3)油镜观察：在高倍镜或低倍镜下找到要观察的样品区域后，用粗调节器将镜 筒升高，然后将油镜转到工作位置。在待观察的样品区域加滴香柏油，从侧面注 视，用粗调节器将镜筒小心地降下，使油镜浸在镜油中并几乎与标本相接。将聚 光器升至最高位置并开足光圈，若所用聚光器的数值孔径值超过1.0，还应在聚 光镜与载玻片之间也加滴香柏油，保证其达到最大的效能。调节照明使视野亮度 合适，用粗调节器将镜筒徐徐上升，直至视野中出现物像并用细调节器使其清晰 准焦为止。 有时按上述操作还找不到目的物，则可能是由于油镜头下降还未到位，或因 油镜上升太快，以至眼睛捕捉不到一闪而过的物像。遇此情况，应重新操作。另 外应特别注意不要因在下降镜头时用力过猛，或调焦时误将粗调节器向反方向转 动而损坏镜头及载玻片。 3.显微镜用毕后的处理 1)上升镜筒，取下载玻片。 2)用擦镜纸拭去镜头上的镜油，然后用擦镜纸捶少许二甲苯（香柏油溶于二甲 苯)擦去镜头上残留的油迹，最后再用干净的擦镜纸擦去残留的二甲苯。 切忌用手或其他纸擦拭镜头，以免使镜头沾上污渍或产生划痕，影响观察。 3)用擦镜纸清洁其他物镜及目镜：用绸布清洁显微镜的金属部件。 4)将各部分还原，反光镜垂直于镜座，将物镜转成“八”字形，再向下旋。同 时把聚光镜降下，以免接物镜与聚光镜发生碰撞危险。 五、注意事项 1.持镜时必须是右手握臂、左手托座的姿势，不可单手提取，以免零件脱落或 碰撞到其它地方。 2.轻拿轻放，不可把显微镜放置在实验台的边缘，以免碰翻落地。 3.保持显微镜的清洁，光学和照明部分只能用擦镜纸擦拭，切忌口吹手抹或用 布擦，机械部分用布擦拭。 4.水滴、酒精或其它药品切勿接触镜头和镜台，如果沾污应立即擦净。 5.放置玻片标本时要对准通光孔中央，且不能反放玻片，防止压坏玻片或碰坏 物镜
3）油镜观察：在高倍镜或低倍镜下找到要观察的样品区域后，用粗调节器将镜 筒升高，然后将油镜转到工作位置。在待观察的样品区域加滴香柏油，从侧面注 视，用粗调节器将镜筒小心地降下，使油镜浸在镜油中并几乎与标本相接。将聚 光器升至最高位置并开足光圈，若所用聚光器的数值孔径值超过 1.0，还应在聚 光镜与载玻片之间也加滴香柏油，保证其达到最大的效能。调节照明使视野亮度 合适，用粗调节器将镜筒徐徐上升，直至视野中出现物像并用细调节器使其清晰 准焦为止。 有时按上述操作还找不到目的物，则可能是由于油镜头下降还未到位，或因 油镜上升太快，以至眼睛捕捉不到一闪而过的物像。遇此情况，应重新操作。另 外应特别注意不要因在下降镜头时用力过猛，或调焦时误将粗调节器向反方向转 动而损坏镜头及载玻片。 3.显微镜用毕后的处理 1）上升镜筒，取下载玻片。 2）用擦镜纸拭去镜头上的镜油，然后用擦镜纸蘸少许二甲苯（香柏油溶于二甲 苯）擦去镜头上残留的油迹，最后再用干净的擦镜纸擦去残留的二甲苯。 切忌用手或其他纸擦拭镜头，以免使镜头沾上污渍或产生划痕，影响观察。 3）用擦镜纸清洁其他物镜及目镜；用绸布清洁显微镜的金属部件。 4）将各部分还原，反光镜垂直于镜座，将物镜转成“八”字形，再向下旋。同 时把聚光镜降下，以免接物镜与聚光镜发生碰撞危险。 五、注意事项 1．持镜时必须是右手握臂、左手托座的姿势，不可单手提取，以免零件脱落或 碰撞到其它地方。 2．轻拿轻放，不可把显微镜放置在实验台的边缘，以免碰翻落地。 3．保持显微镜的清洁，光学和照明部分只能用擦镜纸擦拭，切忌口吹手抹或用 布擦，机械部分用布擦拭。 4．水滴、酒精或其它药品切勿接触镜头和镜台，如果沾污应立即擦净。 5．放置玻片标本时要对准通光孔中央，且不能反放玻片，防止压坏玻片或碰坏 物镜。 16
6.要养成两眼同时睁开的习惯，以左眼观察视野，右眼用以绘图。 7.不要随意取下目镜，以防止尘土落入物镜，也不要任意拆卸各种零件，以防 损坏。 8.使用完毕后，必须复原才能放回镜箱内，其步骤是：取下标本片，转动旋转 器使镜头离开通光孔，下降镜台，平放反光镜，下降集光器（但不要接触反光镜）、 关闭光圈，推片器回位，盖上绸布和外罩，放回实验台柜内。最后填写使用登记 表。（注：反光镜通常应垂直放，但有时因集光器没提至应有高度，镜台下降时 会碰坏光圈，所以这里改为平放) 六、实验报告 1.记录实验结果 2.思考题 1)试列表比较低倍镜、高倍镜及油镜各方面的差异。为什么在使用高倍镜及油 镜时应特别注意避免粗调节器的误操作？ 2)什么是物镜的同焦现象？它在显微镜观察中有什么意义？ 3)影响显微镜分辨率的因素有哪些？ 4)根据你的实验体会，谈谈应如何根据所观察微生物的大小，选择不同的物镜 进行有效的观察
6．要养成两眼同时睁开的习惯，以左眼观察视野，右眼用以绘图。 7．不要随意取下目镜，以防止尘土落入物镜，也不要任意拆卸各种零件，以防 损坏。 8．使用完毕后，必须复原才能放回镜箱内，其步骤是：取下标本片，转动旋转 器使镜头离开通光孔，下降镜台，平放反光镜，下降集光器(但不要接触反光镜)、 关闭光圈，推片器回位，盖上绸布和外罩，放回实验台柜内。最后填写使用登记 表。(注：反光镜通常应垂直放，但有时因集光器没提至应有高度，镜台下降时 会碰坏光圈，所以这里改为平放) 六、实验报告 1.记录实验结果 2.思考题 1）试列表比较低倍镜、高倍镜及油镜各方面的差异。为什么在使用高倍镜及油 镜时应特别注意避免粗调节器的误操作？ 2）什么是物镜的同焦现象？它在显微镜观察中有什么意义？ 3）影响显微镜分辨率的因素有哪些？ 4）根据你的实验体会，谈谈应如何根据所观察微生物的大小，选择不同的物镜 进行有效的观察。 17
实验三革兰氏染色法 一、实验目的 1.了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性 2.学习掌握革兰氏染色技术，巩固学习光学显微镜油镜的使用方法。 二、实验原理 革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家Christain Gram氏创立的，革兰氏 染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌(G+)和革兰氏阴性菌(G-)两大 类。革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。 革兰氏染色法的基本步骤是：先用初染剂结晶紫进行初染，再用碘液媒染， 然后用乙醇（或丙酮）脱色，最后用复染剂（如番红）复染。经此方法染色后，细胞 保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌：如果细胞中初染剂被脱色剂洗脱而使 细菌染上复染剂的颜色（红色），该菌属于革兰氏阴性菌。 革兰氏染色法所以能将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性，是由这两类细菌 细胞壁的结构和组成不同决定的。实际上，当用结晶紫初染后，像简单染色法一 样，所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色。碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结 晶紫一碘的复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。当用脱色剂处理时，两类 细菌的脱色效果是不同的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结 构组成，壁厚、类脂质含量低，用乙醇（或丙酮）脱色时细胞壁脱水、使肽聚糖层 的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫碘的复合物不易被洗脱而保留 在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。革兰氏阴性菌则不同，由于 其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂含量高，所以当脱色处理时，类脂质被乙醇（或丙 酮)溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫-碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染 剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。 三、实验器材 1.茵种 大肠杆菌(Escherichia coli)约24h营养琼脂斜面菌种一支，枯草芽孢杆菌 (Baci lussubtilis训)约l6h牛肉音琼脂斜面菌种一支
实验三 革兰氏染色法 一、实验目的 1.了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性. 2.学习掌握革兰氏染色技术，巩固学习光学显微镜油镜的使用方法。 二、 实验原理 革兰氏染色法是 1884 年由丹麦病理学家 Christain Gram 氏创立的，革兰氏 染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）两大 类。革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。 革兰氏染色法的基本步骤是：先用初染剂结晶紫进行初染，再用碘液媒染， 然后用乙醇(或丙酮)脱色，最后用复染剂(如番红)复染。经此方法染色后，细胞 保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；如果细胞中初染剂被脱色剂洗脱而使 细菌染上复染剂的颜色(红色)，该菌属于革兰氏阴性菌。 革兰氏染色法所以能将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性，是由这两类细菌 细胞壁的结构和组成不同决定的。实际上，当用结晶紫初染后，像简单染色法一 样，所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色。碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结 晶紫一碘的复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。当用脱色剂处理时，两类 细菌的脱色效果是不同的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结 构组成，壁厚、类脂质含量低，用乙醇(或丙酮)脱色时细胞壁脱水、使肽聚糖层 的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保留 在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。革兰氏阴性菌则不同，由于 其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂含量高，所以当脱色处理时，类脂质被乙醇(或丙 酮)溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫-碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染 剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。 三、实验器材 1.菌种 大肠杆菌（Escherichia coli）约 24h 营养琼脂斜面菌种一支，枯草芽孢杆菌 （Bacillus subtilis）约 16h 牛肉膏琼脂斜面菌种一支。 18
2.染色剂 结晶紫染色液、卢戈氏碘液、95%乙醇、石炭酸复红液。 3.仪器或其他用具 显微镜、擦镜纸、接种环、载玻片、酒精灯、蒸馏水、香柏油、二甲苯。 四、实验流程 涂片→干燥一固定→染色（初染→媒染一→脱色→复染）→镜检。 五、实验步骤 1.涂片 1)常规涂片法 取一洁净的载玻片，用特种笔在载玻片的左右两侧标上菌号，并在两端各滴 一小滴蒸馏水，以无菌接种环分别挑取少量菌体涂片，干燥、固定。玻片要洁净 无油，否则菌液涂不开 2)“三区”涂片法 在玻片的左、右端各加一滴蒸馏水，用无菌接种环挑取少量枯草芽孢杆菌与 左边水滴充分混合成仅有枯草芽孢杆菌的区域，并将少量菌液延伸至玻片的中 央。再用无菌的接种环调取少量大肠杆菌与右边的水滴充分混合成仅有大肠杆菌 的区域，并将少量的大肠杆菌液延伸到玻片中央，与枯草芽孢杆菌相混合含有两 种菌的混合区，干燥、固定。 要用活跃生长期的幼培养物作革兰氏染色：涂片不宜过厚，以免脱色不完全 造成假阳性。 2.初染 滴加结晶紫（以刚好将菌膜覆盖为宜）于两个玻片的涂面上，染色1~2min， 倾去染色液，细水冲洗至洗出液为无色，将载玻片上水甩净。 3.媒染 用卢戈氏碘液媒染约min，水洗。 4.脱色 用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加95% 的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗，终止脱色，将载玻片上水甩
2.染色剂 结晶紫染色液、卢戈氏碘液、95%乙醇、石炭酸复红液。 3.仪器或其他用具 显微镜、擦镜纸、接种环、载玻片、酒精灯、蒸馏水、香柏油、二甲苯。 四、实验流程 涂片→干燥→固定→染色（初染→媒染→脱色→复染）→镜检。 五、实验步骤 1. 涂片 1）常规涂片法 取一洁净的载玻片，用特种笔在载玻片的左右两侧标上菌号，并在两端各滴 一小滴蒸馏水，以无菌接种环分别挑取少量菌体涂片，干燥、固定。玻片要洁净 无油，否则菌液涂不开。 2）“三区”涂片法 在玻片的左、右端各加一滴蒸馏水，用无菌接种环挑取少量枯草芽孢杆菌与 左边水滴充分混合成仅有枯草芽孢杆菌的区域，并将少量菌液延伸至玻片的中 央。再用无菌的接种环调取少量大肠杆菌与右边的水滴充分混合成仅有大肠杆菌 的区域，并将少量的大肠杆菌液延伸到玻片中央，与枯草芽孢杆菌相混合含有两 种菌的混合区，干燥、固定。 要用活跃生长期的幼培养物作革兰氏染色；涂片不宜过厚，以免脱色不完全 造成假阳性。 2. 初染 滴加结晶紫(以刚好将菌膜覆盖为宜)于两个玻片的涂面上，染色 1～2min ， 倾去染色液，细水冲洗至洗出液为无色，将载玻片上水甩净。 3. 媒染 用卢戈氏碘液媒染约l min ，水洗。 4. 脱色 用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加 95% 的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗，终止脱色，将载玻片上水甩 19
净。 革兰氏染色结果是否正确，乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节。脱色不 足，阴性菌被误染成阳性菌，脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌。脱色时间一般 约20~30s 5.复染 在涂片上滴加番红液复染约2~3min,水洗，然后用吸水纸吸干。在染色的 过程中，不可使染液干涸。 6.镜检 干燥后，用油镜观察。判断两种菌体染色反应性。菌体被染成蓝紫色的是革 兰氏阳性菌(G),被染成红色的为革兰氏阴性菌(G)。 7.实验结束后处理 清洁显微镜。先用擦镜纸擦去镜头上的油，然后再用擦镜纸沾取少许二甲苯 擦去镜头上的残留油迹，最后用擦镜纸擦去残留的二甲苯。染色玻片用洗衣粉水 煮沸、清洗，凉干后备用。 六、实验结果 1.根据观察结果，绘出两种细菌的形态图。 2.列表简述两株细菌的染色结果（说明各菌的形状、颜色和革兰氏染色反应）。 七、思考题 1.哪些环节会影响革兰色染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？ 2.进行革兰氏染色时，为什么特别强调菌龄不能太老，用老龄细菌染色会出现 什么问题？ 3.革兰氏染色时，初染前能加碘液吗？乙醇脱色后复染之前，革兰氏阳性菌和革 兰氏阴性菌应分别是什么颜色？ 4.不经过复染这一步，能否区别革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌？ 5.你认为制备细菌染色标本时，应该注意哪些环节？ 6.为什么要求制片完全干燥后才能用油镜观察？ 7.如果涂片未经热固定，将会出现什么问题？加热温度过高、时间太长，又会怎 样呢？ 20
净。 革兰氏染色结果是否正确，乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节。脱色不 足，阴性菌被误染成阳性菌，脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌。脱色时间一般 约 20～30s。 5. 复染 在涂片上滴加番红液复染约 2～3min ，水洗，然后用吸水纸吸干。在染色的 过程中，不可使染液干涸。 6. 镜检 干燥后，用油镜观察。判断两种菌体染色反应性。菌体被染成蓝紫色的是革 兰氏阳性菌（G+ ），被染成红色的为革兰氏阴性菌（G- ）。 7. 实验结束后处理 清洁显微镜。先用擦镜纸擦去镜头上的油，然后再用擦镜纸沾取少许二甲苯 擦去镜头上的残留油迹，最后用擦镜纸擦去残留的二甲苯。染色玻片用洗衣粉水 煮沸、清洗，凉干后备用。 六、 实验结果 1. 根据观察结果，绘出两种细菌的形态图。 2. 列表简述两株细菌的染色结果(说明各菌的形状、颜色和革兰氏染色反应)。 七、思考题 1. 哪些环节会影响革兰色染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？ 2. 进行革兰氏染色时，为什么特别强调菌龄不能太老，用老龄细菌染色会出现 什么问题? 3. 革兰氏染色时，初染前能加碘液吗?乙醇脱色后复染之前，革兰氏阳性菌和革 兰氏阴性菌应分别是什么颜色? 4. 不经过复染这一步，能否区别革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌？ 5. 你认为制备细菌染色标本时，应该注意哪些环节? 6. 为什么要求制片完全干燥后才能用油镜观察? 7. 如果涂片未经热固定，将会出现什么问题?加热温度过高、时间太长，又会怎 样呢? 20