m为微粒质量，v为体积，a为离心加速度，a为液体密度，r为园周运动半径，为角速度。当微粒密度大于介质密度时，微粒便沿着切线方向运动一…—-离心沉降。介质密度越小，离心沉降越快：另外，微粒运动也受离心机转速影响，转速越快，离心力场越大，沉降越快。离心力场（F离心）除与转速有关外，也与半径有关。:@=v/r,V=2rJN/60.F离心=@=(2mN/60)2.4m"Nr/3600式中为角速度，N为每分转速(rpm）将离心力场与重力加速度相比较，即得出相对离心力（RCF)，以“×Xg”表示离心力场大小。RCF=F 高心/F 量力= 4升 (N /60)” r/g=11. 8X10× NXr(g)以转速表示离心力，是忽略离心机半径的一种简单表示法，适用于低速离心分析。因此时半径的差异对RCF值影响较小些，而在高速离心，影响则很大，举例如下：设同样转速为20000rpm，在半径分别为10cm和6cm的两类离心机中，产生的RCF分别为：RCF1 =44715gRCF2=26828g同理，同一离心管中，微粒处于不同高度，其实际半径不一，则RCF值差异。在实验时，往往需要将预设的相对离心力换算成所使用的离心机的转速（rpm），此时可按下式运算：rpm~300/RCF/r例：设RCF为24000Xg，离心机半径为8cm，求转速。Rpm=164322.沉降系数由于微粒的质量取决于密度（d）和体积（v）的乘积（mvd）。而离心时，微粒是处于介质内作相对运动。所以，微粒与介质在同样的离心力（F)作用下，微粒的沉降速度（V)取决于微粒(d)密度与介质的（d'）密度差。当d=d'时，V=0，微粒保持原位；d>d'时，则V>0，微粒朝向离心方向运动；而d<d时，V<0，微粒作向心运动。沉降系数单位（Svedbergunit，简称S)，即为微粒在单位离心力作用下的沉降速度，量纲为秒。1S单位等于1X10°秒。沉降系数与物质质点的大小，形状，密度及介质的密度和粘度等因素有关。在介质条件一定时，沉降系数即与分子量有关。所以，对一些生物高分子或亚细胞器组分的化学结构，分子量还不太清楚时，可用沉降系数对它们的物理特性作初步描述。例如大肠杆菌核蛋白体是70s；某些病毒有16sRNA、23SRNA等。据此，可依据Svedberg公式计算物质近似的分子量，也可按经验公式计算：2.1Mr=1100s2.2或Mr=1550s3.离心机的类型：按离心方式，可分为倾角式和水平式两种。倾角式系指离心管与轴成45～50°角。离心11
11 m 为微粒质量，v 为体积，a 为离心加速度，σ为液体密度，r 为园周运动半径，ω为角 速度。 当微粒密度大于介质密度时，微粒便沿着切线方向运动-离心沉降。介质密度越小， 离心沉降越快；另外，微粒运动也受离心机转速影响，转速越快，离心力场越大，沉降越快。 离心力场(F 离心)除与转速有关外，也与半径有关。 ∵ω = v/r, v = 2rлN/60 ∴F 离心 =ω 2 r = (2лN/60) 2 . 4л 2 N 2 r/3600 式中ω为角速度，N 为每分转速(rpm) 将离心力场与重力加速度相比较，即得出相对离心力(RCF)，以“××g”表示离心力场 大小。 RCF=F 离心/F 重力= 4л 2 ( N /60)2 r/g =11.8╳10 -6 ╳ N 2 ╳r(g) 以转速表示离心力，是忽略离心机半径的一种简单表示法，适用于低速离心分析。因此 时半径的差异对 RCF 值影响较小些，而在高速离心，影响则很大，举例如下： 设同样转速为 20000rpm，在半径分别为 10cm 和 6cm 的两类离心机中，产生的 RCF 分别 为： RCF1 =44715g RCF2 =26828g 同理，同一离心管中，微粒处于不同高度，其实际半径不一，则 RCF 值差异。 在实验时，往往需要将预设的相对离心力换算成所使用的离心机的转速(rpm)•，此时可 按下式运算： rpm≈300√RCF/r 例：设 RCF 为 24000×g，离心机半径为 8cm，求转速。 Rpm=16432 2.沉降系数 由于微粒的质量取决于密度(d)•和体积(v)的乘积(m＝vd)。而离心时，微粒是处于介质 内作相对运动。所以，微粒与介质在同样的离心力(F)作用下，微粒的沉降速度(V)取决于微 粒(d)密度与介质的(d')密度差。当 d＝d'时，V＝0，微粒保持原位；d>d'时，则 V>0，微粒 朝向离心方向运动；而 d<d'时，V<0，微粒作向心运动。 沉降系数单位(Svedberg unit,简称 S)，即为微粒在单位离心力作用下的沉降速度，量 纲为秒。1S 单位等于 1×10 -13 秒。 沉降系数与物质质点的大小，形状，密度及介质的密度和粘度等因素有关。在介质条件 一定时，沉降系数即与分子量有关。所以，对一些生物高分子或亚细胞器组分的化学结构， 分子量还不太清楚时，可用沉降系数对它们的物理特性作初步描述。例如大肠杆菌核蛋白体 是 70s；某些病毒有 16sRNA、23SRNA 等。 据此，可依据 Svedberg 公式计算物质近似的分子量，也可按经验公式计算： Mr=1100s 2.2 或 Mr=1550S 2.1 3.离心机的类型： 按离心方式，可分为倾角式和水平式两种。倾角式系指离心管与轴成 45～50°角。离心
时微粒沿管壁沿降，移动距离较短，沉淀较快：水平式的优点是沉淀平齐，使用刻度离心管时可测读容积。按离心机最大速度，又可分低速离心机（<1万rpm），高速记心机（1～4万rpm）及超速离心机（>4万rpm）。由于超、高速离心机运转时会产生大量热，会使样品变质（如酶蛋白失活）。故，超、高速离心机都备有冷却系统，称冷冻离心机。超速高心机尚有抽气设备以减少运转阻力。4.使用离心机注意事项：（1)离心机要放置平稳，套筒内备有软垫，不得有异物。(2)样品连同套筒务必对称，平衡。可加水于套筒内，置天平上平衡。(3)接通电源前，检查调速旋钮，务必放在零位。接通电源后，逐渐加速。减速时，不得以外力助停。5.差速离心法：低速和高速离心交替进行，使具不同质量的物质分批分离的方法。适用于分子量或沉降系数判别较大的混合物的分离。如亚细胞结构、细胞核、线粒体和微粒体的彼此分离。6.密度梯度离心（1）速度区带离心法选择合适的介质在离心管中形成一个密度从底部到顶部由大到小连续或不连续变化的密度梯度。待分离组份因颗粒大小和沉降速度不同，离心后，在密度梯度的不同位置上分别形成界面清楚的不连续区带，有时也称区带离心法。(2）等密度离心法混合样品在连续变化的密度梯度介质中进行离心，因样品中不同组份间存在着密度差，离心过程中，各种组份按密度大小不同而移到与自已密度相等的位置上形成区带。区带的位置，形状不因离心时间而改变。12
12 时微粒沿管壁沿降，移动距离较短，沉淀较快；水平式的优点是沉淀平齐，使用刻度离心管 时可测读容积。 按离心机最大速度，又可分低速离心机(<1 万 rpm)，高速记心机(1～4 万 rpm)及超速离 心机( > 4 万 rpm)。由于超、高速离心机运转时会产生大量热，会使样品变质(如酶蛋白失活)•。 故，超、高速离心机都备有冷却系统，称冷冻离心机。超速高心机尚有抽气设备以减少运转 阻力。 4.使用离心机注意事项： (1)离心机要放置平稳，套筒内备有软垫，不得有异物。 (2)样品连同套筒务必对称，平衡。可加水于套筒内，置天平上平衡。 (3)接通电源前，检查调速旋钮，务必放在零位。接通电源后，逐渐加速。减速时，不得 以外力助停。 5.差速离心法： 低速和高速离心交替进行，使具不同质量的物质分批分离的方法。适用于分子量或沉降 系数判别较大的混合物的分离。如亚细胞结构、细胞核、线粒体和微粒体的彼此分离。 6.密度梯度离心 (1)速度区带离心法 选择合适的介质在离心管中形成一个密度从底部到顶部由大到小连续或不连续变化的密 度梯度。待分离组份因颗粒大小和沉降速度不同，离心后，在密度梯度的不同位置上分别形 成界面清楚的不连续区带，有时也称区带离心法。 (2)等密度离心法 混合样品在连续变化的密度梯度介质中进行离心，因样品中不同组份间存在着密度差， 离心过程中，各种组份按密度大小不同而移到与自己密度相等的位置上形成区带。区带的位 置，形状不因离心时间而改变
、、蛋白质定性、定量实验实验一蛋白质等电点的测定[实验目的]了解沉淀法测蛋白质等电点的原理与方法[实验原理]在一定的pH溶液中，如果蛋白质分子所带正电荷与负电荷相等，则此时溶液的pH值称为蛋白质的等电点。蛋白质在等电点时，溶解度最小。每种蛋白质有各自的等电点。本实验观察酪蛋白在不同的pH溶液中的溶解度，根据沉淀多少，判断其等电点。[药品、试剂]①5g/L酪蛋白醋酸钠溶液：称取酪蛋白0.25g、置于50ml容量瓶中，加蒸馏水20ml及1.00mol/L氢氧化钠5ml（必须准确）。振摇使酪蛋白溶解，然后准确加1.00mo1/L醋酸溶液5ml，最后加蒸馏水至50ml刻度。②1mo1/LHAc溶液③0.10no1/LHAc溶液④0.01mo1/LHAc溶液[方法步骤]取同样大小的干洁大试管5支，标明号码，按下表分别准确加入各试剂：23145试剂(ml)蒸馏水5. 07.48.388.758.00.62-0.01mo1/LHAc0. 251.04. 00.1mo1/L HAc--1.61. Omol/L HAc一-1.01.01. 01. 01. 0酪蛋白醋酸钠摇匀后，静置约20分钟，观察结果。记录各管混浊程度（十～十十十+），沉淀量最多者的pH值即为酪蛋白的等电点。[注]1.各管缓冲液的pH值按Hendersen-Hasselbaloh氏公式计算：pH=pK+1g【碱】／【酸】。醋酸的pK=4.72.等电聚焦电泳法测等电点较此法精确。[思考与讨论]维持蛋白质胶体溶液稳定的因素有哪些？为什么蛋白质在等电点时溶解度最小？(黄瑾、彭小玲）实验二微量凯氏定氮法[实验目的]掌握定氮法测蛋白质含量的原理和方法[实验原理]蛋白质是机体内最主要的含氮物质，且含氮量较为恒定，平均含量为16%，故测生物样品的含氮量，即可推算其蛋白质的含量。样品中的蛋白质先经浓硫酸加热消化后，蛋白质中的氮转变成（NH4)2SO4，经NaOH作用，13
13 一 、蛋白质定性、定量实验 实验一 蛋白质等电点的测定 [实验目的] 了解沉淀法测蛋白质等电点的原理与方法 [实验原理] 在一定的 pH 溶液中，如果蛋白质分子所带正电荷与负电荷相等，则此时溶液的 pH 值称 为蛋白质的等电点。蛋白质在等电点时，溶解度最小。每种蛋白质有各自的等电点。本实验 观察酪蛋白在不同的 pH 溶液中的溶解度，根据沉淀多少，判断其等电点。 [药品、试剂] ①5g/L 酪蛋白醋酸钠溶液： 称取酪蛋白 0.25g、置于 50ml 容量瓶中，加蒸馏水 20ml 及 1.00mol/L 氢氧化钠 5ml(必须准确)•。振摇使酪蛋白溶解，然后准确加 1.00mol/L 醋酸溶 液 5ml，最后加蒸馏水至 50ml 刻度。 ②1mol/LHAc 溶液 ③0.10nol/LHAc 溶液 ④0.01mol/LHAc 溶液 [方法步骤] 取同样大小的干洁大试管 5 支，标明号码，按下表分别准确加入各试剂： ─────────────────────────── 试剂(ml) 1 2 3 4 5 ─────────────────────────── 蒸馏水 8.38 8.75 8.0 5.0 7.4 0.01mol/L HAc 0.62 - - - - 0.1mol/L HAc - 0.25 1.0 4.0 - 1.0mol/L HAc - - - - 1.6 酪蛋白醋酸钠 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 ──────────────────────────── 摇匀后，静置约 20 分钟，观察结果。 记录各管混浊程度(＋～＋＋＋＋)，沉淀量最多者的 pH 值即为酪蛋白的等电点。 [注]1.各管缓冲液的 pH 值按 Hendersen-Hasselbaloh 氏公式计算： pH＝pK＋lg【碱】/【酸】。 醋酸的 pK＝4.7 2.等电聚焦电泳法测等电点较此法精确。 [思考与讨论] 维持蛋白质胶体溶液稳定的因素有哪些？为什么蛋白质在等电点时溶解度最小？ (黄瑾、彭小玲) 实验二 微量凯氏定氮法 [实验目的] 掌握定氮法测蛋白质含量的原理和方法 [实验原理] 蛋白质是机体内最主要的含氮物质，且含氮量较为恒定，平均含量为 16％，故测生物样 品的含氮量，即可推算其蛋白质的含量。 样品中的蛋白质先经浓硫酸加热消化后，蛋白质中的氮转变成(NH4)2SO4，经 NaOH 作用
再蒸馏释出氨，氨用硼酸吸收，最后用标准盐酸溶液滴定，测知被NH3中和的酸量，以计算出样品中氮量。消化：含氮有机物+H2S04--→C02t+H20+S03++（NH4)2S04蒸馏：（NH4)2S04+2NaOH--2NH40H+Na2S04NH40H---NH3 1 +H20吸收：3NH3+H3B03--→(NH4)3BO3滴定：（NH4)3B03+3HCI---3NH4CI+H3BO3消化中加入硫酸铜作催化剂，加入硫酸钾或硫酸钠提高消化液的沸点，以加快反应速度。本法测定样品的含氮量以1mg/ml左右为佳。【药品、试剂]①浓硫酸（化学纯)②催化剂：硫酸铜，硫酸钾或硫酸钠。（固体粉末之比为3：1）③20g/L硼酸10mo1/LNaoH（分析纯）③0.02mo1/LHCI③混合指示剂：1g/L溴甲酚绿乙醇液10ml与1g/L甲基红乙醇2ml混合而成。[方法步骤]1.消化取凯氏烧瓶准确加入血清0.1ml至瓶底，浓硫酸1ml，混合催化剂1份，微火加热，待水分蒸干后可见有白烟发生，溶液逐渐变黑，不时转动烧瓶，保持受热均匀，控制火力，使溶液轻轻沸腾，至溶液呈透明的浅绿色时停止加热，冷却。2.蒸馏：（1)蒸馏系统先经水洗涤，再经水蒸气洗涤，以除去冷凝管中可能残留的氨用硼酸吸收接上冷水源。(2)干洁50ml锥形瓶中加入20g/L硼酸溶液10ml，滴入混合指示剂2滴，将它放在冷凝管出口处，使冷凝管口浸入硼酸液面以下。(3)从漏斗上加入已消化好的样品至反应室，再用蒸馏水2ml清洗凯氏烧瓶，亦倾入反应室，如此洗两次。(4)从漏斗上加入10mo1/LNaoH10ml，令碱液慢慢流入反应室，尚未完全流入时，夹紧夹子，再从漏斗加蒸馏水5ml，使一半蒸馏水流入反应室，另一半留在漏斗中作水封。(5)保持蒸气发生器沸腾状态，注意控制火力，防止溶液倒吸入反应室，直至硼酸溶液由蓝紫色变为蓝绿色，继续蒸馏5分钟，然后使冷凝管口离开锥形瓶中液面约1cm，继续蒸馏1分钟，取下锥形瓶。3.滴定：以0.02mo1/LHCI滴定锥形瓶中溶液，至淡紫色为止。记录滴定所用的HCI量。4.空白对照：用蒸馏水代替血清标本，做同样操作记录滴定空白所用的HCI量。[计算]每ml0.02mo1/LHCI~0.28mg氮血清中总氮量（g/L）=（样品滴定ml数-空白滴定ml数）X0.280.1血清蛋白含量（g/L）（血清总氮量一非蛋白氮）×6.25[思考与讨论]1.本实验为什么要测定空白管？14
14 再蒸馏释出氨，氨用硼酸吸收，最后用标准盐酸溶液滴定，测知被 NH3 中和的酸量，以计算 出样品中氮量。 消化：含氮有机物＋H2SO4-→CO2↑＋H2O＋SO3↑＋(NH4)2SO4 蒸馏：(NH4)2SO4＋2NaOH-→2NH4OH＋Na2SO4 NH4OH-→NH3↑＋H2O 吸收：3NH3＋H3BO3-→(NH4)3BO3 滴定：(NH4)3BO3＋3HCI-→3NH4CI＋H3BO3 消化中加入硫酸铜作催化剂，加入硫酸钾或硫酸钠提高消化液的沸点，以加快反应速度。 本法测定样品的含氮量以 1mg/ml 左右为佳。 [药品、试剂] ①浓硫酸(化学纯) ②催化剂：硫酸铜，硫酸钾或硫酸钠。(固体粉末之比为 3:1) ③20g/L 硼酸 ④10mol/LNaoH(分析纯) ⑤0.02mol/L HCI ⑥混合指示剂：1g/L 溴甲酚绿乙醇液 10ml 与 1g/L 甲基红乙醇 2ml 混合而成。 [方法步骤] 1.消化 取凯氏烧瓶准确加入血清 0.1ml 至瓶底， 浓硫酸 1ml，混合催化剂 1 份，微火加热， 待水分蒸干后可见有白烟发生，溶液逐渐变黑，不时转动烧瓶，保持受热均匀，控制火力， 使溶液轻轻沸腾，至溶液呈透明的浅绿色时停止加热，冷却。 2.蒸馏： ⑴蒸馏系统先经水洗涤，再经水蒸气洗涤，以除去冷凝管中可能残留的氨用硼酸吸收接 上冷水源。 ⑵干洁 50ml 锥形瓶中加入 20g/L 硼酸溶液 10ml，滴入混合指示剂 2 滴，将它放在冷凝 管出口处，使冷凝管口浸入硼酸液面以下。 ⑶从漏斗上加入已消化好的样品至反应室， 再用蒸馏水 2ml 清洗凯氏烧瓶，亦倾入反应 室，如此洗两次。 ⑷从漏斗上加入 10mol/LNaoH 10ml，令碱液慢慢流入反应室，尚未完全流入时，夹紧夹 子，再从漏斗加蒸馏水 5ml，使一半蒸馏水流入反应室，另一半留在漏斗中作水封。 ⑸保持蒸气发生器沸腾状态，注意控制火力，防止溶液倒吸入反应室，直至硼酸溶液由 蓝紫色变为蓝绿色，继续蒸馏 5 分钟，然后使冷凝管口离开锥形瓶中液面约 1cm，继续蒸馏 1 分钟，取下锥形瓶。 3.滴定： 以 0.02mol/L HCI 滴定锥形瓶中溶液，至淡紫色为止。记录滴定所用的 HCI 量。 4.空白对照： 用蒸馏水代替血清标本，做同样操作记录滴定空白所用的 HCI 量。 [计算] 每 ml0.02mol/L HCI≈0.28mg 氮 血清中总氮量(g/L)＝ （样品滴定 ml 数-空白滴定 ml 数）×0.28 0.1 血清蛋白含量(g/L)＝(血清总氮量－非蛋白氮)×6.25 [思考与讨论] 1.本实验为什么要测定空白管？
2.写出蛋白质消化蒸馏及滴定三个操作过程中应注意哪些问题？（彭小玲、袁红琳）实验三双缩豚比色法测定蛋白质含量[实验目的]1.学习蛋白质含量的双缩脲定量法。2.掌握光谱光度分析技术。[实验原理]蛋白质具有两个以上肽键结构，它能在碱性溶液中与Cu生成紫红色化合物，此反应称为双缩脲反应。反应物的颜色深浅在一定范围内与蛋白质的浓度成正比，可与用同法处理的标准蛋白液比较，用分光光度计进行比色测定，再计算其浓度。[药品、试剂]①10g/L标准蛋白溶液：收集混合血清，用凯氏定氮法测定蛋白含量，亦可用定值参考血清或标准白蛋白作标准。②154mmp1/LNaCI溶液。③双缩脲试剂：称以未风化的硫酸铜（CuS04·5H20)3g，溶于500ml新鲜蒸馏水，加酒石酸钾钠9g，碘化钾5g，待完全溶解，加入6mo1/LNaOH100ml，最后用蒸馏水稀释至1L。④6mol/LNa0H:240gNa0H加水至1000ml。[方法步骤]一、标准曲线法：1.取试管6支，按下表操作：12345空白试剂(ml)0.10.30. 50.70.910/L标准蛋白液154mol/LNaCI2.42.22. 01. 81.62. 5双缩脲试剂2.52.52.52.52.52.510305070900蛋白质含量(g/L)摇匀，立即放在37℃水浴中保温10分钟。用540nm波长比色，以空白管调零点测得各管吸光度。以吸光度为纵坐标，蛋白质含量为横座标，绘制标准曲线。2.样品测定：取血清0.1ml加154mmo1/LNaCL2.4ml，加双缩脲试剂2.ml，混匀，操作如上，可同上面6管同时操作，测得的吸光度值，查标准曲线得出蛋白质含量。二、单一标准法：取试管3支，按下表操作。摇匀，37℃水浴10分钟。540nm波长比色，空白调零，测得两管吸光度值，计算求出蛋白质含量。试剂(ml)测定标准空白血清0.10.710g/L标准蛋白液-2. 41.82.5154mmo1/LNaCI15
15 2.写出蛋白质消化蒸馏及滴定三个操作过程中应注意哪些问题？ (彭小玲、袁红琳) 实验三 双缩脲比色法测定蛋白质含量 [实验目的] 1.学习蛋白质含量的双缩脲定量法。 2.掌握光谱光度分析技术。 [实验原理] 蛋白质具有两个以上肽键结构，它能在碱性溶液中与 CU 2+生成紫红色化合物，此反应称 为双缩脲反应。反应物的颜色深浅在一定范围内与蛋白质的浓度成正比，可与用同法处理的 标准蛋白液比较，用分光光度计进行比色测定，再计算其浓度。 [药品、试剂] ①10g/L 标准蛋白溶液： 收集混合血清，用凯氏定氮法测定蛋白含量，亦可用定值参考 血清或标准白蛋白作标准。 ②154mmpl/LNaCI 溶液。 ③双缩脲试剂：称以未风化的硫酸铜(CuSO4·5H2O)3g，溶于 500ml 新鲜蒸馏水，加酒石 酸钾钠 9g， 碘化钾 5g，待完全溶解，加入 6mol/L NaOH 100ml，最后用蒸馏水稀释至 1L。 ④6mol/L NaOH:240g NaOH 加水至 1000ml。 [方法步骤] 一、标准曲线法： 1.取试管 6 支，按下表操作： ────────────────────────────────── 试剂(ml) 1 2 3 4 5 空 白 ────────────────────────────────── 10/L 标准蛋白液 0.1 0.3 0.5 0.7 0.9 - 154mol/L NaCI 2.4 2.2 2.0 1.8 1.6 2.5 双缩脲试剂 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 蛋白质含量(g/L) 10 30 50 70 90 0 ────────────────────────────────── 摇匀， 立即放在 37℃水浴中保温 10 分钟。用 540nm 波长比色，以空白管调零点测得各 管吸光度。以吸光度为纵坐标，蛋白质含量为横座标，绘制标准曲线。 2.样品测定：取血清 0.1ml 加 154mmol/L NaCL2.4ml，加双缩脲试剂 2.ml，混匀，操作 如上，可同上面 6 管同时操作，测得的吸光度值，查标准曲线得出蛋白质含量。 二、单一标准法： 取试管 3 支，按下表操作。 摇匀，37℃水浴 10 分钟。540nm 波长比色，空白调零，测得两管吸光度值，计算求出蛋 白质含量。 ───────────────────────────── 试剂(ml) 测 定 标 准 空 白 ───────────────────────────── 血 清 0.1 - - 10g/L 标准蛋白液 - 0.7 - 154mmol/L NaCI 2.4 1.8 2.5