(2)吸附层析氧化铝、硅胶等固相吸附剂，具有吸时其他一些物质的性质。借吸附力差异将混合物分离。吸时力的强弱，不但取决于吸附剂，也与被分离物质有关。吸附层析有柱层析和薄层层析两种。①柱层析：在一支玻璃管下端垫以棉花或玻璃棉。装入吸附剂。用一种溶剂润湿后，在顶部加入样品溶液。在样品进入吸附剂层并形成色圈后，即加入合适的洗脱液。样品中被分离的成分，随着洗脱液下移，因各成分吸附系数不同而得以分离。在洗脱过程中，柱内发生溶解--吸附--再溶解--再吸附-再溶解..·.连续下行过程。吸附系数小的成分容易洗脱，吸附系数大的成分洗脱较慢。样品若为有色成分，则可将吸附柱（剂）从管中顶出，切割下来再分析。现多采用连续加入溶剂，连续分部收集洗脱剂的方法。此尤其适用于无色成分的分离。非极性或极性较弱的有机物质，如葫萝卜素、甘油脂及磷脂等，最适用吸附层析法分离。②薄层层析将吸附剂平铺在玻璃（片）上，分为硬板（加粘合剂)和软板(不加粘合剂)两种。前者制备复杂些，但易保存：后者制备虽简单，吹干时却易散开。通常，是用吸附剂氧化铝G或硅胶G制成硬板（G表示石膏，通常含量为5%），淀粉、羧甲基纤维素纳（CMC)也可作粘合剂制板。(3)离子交换层析离子交换层析的固定相是离子交换剂，利用离子交换剂对需要分离的各种离子有不同的亲和力，使离子在层析柱中移行时达到分离的目的。离子交换层析在柱中进行，由骨架和离子交换基团构成。交换基团为酸性，可与溶液中的阳离子交换，称阳离子交换剂：反之，称阴离子交换剂。常用交换剂如表3。表3常用交换基及类型骨架交换基酸碱性类型树脂强酸性磺酸基(-SO3H)阳离子型纤维素酚羟基(-OH)强酸性阳离子型弱葡聚糖羧基(-COOH)酸性阳离子型季胺基(-NR3OH)强碱性阴离子型性伯胺基(-NH2)弱碱阴离子型弱碱性促胺基(-NHR)阴离子型弱碱性叔胺基(-NR2)阴离子型交换反应例举如下：+HXR-S03H+MX++R-S03-MR4NON+HXR4NX+HOH虽然交换反应都是平衡反应，但在层析柱上进行时，由于交换溶液连续更新，反应朝向正反应进行，直至完全。(4)凝胶层析凝胶有天然（如琼脂糖）和人工合成（如葡聚糖等）两类。凝胶具有网络结构。控制其浓度和交联度，即可控制其网络的孔径。凝胶产品为颗粒状，小分子物质因易进入颗粒的内部网络，洗脱时，流出时间较长，称阻滞较大：大分子物质不能进入网络内，从而经颗粒间隙而流出。途径短，流出时间短，称阻滞小。因能按分子大小将混合物质分离，故也称凝胶过滤或分子筛层析。6
6 (2)吸附层析 氧化铝、硅胶等固相吸附剂，具有吸咐其他一些物质的性质。借吸附力差异将混合物分 离。吸咐力的强弱，不但取决于吸附剂，也与被分离物质有关。吸附层析有柱层析和薄层层 析两种。 ①柱层析：在一支玻璃管下端垫以棉花或玻璃棉。装入吸附剂。用一种溶剂润湿后，在 顶部加入样品溶液。在样品进入吸附剂层并形成色圈后，即加入合适的洗脱液。样品中被分 离的成分，随着洗脱液下移，因各成分吸附系数不同而得以分离。 在洗脱过程中， 柱内发生溶解-吸附-再溶解-再吸附-再溶解.连续下行过程。 吸附系数小的成分容易洗脱，吸附系数大的成分洗脱较慢。样品若为有色成分，则可将吸附 柱(剂)从管中顶出，切割下来再分析。现多采用连续加入溶剂，连续分部收集洗脱剂的方法。 此尤其适用于无色成分的分离。非极性或极性较弱的有机物质，如葫萝卜素、甘油脂及磷脂 等，最适用吸附层析法分离。 ②薄层层析 将吸附剂平铺在玻璃(片)上，分为硬板(加粘合剂)和软板(不加粘合剂)两种。前者制备 复杂些，但易保存；后者制备虽简单，吹干时却易散开。通常，是用吸附剂氧化铝 G 或硅胶 G 制成硬板(G 表示石膏，通常含量为 5％)•，淀粉、羧甲基纤维素纳(CMC)也可作粘合剂制板。 (3)离子交换层析 离子交换层析的固定相是离子交换剂，利用离子交换剂对需要分离的各种离子有不同的 亲和力，使离子在层析柱中移行时达到分离的目的。 离子交换层析在柱中进行，由骨架和离子交换基团构成。交换基团为酸性，可与溶液中 的阳离子交换，称阳离子交换剂；反之，称阴离子交换剂。常用交换剂如表 3。 表 3 常用交换基及类型 ────────────────────────────── 骨 架 交 换 基 酸 碱 性 类 型 ────────────────────────────── 树 脂 磺酸基(-SO3H) 强 酸 性 阳离子型 纤维素 酚羟基(-OH) 强 酸 性 阳离子型 葡聚糖 羧 基(-COOH) 弱 酸 性 阳离子型 季胺基(-NR3OH) 强 碱 性 阴离子型 伯胺基(-NH2) 弱 碱 性 阴离子型 促胺基(-NHR) 弱 碱 性 阴离子型 叔胺基(-NR2) 弱 碱 性 阴离子型 ────────────────────────────── 交换反应例举如下： R-SO3 - H + M+ X R-SO3-M + + H+ X - R4 N+ ON- + H+ X R4 N+ X - + H+ OH- 虽然交换反应都是平衡反应，但在层析柱上进行时，由于交换溶液连续更新，反应朝向 正反应进行，直至完全。 (4)凝胶层析 凝胶有天然(如琼脂糖)和人工合成(如葡聚糖等)两类。凝胶具有网络结构。控制其浓度 和交联度，即可控制其网络的孔径。凝胶产品为颗粒状，小分子物质因易进入颗粒的内部网 络，洗脱时，流出时间较长，称阻滞较大：大分子物质不能进入网络内，从而经颗粒间隙而 流出。途径短，流出时间短，称阻滞小。因能按分子大小将混合物质分离，故也称凝胶过滤 或分子筛层析
凝胶层析中儿个技术问题。①凝胶的选择：a.载体必须是惰性，化学性质稳定。b.尽可能低电荷，以防止与溶质发生离子交换。C.机械强度好，不易变形。②凝胶用量：与层析柱大小有关。柱的直径与高度之比，一般是1:10至1:20。若被分离物质的分子量比较接近，则宜选用较细长的柱子（1：100或更大）。③凝胶制备：商品凝胶是干燥的颗粒，使用前应使其充分溶胀。可采用自然溶胀，即室温浸泡一昼夜：亦可在沸水中，将凝胶逐渐长温至沸。通常仅需1～2小时。热法溶胀的另一优点是消毒杀菌及除去凝胶中的气泡。装柱：要求均匀一致，无气泡和纹路。可用大分子有色物质过柱。如蓝色葡聚糖，分子量为2×10°道尔顿，完全不进入孔内。可观察色带移动是否整齐。防腐：葡聚糖凝胶都是多糖物质，细菌极易生长，可使糖苷键水解，故须加入防腐剂。所选用防腐剂也必须是情性、化学性稳定的，不会使凝胶和溶质发生变性，不会使凝胶色泽发生改变，而且尽可能不吸收紫外光。常用防腐剂有：叠氮钠（使用浓度为0.2克/L)及苯基代汞盐（使用浓度为0.05～0.1克，在碱性溶液中抑菌效果较差）。(5)亲和层析生物体内某些高分子化合物，对与其结构相匹配的化合物具有专一性亲和的特性。如酶与底物，抗原与抗体，DNA和互补DNA或RNA，外凝集亲与细胞膜糖蛋白等。利用这一特性进行物质分离的层析技术称为亲和层析。亲和物：指亲和吸附的双方。配基：以共价键与载体链接的亲和物，亲和物双方都可以作为配基，通常是选用小分子者，如辅基、酶抑制剂。载体：结合配基的固相、如琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和多孔玻璃珠等。采用凝胶的衍生物如氨基琼脂糖、溴乙酰琼脂糖及琉基琼脂糖等，可减小位阻作用，效果更好。亲和物的结合和洗脱，决定于反应条件。选择适合的PH和离子强度，再将待测成分洗脱。亲和层析多用于蛋白质的分离和纯化。如酶蛋白及甲胎蛋白的纯化也可用于核酸品的分离。(6)高压液相层析见高新技术。(7)气相层析以气体为流动相，分气一一气和气一一液层析两种，后者常用。流动相气体必须是情性。常用氢气、氮气、氨氮气等作为载气，固定相是选用高沸点的有机化合物均匀包裹在担体上，对样本的要求则必须是气态或者进柱后很快变成气态。样品进柱后，立即溶于固定相，遇热双挥发扩散入载气。随着氮气的流动又溶解一挥发，再溶解一再挥发，如此交替进行。样品组分借分配系数不同得以分离。气相层析发展很快，已成为一门独立的分离分析技术。(三)电泳法带有电荷的粒子，在电场中移动的现象，称为电泳（electrophoresis）。1937年Tiselius利用U型管进行血清蛋白电泳，依据蛋白质与溶液所形成界面的折射率差异，发现血清蛋白质可分成五个区带。此属自由界面电泳。1948年，Wieland和Konig用滤纸为支技物，使电泳技术大为简化，从而在临床广泛使用。后又发展为琼脂凝胶电泳（1950），淀粉胶电泳（1955)，聚丙烯酰胺凝胶电泳（1959)以及现时广泛应用的醋酸纤维素薄膜电泳。此外，更有等电聚焦、双向电泳等技术出现，为生物化学实验研究，提供了新的手段。1.基本原理Stoke定律：一球形粒子运动时，所受到阻力F与粒子运动速度V、粒子半径r，以及介质的粘度n的关系为：F"=6nrnv7
7 凝胶层析中几个技术问题。 ①凝胶的选择：a.载体必须是惰性，化学性质稳定。b.尽可能低电荷，以防止与溶质发 生离子交换。c.机械强度好，不易变形。 ②凝胶用量：与层析柱大小有关。柱的直径与高度之比，一般是 1:10 至 1:20。若被分 离物质的分子量比较接近，则宜选用较细长的柱子(1:100 或更大)。 ③凝胶制备：商品凝胶是干燥的颗粒，使用前应使其充分溶胀。可采用自然溶胀，即室 温浸泡一昼夜；亦可在沸水中，将凝胶逐渐长温至沸。通常仅需 1～2 小时。热法溶胀的另一 优点是消毒杀菌及除去凝胶中的气泡。 ④装柱：要求均匀一致，无气泡和纹路。可用大分子有色物质过柱。如蓝色葡聚糖，分 子量为 2×10 6 道尔顿，完全不进入孔内。可观察色带移动是否整齐。 ⑤防腐：葡聚糖凝胶都是多糖物质，细菌极易生长，可使糖苷键水解，故须加入防腐剂。 所选用防腐剂也必须是惰性、化学性稳定的，不会使凝胶和溶质发生变性，不会使凝胶色泽 发生改变，而且尽可能不吸收紫外光。常用防腐剂有：叠氮钠•(使用浓度为 0.2 克/L)及苯基 代汞盐(使用浓度为 0.05～0.1 克，在碱性溶液中抑菌效果较差)。 (5)亲和层析 生物体内某些高分子化合物，对与其结构相匹配的化合物具有专一性亲和的特性。如酶 与底物， 抗原与抗体，DNA 和互补 DNA 或 RNA，外凝集亲与细胞膜糖蛋白等。利用这一特性 进行物质分离的层析技术称为亲和层析。 亲和物：指亲和吸附的双方。 配基：以共价键与载体链接的亲和物，亲和物双方都可以作为配基，通常是选用小分子 者，如辅基、酶抑制剂。 载体：结合配基的固相、如琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和多孔玻璃珠等。采用凝胶的 衍生物如氨基琼脂糖、溴乙酰琼脂糖及巯基琼脂糖等，可减小位阻作用，效果更好。 亲和物的结合和洗脱，决定于反应条件。选择适合的 PH 和离子强度，再将待测成分洗脱。 亲和层析多用于蛋白质的分离和纯化。如酶蛋白及甲胎蛋白的纯化也可用于核酸品的分离。 (6)高压液相层析 见高新技术。 (7)气相层析 以气体为流动相，分气-气和气-液层析两种，后者常用。流动相气体必须是惰性。常 用氢气、氮气、氦气等作为载气，固定相是选用高沸点的有机化合物均匀包裹在担体上，对 样本的要求则必须是气态或者进柱后很快变成气态。样品进柱后，立即溶于固定相，遇热双 挥发扩散入载气。随着氤气的流动又溶解一挥发，再溶解一再挥发，如此交替进行。样品组 分借分配系数不同得以分离。气相层析发展很快，已成为一门独立的分离分析技术。 (三)电泳法 带有电荷的粒子， 在电场中移动的现象，称为电泳•(electrophoresis)•。1937 年 Tiselius 利用 U 型管进行血清蛋白电泳， 依据蛋白质与溶液所形成界面的折射率差异，发 现血清蛋白质可分成五个区带。此属自由界面电泳。1948 年，Wieland 和 Konig 用滤纸为支 技物， 使电泳技术大为简化， 从而在临床广泛使用。••后又发展为琼脂凝胶电泳(1950)， 淀粉胶电泳(1955)，聚丙烯酰胺凝胶电泳(1959)以及现时广泛应用的醋酸纤维素薄膜电泳。 此外，更有等电聚焦、双向电泳等技术出现，为生物化学实验研究，提供了新的手段。 1.基本原理 Stoke 定律：一球形粒子运动时，所受到阻力 F'与粒子运动速度 V、粒子半径 r,以及介 质的粘度 η 的关系为：F’= 6лrηv
设电场中带电粒子所受到力F，其与F达到动态平衡时，F=F。而F取决于粒带电量Q及电场强度X，即F=QX则QX=6Jrnvv/x=Q/6vv/x表示单位电场强度（电势梯度）时的粒子运动速度，称为电泳迁移率μ。可见，迁移率取决于带电量，也受粒子的本身的因素（半径、分子量）及介质的因素影响。因而，在一定的介质条件下，粒子间带电量和分子量或密度的差异，可在电场中得以分离。电泳迁移率单位是：厘米“/秒/伏。含义为：在伏/厘米的电场强度下的粒子迁移度（厘米/秒）。2.影响电泳因素（1）电泳介质的PH：介质的PH影响粒子的带电量。以氨基酸为例，介质PH等于该氨基酸等电点时，则氨基酸是电中性：低于其等电点时，带正电：高于其等电点时，带负电。蛋白质由氨基酸组成，蛋白质颗粒在某一PH的介质中的荷电性，取决于各种氨基酸的组成，亦即取决于等电点。为使介质PH恒定，介质由缓冲液组成。2）缓冲液的离子强度：离子强度过低，缓冲容量小，不易维持PH恒定；离子强度过高，降低了zeta电势（两相之间运动平面两侧的电位差，特指电泳中越过带电粒子切变表面的电应）。而使电泳速度减慢。常用离子强度应在0.02～0.2之间。缓冲液的离子强度计算如下μ=1/22cizi式中u为离子强度，Ci为某离子的摩尔浓度，Zi为某离子的价数。例：0.154mo1/LNaC1溶液之离子强度计算：μ=1/2(0.154×12+0.154X1）=0.154(3)电场强度：即每厘米距离的电势差，以伏/厘米表示。电场强度与带电粒子移动距离成正比。增加电场强度，带电粒运动加快，但电压也升高，产热增加，致缓冲液蒸以快，影响电泳迁移速率。故高压电泳需备冷却装置。为获得满意的电泳结果，电场强度的选择尤为重要。通常，醋纤薄膜电泳的电压选择为8～10V/cm。此系指两极间的平均电压，即仪表指示的电压除以两极间的距离。更准确者，应是用电流（伏）表测支持物两端的电压，然后计算电场强度。凝胶柱状（圆盘）电泳，则通常是计算每支凝胶管的电流（mA)来控制电场强度。（4）电渗：电场中，液体对于固体支持物作相对运动现象称为电渗electro-osmosis），水是极性分子，其解离后，实际上是以水合离子（Hso）和OH形式存在。通常，支持物（如滤纸）是多羟基化合物，呈电负性，使H30+吸附于其表面而形成一带电层。在电场中，H3+向负极移动，亦即为水在支持物表面的移动。电渗影响带电质粒移动速度（加快或减慢），但不影响区带分离。琼脂和滤纸肯有较大电渗作用，而醋酸纤素和聚丙烯酰胺凝胶则电渗很弱，几无电渗作用。（5）支持物：支持物对电泳的影响，除电渗作用外，尚有吸附和分子筛作用。前者不仅影响迁移速度，而且影响各组分测定的准确性。如血清蛋白纸电泳法，白蛋白偏低，即是滤纸的吸附作用导致尾遗现象：分子筛作用是因为某些支持物具有网络结构，而使分子量不同的组分迁移速度不同。3.常用支持物及电泳技术简介(1)醋酸纤维素薄膜电泳8
8 设电场中带电粒子所受到力 F，其与 F'达到动态平衡时，F=F'。而 F 取决于粒带电量 Q 及电场强度 X，即 F=QX 则 QX= 6лrηv v/x=Q/6лrηv v/x 表示单位电场强度(电势梯度)•时的粒子运动速度，称为电泳迁移率μ。可见，迁移 率取决于带电量，也受粒子的本身的因素(半径、分子量)及介质的因素影响。因而，在一定 的介质条件下，粒子间带电量和分子量或密度的差异，可在电场中得以分离。 电泳迁移率单位是：厘米 2 /秒/伏。含义为：在伏/厘米的电场强度下的粒子迁移度(厘 米/秒)。 2.影响电泳因素 (1)•电泳介质的 PH：介质的 PH 影响粒子的带电量。以氨基酸为例，介质 PH 等于该氨基 酸等电点时，则氨基酸是电中性；低于其等电点时，带正电；高于其等电点时，带负电。蛋 白质由氨基酸组成，蛋白质颗粒在某一 PH 的介质中的荷电性，取决于各种氨基酸的组成，亦 即取决于等电点。为使介质 PH 恒定，介质由缓冲液组成。 (2)•缓冲液的离子强度：离子强度过低，缓冲容量小，不易维持 PH 恒定；离子强度过高， 降低了 zeta 电势•(两相之间运动平面两侧的电位差，特指电泳中越过带电粒子切变表面的电 位)。而使电泳速度减慢。常用离子强度应在 0.02～0.2 之间。缓冲液的离子强度计算如下： µ= 1/2ΣciZi2 式中μ为离子强度，Ci 为某离子的摩尔浓度，Zi 为某离子的价数。 例：0.154mol/LNaCl 溶液之离子强度计算： µ=1/2(0.154 ╳ 1 2 + 0.154╳ 1 2 ) = 0.154 (3)电场强度：即每厘米距离的电势差，以伏/厘米表示。电场强度与带电粒子移动距离 成正比。增加电场强度，带电粒运动加快，但电压也升高，产热增加，致缓冲液蒸以快，影 响电泳迁移速率。故高压电泳需备冷却装置。 为获得满意的电泳结果，电场强度的选择尤为重要。通常，醋纤薄膜电泳的电压选择为 8～10V/cm。 此系指两极间的平均电压，即仪表指示的电压除以两极间的距离。更准确者， 应是用电流(伏)表测支持物两端的电压，然后计算电场强度。凝胶柱状(圆盘)电泳，则通常 是计算每支凝胶管的电流(mA)来控制电场强度。 (4)• 电渗： 电场中 ， 液 体 对 于 固 体 支 持 物 作 相 对 运 动 现 象 称 为 电 渗 ••(electro-osmosis)•，水是极性分子，其解离后，实际上是以水合离子(H3O + )和 OH-形式存 在。通常，支持物(如滤纸)是多羟基化合物，呈电负性，使 H3O+吸附于其表面而形成一带电 层。在电场中，H3+向负极移动，亦即为水在支持物表面的移动。 电渗影响带电质粒移动速度(加快或减慢)，但不影响区带分离。琼脂和滤纸肯有较大电 渗作用，而醋酸纤素和聚丙烯酰胺凝胶则电渗很弱，几无电渗作用。 (5)•支持物：支持物对电泳的影响，除电渗作用外，尚有吸附和分子筛作用。前者不仅 影响迁移速度，而且影响各组分测定的准确性。如血清蛋白纸电泳法，白蛋白偏低，即是滤 纸的吸附作用导致尾遗现象；分子筛作用是因为某些支持物具有网络结构，而使分子量不同 的组分迁移速度不同。 3.常用支持物及电泳技术简介 (1)醋酸纤维素薄膜电泳
将醋酸纤维素溶于丙酮后制成，具有低电渗，吸附作用小的优点。操作简易，临床上使用十分普遍。如血清蛋白电泳，血红蛋白电泳等。(2)琼脂糖凝胶电泳琼指糖是D-半乳糖3,6-脱水-L-半乳糖相间结合的多糖，自天然琼脂中提取。由于电泳凝胶的浓度是3.5～5克/升。制胶容易，成本较低，可用于脂蛋白、DNA电泳等。(3)聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶是人工合成，除有一般电泳的电荷效应外，因呈网络结构而具有分子筛作用。其主要成分如表1。表 1 聚丙烯酰胺凝胶主要成分及作用分成作用单体丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺交联剂引发剂过硫酸铵或核黄素四甲基乙二胺或二甲基胺基丙晴加速剂注：核黄素只能与四甲基乙二胺配伍，为光聚合：过硫酸铵与两种加速剂可配伍使用，为化学聚合。凝胶形成机理引发剂提供自由基，使丙烯酰胺和双丙烯酰胺的不饱和键打开。在加速剂作用下，发生交联聚合。反应如下：CH2— CHCH2-CH-CH2CHCH2CHFCbNH2CONH2CONH2CONH2CH2CH2CONH2CONH2CONH2CONH2CHCH-CH2—CHCH2--CH2 -CHCH2 -丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝胶凝胶浓度与交联度凝胶浓度（T%）：100ml溶液中，含有单体和交联剂（俗称干胶）的克数。其决定孔径的大小。交联度（C%）：干胶中双丙烯酰胺占取的百分比例。交联度主要影响凝胶铁透明度和弹性。但当交联度达5%时，无论凝胶总浓度多大，孔径都是最小。根据被分离成分的分子量来选择凝胶浓度（见表2）表2凝胶浓度的选择T(%)被分离成分分子量<1063.75~7.0104~1067.5~15.0<10422.5~30.0聚丙烯酰胺凝胶可制备成柱状和板状两种电泳方式。柱状凝胶电泳也称园盘电泳。一是9
9 将醋酸纤维素溶于丙酮后制成，具有低电渗，吸附作用小的优点。操作简易，临床上使 用十分普遍。如血清蛋白电泳，血红蛋白电泳等。 (2)琼脂糖凝胶电泳 琼指糖是 D-半乳糖 3,6-脱水-L-半乳糖相间结合的多糖， 自天然琼脂中提取。由于电泳 凝胶的浓度是 3.5～5 克/升。制胶容易，成本较低，可用于脂蛋白、DNA 电泳等。 (3)聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶是人工合成，除有一般电泳的电荷效应外，因呈网络结构而具有分子筛 作用。其主要成分如表 1。 表 1 聚丙烯酰胺凝胶主要成分及作用 ─────────────────────────── 成 分 作 用 ─────────────────────────── 丙烯酰胺 单 体 甲叉双丙烯酰胺 交联剂 过硫酸铵或核黄素 引发剂 四甲基乙二胺或二甲基胺基丙晴 加速剂 ─────────────────────────── 注：核黄素只能与四甲基乙二胺配伍，为光聚合；过硫酸铵与两种加速剂可配伍使用，为化 学聚合。 凝胶形成机理 引发剂提供自由基，使丙烯酰胺和双丙烯酰胺的不饱和键打开。在加速剂作用下，发生 交联聚合。反应如下： CH2 CH CH2 CH CH2 CH CH2 CH CONH2 CONH2 CONH2 CONH2 CH2 + CH2 CONH2 CONH2 CONH2 CONH2 CH2 CH CH2 CH CH2 CH CH2 CH 甲叉双丙烯酰胺 丙烯酰胺 聚丙烯酰胺凝胶 凝胶浓度与交联度 凝胶浓度(T％)：100ml 溶液中，含有单体和交联剂(俗称干胶)的克数。其决定孔径的大 小。 交联度(C％)•：干胶中双丙烯酰胺占取的百分比例。交联度主要影响凝胶铁透明度和弹 性。 但当交联度达 5％时，无论凝胶总浓度多大，孔径都是最小。根据被分离成分的分子量 来选择凝胶浓度(见表 2) 表 2 凝胶浓度的选择 ─────────────────────────── 被分离成分分子量 T(％) ─────────────────────────── <106 3.75～7.0 104～106 7.5～15.0 <104 22.5～30.0 ─────────────────────────── 聚丙烯酰胺凝胶可制备成柱状和板状两种电泳方式。柱状凝胶电泳也称园盘电泳。一是
区带染色后呈园盘状而名；二是聚丙烯酰胺凝胶电泳是采用不连续缓冲体系（discontinousbuffersystem)，“disc”是“不连续”一词的词头，凑巧也是园盘之意。因此，称柱状凝胶电泳为园盘电泳，既形象又符合实义。不连续缓冲体系，使聚丙烯酰胺凝胶电泳具有浓缩效应。4.电泳技术的应用（1）组分的定量分析：如血清蛋白电泳，观察各组分的比例变化，提示其临床意义。(2)纯度鉴定：化学提纯的产品是否纯，可用电泳法证明之。如牛血清白蛋白(BSA)，通常以“电泳纯”表示其纯度（即电泳分析结果呈现一条白蛋白带）。(3)分子量测定，十二烷基硫酸钠(SDS)能与蛋白质结合，而且结合量与蛋白质分子量有关。十二烷基硫酸钠具有大量阴电荷，与蛋白结合后，使蛋白质之间的荷电量差异减少至可忽略。故电泳迁移率只与分子量有关。实验时，需用一组已知分子量的标准品（marker）与样品同时电泳，比较迁移距离而测知分子量。4)等电点测定：等电聚焦电泳是测定蛋白质等电点的精确方法（精确度可达0.01PH单位）。其原理是：在阳极聚集硫酸，在阴极聚集氢氧化钠，凝胶中加入两性电解质（商品名：Ampholin）。通电后，两性电解质即可解离并排列成一PH梯度。样品中组分，不论放在那个位置，都可朝向与本身等电点相同的区域运动，达到该区域后不再泳动，而且愈来愈聚集，故名为等电聚焦电泳。检测时需用已知等电点的标准物质同时平行电泳，以比较而测知。（5）免疫电泳：抗原、抗体都具有蛋白成分，可在电场中泳动。电泳法使抗原抗体反应更加明显。对流免疫电泳是利用琼脂具有较大的电渗作用。由于电渗作用方向与抗原、抗体泳动方向相反，而且水合正离子的泳速大于抗体的泳速大于抗体的泳速，小于抗原的泳速。电泳开始时抗体在前，抗原在后，经一定时间后二者在电场中相遇发生反应。还可以将样本先经电泳分离，然后在区带旁侧挖槽，注入相对应的抗原或抗体，进行免疫扩散。此是鉴定抗原或抗体的有效办法。火箭电泳是免疫电泳的典型实例。其是将抗体预先加入琼脂中制板，而后在板上打孔。孔中加入抗原进行电泳。随着抗原的向前泳动持续地与抗体反应，抗原含量越高，形成沉淀峰（形似火箭）越高。火箭电泳又发展为用同位素标记的饱和平衡法，亦称放射免疫自显影术，灵敏度大为提高。（6）DNA和RNA分析：DNA和RNA的分析也可采用电泳技术。电泳前，凝胶中导入化乙锭，电泳过程中，溴化乙锭不断嵌入DNA和RNA中，经紫外照射，嵌入DNA和RNA的溴乙锭发出荧光而证明DNA和RNA的存在。同时作标准分子量电泳，可测知样品DNA或RNA的分子量。也可将电泳后的DNA或RNA带吸印到硝酸纤维素上作杂交分析。[注]（8）同工酶电泳：酶的本质是蛋白质。同工酶因各亚基组成的差异（原级同工酶），电泳迁移率有别而分离，再经化学呈色而识别。乳酸脱氢酶同工酶，肌酸激酶同工酶在临床上使用较普遍。[注］吸印杂交技术为1975年Southern氏首创，用于酶解后DNA分子的杂交实验，命名为Southernblot。两年后，Alwine等将其用于RNA研究，称为Northernblot。1979年Renarnd以及Towbin等，又将此技术发展到蛋白质的研究中，称为Westernbolt。(四)离心分析l.离心力(centrifugeforce)离心机运转时，离心管绕离心机转抽转动。转动的角速度为。离心管中的微粒也随之作同样的运动。若要保持微粒匀速园周运动，必须有一足够大小的向心力来维持。根据牛顿定律，微粒所受的向心力FF=ma=v o r?10
10 区带染色后呈园盘状而名； 二是聚丙烯酰胺凝胶电泳是采用不连续缓冲体系(discontinous buffer system)，“disc”是“不连续”一词的词头，凑巧也是园盘之意。因此，称柱状凝胶 电泳为园盘电泳，既形象又符合实义。不连续缓冲体系，使聚丙烯酰胺凝胶电泳具有浓缩效 应。 4.电泳技术的应用 (1)组分的定量分析：如血清蛋白电泳，观察各组分的比例变化，提示其临床意义。 (2)纯度鉴定：化学提纯的产品是否纯，可用电泳法证明之。如牛血清白蛋白(BSA)，通 常以“电泳纯”表示其纯度(即电泳分析结果呈现一条白蛋白带)。 (3)分子量测定，十二烷基硫酸钠(SDS)能与蛋白质结合，而且结合量与蛋白质分子量有 关。十二烷基硫酸钠具有大量阴电荷，与蛋白结合后，使蛋白质之间的荷电量差异减少至可 忽略。 故电泳迁移率只与分子量有关。 实验时，需用一组已知分子量的标准品(marker)与 样品同时电泳，比较迁移距离而测知分子量。 (4)等电点测定：等电聚焦电泳是测定蛋白质等电点的精确方法(精确度可达 0.01PH 单 位)。其原理是：在阳极聚集硫酸，在阴极聚集氢氧化钠，凝胶中加入两性电解质(商品名： Ampholin)•。通电后，两性电解质即可解离并排列成一 PH 梯度。样品中组分，不论放在那个 位置，都可朝向与本身等电点相同的区域运动，达到该区域后不再泳动，而且愈来愈聚集， 故名为等电聚焦电泳。检测时需用已知等电点的标准物质同时平行电泳，以比较而测知。 (5)•免疫电泳：抗原、抗体都具有蛋白成分，可在电场中泳动。电泳法使抗原抗体反应 更加明显。对流免疫电泳是利用琼脂具有较大的电渗作用。由于电渗作用方向与抗原、抗体 泳动方向相反，而且水合正离子的泳速大于抗体的泳速大于抗体的泳速，小于抗原的泳速。 电泳开始时抗体在前，抗原在后，经一定时间后二者在电场中相遇发生反应。 还可以将样本先经电泳分离，然后在区带旁侧挖槽，注入相对应的抗原或抗体，进行免 疫扩散。此是鉴定抗原或抗体的有效办法。 火箭电泳是免疫电泳的典型实例。其是将抗体预先加入琼脂中制板，而后在板上打孔。 孔中加入抗原进行电泳。随着抗原的向前泳动持续地与抗体反应，抗原含量越高，形成沉淀 峰(形似火箭)越高。火箭电泳又发展为用同位素标记的饱和平衡法，亦称放射免疫自显影术， 灵敏度大为提高。 (6)•DNA 和 RNA 分析：DNA 和 RNA 的分析也可采用电泳技术。电泳前，凝胶中导入溴化乙 锭，电泳过程中，溴化乙锭不断嵌入 DNA 和 RNA 中，经紫外照射，嵌入 DNA 和 RNA 的溴乙锭 发出荧光而证明 DNA 和 RNA 的存在。同时作标准分子量电泳，可测知样品 DNA 或 RNA 的分子 量。也可将电泳后的 DNA 或 RNA 带吸印到硝酸纤维素上作杂交分析。[注] (8)•同工酶电泳：酶的本质是蛋白质。同工酶因各亚基组成的差异(原级同工酶)，电泳 迁移率有别而分离，再经化学呈色而识别。乳酸脱氢酶同工酶，肌酸激酶同工酶在临床上使 用较普遍。 [注]•吸印杂交技术为 1975 年 Southern 氏首创，用于酶解后 DNA 分子的杂交实验，命名 为 Southern blot。 两年后，Alwine 等将其用于 RNA 研究，称为 Northern blot。1979 年 Renarnd 以及 Towbin 等，又将此技术发展到蛋白质的研究中，称为 Western bolt。 (四)离心分析 1.离心力(centrifuge force) 离心机运转时，离心管绕离心机转抽转动。转动的角速度为ω。离心管中的微粒也随之 作同样的运动。若要保持微粒匀速园周运动，必须有一足够大小的向心力来维持。根据牛顿 定律，微粒所受的向心力 F： F=ma=vσrω 2