA 样品在琼脂糖凝胶中电泳时，琼脂糖凝胶中的 EB 就插入 DNA 分子 中形成荧光络合物；使 DNA 发射的荧光增强几十倍。而荧光的强度正比于 DNA 的含量，如 将已知浓度的标准样品作琼脂糖凝胶电泳对照，就可比较出待测样品的浓度。电泳后的琼脂 糖凝胶块直接在紫外灯照射下拍照，只需要 5～10ng DNA，就可以从照片上比较鉴别。如肉 眼观察，可检测到 0.0l～0.1 µg 的 DNA。现在用核酸染料代替 EB，污染减少。 在凝胶电泳中，DNA 分子的迁移速度与分子量的对数值成反比关系。质粒 DNA 样品用 单一切点的限制性内切酶酶切处理后，再与已知分子量大小的标准 DNA 片段进行电泳对照， 观察其迁移距离，就可获知该样品的分子量大小。凝胶电泳不仅可以分离不同分子量的 DNA， 也可以鉴别分子量相同，但构型不同的 DNA 分子。在抽提质粒 DNA 过程中，由于各种因素 的影响，使超螺旋的共价闭合环状结构的质粒 DNA(SC)的一条链断裂，变成开环状(OC)分子， 如果二条链发生断裂，就转变为线状(L)分子。这三种构型的分子有不同的迁移率。在一般情 况下，超螺旋型(SC)迁移速度最快，其次为线状(L)分子，最慢的为开环状(OC)分子。 提取到的质粒 DNA 样品中还有染色体 DNA 或 RNA，在琼脂凝胶电泳上也可以分别观 察到电泳区带，由此可分析样品的纯度。 DNA 分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应，前者由分子所带净电荷量 的多少而定，后者则主要与分子大小及其构型有关。DNA 分子在高于其等电点的溶液中带负 电荷，在电场中向正极移动，在用电泳法测定 DNA 分子大小时，应当尽量减少电荷效应。 增加凝胶的浓度可以在一定程度上降低电荷效应，使分子的迁移速度主要由分子受凝胶阻滞 程度的差异所决定，提高分辨率。同时适当减低电泳时的电压，也可使分子筛效应相对增强 而提高分辨率
三、实验材料与仪器水平电泳槽，微波炉，天平，移液器，100mL或250mL锥形瓶，量筒，吸头，PE手套，BIO-RAD凝胶成像系统。1.cDNA产物，琼脂糖，荧光染料2.10xTAE缓冲液：24.2gTris碱，5.71mL冰乙酸，10ml0.5mol/LEDTA(pH8.0)，定容至5000mL，高压灭菌，用时可稀释为10倍用。3.漠酚蓝电泳加样缓冲液：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF，40%(W/V)蔗糖水溶液。4.DNA标准marker五、实验步骤（一）制胶1.按照被分离DNA分子的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量。一般情况下，可参考下表：琼脂糖的含量及分离线状DNA分子的有限范围0.3%60~5(Kb)0.6%20~1 (Kb)0.7%10~0.8(Kb)0.9%7~0.5(Kb)1.2%6~0.4 (Kb)1.5%4~0.2(Kb)2.0%3~0.1 (Kb)例：称取0.2g琼脂糖，放入三角瓶中，加入20mL1×TAE缓冲液（大电泳槽约160mL小电泳槽约35mL凝胶液，等比扩容即可），置微波炉中加热至完全熔化3次，取出摇匀，则为1%琼脂糖凝胶液。2.取有机玻璃内槽，洗净，晾干，形成一个模具。3.将有机玻璃内槽放置于一水平位置，选择孔径大小适宜的点样梳，垂直架在固定位置，使点样梳底部离电泳胶内槽水平面的距离为0.5~1.0mm。4.待琼脂糖凝胶液冷却到60℃左右时，加入荧光染料，摇匀，缓缓倒入有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面（注意不要形成气泡）。5.室温下静置直至凝胶完全凝固（室温下30～45min）。同时选择合适的水平式的电泳仪，调节电泳槽平面至水平，检查稳压电源与正负极的线路。6.将铺有凝固凝胶的有机玻璃内槽放置在水平电泳仪中，确保点样孔在仅负极一侧。加入0.5xTAE电泳缓冲液至电泳槽中，使缓冲液没过胶面约1mm。垂直轻拨梳子，保证点样12
12 三、实验材料与仪器 水平电泳槽，微波炉，天平，移液器，100 mL 或 250 mL 锥形瓶，量筒，吸头，PE 手套， BIO-RAD 凝胶成像系统。 1. cDNA 产物， 琼脂糖，荧光染料 2. l0×TAE 缓冲液：24.2g Tris 碱，5.71mL 冰乙酸，l0ml 0.5mol/L EDTA (pH8.0)，定容至 5000mL，高压灭菌，用时可稀释为 10 倍用。 3．溴酚蓝电泳加样缓冲液：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青 FF，40%(W/V)蔗糖水溶液。 4．DNA 标准 marker 五、实验步骤 （一）制胶 1.按照被分离 DNA 分子的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量。一般情况下，可参考 下表： 琼脂糖的含量及分离线状 DNA 分子的有限范围 0.3% 60~5（Kb） 0.6% 20~1（Kb） 0.7% 10~0.8（Kb） 0.9% 7~0.5（Kb） 1.2% 6~0.4（Kb） 1.5% 4~0.2（Kb） 2.0% 3~0.1（Kb） 例：称取 0.2 g 琼脂糖，放入三角瓶中，加入 20 mL 1× TAE 缓冲液（大电泳槽约 160mL 小电泳槽约 35mL 凝胶液，等比扩容即可），置微波炉中加热至完全熔化 3 次，取出摇匀，则 为 1％琼脂糖凝胶液。 2. 取有机玻璃内槽，洗净，晾干，形成一个模具。 3. 将有机玻璃内槽放置于一水平位置，选择孔径大小适宜的点样梳，垂直架在固定位置， 使点样梳底部离电泳胶内槽水平面的距离为 0.5～1.0mm。 4. 待琼脂糖凝胶液冷却到 60℃ 左右时，加入荧光染料，摇匀，缓缓倒入有机玻璃内槽， 直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面（注意不要形成气泡）。 5. 室温下静置直至凝胶完全凝固（室温下 30～45 min）。同时选择合适的水平式的电泳 仪，调节电泳槽平面至水平，检查稳压电源与正负极的线路。 6. 将铺有凝固凝胶的有机玻璃内槽放置在水平电泳仪中，确保点样孔在仅负极一侧。加 入 0.5×TAE 电泳缓冲液至电泳槽中，使缓冲液没过胶面约 1 mm。垂直轻拔梳子，保证点样
孔完好；如点样孔中有气泡，可用吸管吸去。(二）加样在点样板或PE手套上混合15μLDNA样品和上样缓冲液，上样缓冲液的最终稀释数应不小于1×。待测的DNA和Marker样品中，加1/5体积的漠酚蓝指示剂。混匀后小心地用10uL微量移液器进行点样，每加完一个样品，应更换一个枪头，以防污染。加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面，注意记录样品点样秩序与点样量。(三）电泳1.接通电泳槽与电泳仪的电源，DNA片段从负极（黑色插头）向正极（红色插头）移动）。DNA的迁移速度与电压成正比，但电压升高使琼脂糖凝胶的有效分离范围降低，因此，最高电压不超过5V/cm（大电泳槽不超过200V，小电泳槽不超过150V）。2.当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1-2cm处，停止电泳。3.254nm紫外灯下观察琼脂糖凝胶中的带（戴手套操作），采用凝胶成像系统拍照保存。注意事项：1.电泳槽正负极。2.注意电压。3.注意琼脂糖的比例。4.点样时注意不要戳破凝胶。5.制作凝胶时务必加核酸染料，且在40～50℃时加最适宜。六、思考题1.PCR电泳图出现拖尾、扫尾、空白处背景高是什么原因？解释一下这种现象。2.PCR电泳图出现几条条带？分别有什么意义？3.核酸染料是什么物质？作用原理？loadingbuffer的作用是什么？13
13 孔完好；如点样孔中有气泡，可用吸管吸去。 (二) 加样 在点样板或 PE 手套上混合 15 μL DNA 样品和上样缓冲液，上样缓冲液的最终稀释数应 不小于 1×。待测的 DNA 和 Marker 样品中，加 1/5 体积的溴酚蓝指示剂。混匀后小心地用 10μL 微量移液器进行点样，每加完一个样品，应更换一个枪头，以防污染。加样时勿碰坏样品孔 周围的凝胶面，注意记录样品点样秩序与点样量。 (三) 电泳 1. 接通电泳槽与电泳仪的电源，DNA 片段从负极（黑色插头）向正极（红色插头）移 动）。DNA 的迁移速度与电压成正比，但电压升高使琼脂糖凝胶的有效分离范围降低，因此， 最高电压不超过 5V/cm（大电泳槽不超过 200V，小电泳槽不超过 150V）。 2. 当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿 1-2cm 处，停止电泳。 3. 254nm 紫外灯下观察琼脂糖凝胶中的带（戴手套操作），采用凝胶成像系统拍照保存。 注意事项： 1. 电泳槽正负极。 2. 注意电压。 3. 注意琼脂糖的比例。 4. 点样时注意不要戳破凝胶。 5. 制作凝胶时务必加核酸染料，且在 40～50℃时加最适宜。 六、思考题 1. PCR 电泳图出现拖尾、扫尾、空白处背景高是什么原因？解释一下这种现象。 2. PCR 电泳图出现几条条带？分别有什么意义？ 3. 核酸染料是什么物质？作用原理？loading buffer 的作用是什么？
实验三DNA的重组连接一、实验目的1.了解T4DNA连接酶的几种生物学功能及用途。2.学习在T4DNA连接酶的作用下，载体与目的基因的几种不同的连接方式以及在标准的连接反应体系中，质粒载体和插入的外源DNA的比率关系和各自的用量。3.掌握用pMD18-TVector与PCR产物进行T-A克隆的机理及其应用。二、实验原理（一）T4DNA连接酶在有Mg+、ATP存在的T4DNA连接酶反应缓冲液中，T4DNA连接酶不仅能催化具相同粘性未端或者是平未端的双链DNA分子的连接反应，而且能催化RNA分子与双链DNA分子或双链RNA分子的连接反应；基于T4DNA连接酶的上述生物学功能，在基因克隆过程中，T4DNA连接酶常用于将不同形式的双链分子连接在一起，而构成重组的DNA分子；有时也用来将RNA分子与双链的DNA分子进行连接，构成RNA-DNA分子的嵌合体。用T4DNA连接酶对DNA进行重组连接，常存在以下三种方式：1.具相同突出未端的两段DNA分子的连接反应，如：用相同的限制性内切酶处理的载体分子和目的基因之间的连接反应。此时，为防正载体分子的自身连接，载体DNA分子常用磷酸酶处理后再用于连接反应。2.具平齐末端的两段DNA分子的连接反应，此时，要求高浓度的DNA分子及T4DNA连接酶。3.具不同突出末端的两段DNA分子的连接反应，如：用两种限制性内切酶分别对载体分子和目的DNA片段进行处理，则载体分子的两个未端分别形成不同的粘性尾巴，从而使得载体分子不能自身环化，但载体分子的两个粘性尾巴分别能在目的DNA片段中找到互补配对的粘性未端，在T4DNA连接酶的作用下，目的基因能按一定的方向克隆到载体分子中，从而实现所谓的定向克隆。通过一系列的研究发现，在一个连接反应体系中，载体DNA与插入的目的DNA之间的比率将直接影响到连接的效率，通常情况下，载体DNA与目的DNA以1：3的摩尔比混合，将获得较高的连接效率；而一个典型的连接反应体系中，载体DNA的用量是100-200ng，此时，可根据下列公式计算插入DNA的用量：14
14 实验三 DNA 的重组连接 —、实验目的 1.了解 T4 DNA 连接酶的几种生物学功能及用途。 2.学习在 T4 DNA 连接酶的作用下，载体与目的基因的几种不同的连接方式以及在标准 的连接反应体系中，质粒载体和插入的外源 DNA 的比率关系和各自的用量。 3.掌握用 pMDl8-T Vector 与 PCR 产物进行 T-A 克隆的机理及其应用。 二、实验原理 （一）T4 DNA 连接酶 在有 Mg2+、ATP 存在的 T4 DNA 连接酶反应缓冲液中，T4 DNA 连接酶不仅能催化具相 同粘性末端或者是平末端的双链 DNA 分子的连接反应，而且能催化 RNA 分子与双链 DNA 分子或双链 RNA 分子的连接反应；基于 T4 DNA 连接酶的上述生物学功能，在基因克隆过程 中，T4 DNA 连接酶常用于将不同形式的双链分子连接在一起，而构成重组的 DNA 分子；有 时也用来将 RNA 分子与双链的 DNA 分子进行连接，构成 RNA-DNA 分子的嵌合体。 用 T4 DNA 连接酶对 DNA 进行重组连接，常存在以下三种方式： 1. 具相同突出末端的两段 DNA 分子的连接反应，如：用相同的限制性内切酶处理的载 体分子和目的基因之间的连接反应。此时，为防止载体分子的自身连接，载体 DNA 分子常 用磷酸酶处理后再用于连接反应。 2. 具平齐末端的两段 DNA 分子的连接反应，此时，要求高浓度的 DNA 分子及 T4 DNA 连接酶。 3. 具不同突出末端的两段 DNA 分子的连接反应，如：用两种限制性内切酶分别对载体分 子和目的 DNA 片段进行处理，则载体分子的两个末端分别形成不同的粘性尾巴，从而使得载 体分子不能自身环化，但载体分子的两个粘性尾巴分别能在目的 DNA 片段中找到互补配对 的粘性末端，在 T4 DNA 连接酶的作用下，目的基因能按一定的方向克隆到载体分子中，从 而实现所谓的定向克隆。 通过一系列的研究发现，在一个连接反应体系中，载体 DNA 与插入的目的 DNA 之间的 比率将直接影响到连接的效率，通常情况下，载体 DNA 与目的 DNA 以 1：3 的摩尔比混合， 将获得较高的连接效率；而一个典型的连接反应体系中，载体 DNA 的用量是 100-200ng，此 时，可根据下列公式计算插入 DNA 的用量：