在使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要，因 为空气的膨胀压大于水蒸汽的膨胀压，所以，当水蒸汽中含有空气时，在同一压力 下，含空气蒸汽的温度低于饱和蒸汽的温度。 一般培养基用1.05kgcm2,121.3℃15一30分钟可达到彻底灭菌的目的。 灭菌的温度及维持的时间随灭菌物品的性质和容量等具体情况而有所改变。例如 含糖培养基用0.56kgcm2(8磅/英寸2,112.6℃灭菌15分钟，但为了保证效果， 可将其他成分先行121.3℃，20分钟灭菌，然后以无菌操作手续加入灭菌的糖溶 液。又如盛于试管内的培养基以1.05kgcm2,121.3℃灭菌20分钟即可，而盛于 大瓶内的培养基最好以1.05kgcm2灭菌30分钟。 蒸汽压力所用单位为kgcm(千克/厘米3 实验室中常用的高压蒸汽灭菌锅有立式、卧式和手提式等几种。 三、实验器材 1.器材试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、培养基、分装器、天平、牛角匙、 高压蒸汽灭菌锅、pH度纸、棉花、牛皮纸、记号笔、麻绳、纱布、吸管、培 养皿、电烘箱、注射器、微孔滤膜过滤器、镊子等。 2.试剂牛肉膏、蛋白胨、NaC1、琼脂 四、实验流程 称药品→溶解→调pH值→融化琼脂→过滤分装→包扎标记一→灭菌→摆斜面或倒 平板 五、实验步骤 1.培养基的制备 1)称量药品 根据培养基配方依次准确称取各种药品，放入适当大小的烧杯中，琼脂不要 加入。蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速。 2)溶解 用量筒取一定量（约占总量的12）蒸馏水倒入烧杯中，在放有石棉网的电炉 上小火加热，并用玻棒搅拌，以防液体溢出。待各种药品完全溶解后，停止加热， 6
在使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时,灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要,因 为空气的膨胀压大于水蒸汽的膨胀压,所以,当水蒸汽中含有空气时,在同一压力 下,含空气蒸汽的温度低于饱和蒸汽的温度。 一般培养基用 1．05kg /cm2 ,121．3℃ 15—30 分钟可达到彻底灭菌的目的。 灭菌的温度及维持的时间随灭菌物品的性质和容量等具体情况而有所改变。例如 含糖培养基用 0．56kg/cm2(8 磅/英寸 2),112．6℃灭菌 15 分钟,但为了保证效果, 可将其他成分先行 121．3℃,20 分钟灭菌,然后以无菌操作手续加入灭菌的糖溶 液。又如盛于试管内的培养基以 1．05kg/cm2 ,121．3℃灭菌 20 分钟即可,而盛于 大瓶内的培养基最好以 1．05kg/cm2 灭菌 30 分钟。 蒸汽压力所用单位为kg/cm2 (千克/厘米2 ) 实验室中常用的高压蒸汽灭菌锅有立式、卧式和手提式等几种。 三、实验器材 1．器材 试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、培养基、分装器、天平、牛角匙、 高压蒸汽灭菌锅、pH 度纸、棉花、牛皮纸、记号笔、麻绳、纱布、吸管、培 养皿、电烘箱、注射器、微孔滤膜过滤器、镊子等。 2．试剂 牛肉膏、蛋白胨、NaCl、琼脂 四、实验流程 称药品→溶解→调 pH 值→融化琼脂→过滤分装→包扎标记→灭菌→摆斜面或倒 平板 五、实验步骤 1．培养基的制备 1）称量药品 根据培养基配方依次准确称取各种药品，放入适当大小的烧杯中，琼脂不要 加入。蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速。 2） 溶解 用量筒取一定量(约占总量的 1/2)蒸馏水倒入烧杯中，在放有石棉网的电炉 上小火加热，并用玻棒搅拌，以防液体溢出。待各种药品完全溶解后，停止加热， 6
补足水分。如果配方中有淀粉，则先将淀粉用少量冷水调成糊状，并在火上加热 搅拌，然后加足水分及其它原料，待完全溶化后，补足水分。 3)调节pH 根据培养基对pH的要求，用5%NaOH或S%HC1溶液调至所需pH。测定 pH可用pH试纸或酸度计等。 4)溶化琼脂 固体或半固体培养基须加入一定量琼脂。琼脂加入后，置电炉上一面搅拌一 面加热，直至琼脂完全融化后才能停止搅拌，并补足水分（水需预热）。注意控制 火力不要使培养基溢出或烧焦。 5)过滤分装 先将过滤装置安装好。如果是液体培养基，玻璃漏斗中放一层滤纸，如果是 固体或半固体培养基，则需在漏斗中放多层纱布，或两层纱布夹一层薄薄的脱脂 棉趁热进行过滤。过滤后立即进行分装。分装时注意不要使培养基沾染在管口或 瓶口，以免浸湿棉塞，引起污染。液体分装高度以试管高度的14左右为宜。固 体分装装量为管高的15，半固体分装试管一般以试管高度的1/3为宜：分装三 角瓶，其装量以不超过三角瓶容积的一半为宜。 6)包扎标记 培养基分装后加好棉塞或试管帽，再包上一层防潮纸，用棉绳系好。在包装 纸上标明培养基名称，制备组别和姓名、日期等。 7)灭菌 上述培养基应按培养基配方中规定的条件及时进行灭菌。普通培养基为121 ℃20min,以保证灭菌效果和不损伤培养基的有效成份。培养基经灭菌后，如需 要作斜面固体培养基，则灭菌后立即摆放成斜面，斜面长度一般以不超过试管长 度的12为宜：半固体培养基灭菌后，垂直冷凝成半固体深层琼脂。 8)倒平板 将需倒平板的培养基，于水浴锅中冷却到45~50℃，立刻倒平板 2.高压灭菌操作步骤 1)首先将内层灭菌桶取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角搁架相平为 宜。 7
补足水分。如果配方中有淀粉，则先将淀粉用少量冷水调成糊状，并在火上加热 搅拌，然后加足水分及其它原料，待完全溶化后，补足水分。 3）调节 pH 根据培养基对 pH 的要求，用 5%NaOH 或 5%HC1 溶液调至所需 pH。测定 pH 可用 pH 试纸或酸度计等。 4）溶化琼脂 固体或半固体培养基须加入一定量琼脂。琼脂加入后，置电炉上一面搅拌一 面加热，直至琼脂完全融化后才能停止搅拌，并补足水分(水需预热)。注意控制 火力不要使培养基溢出或烧焦。 5） 过滤分装 先将过滤装置安装好。如果是液体培养基，玻璃漏斗中放一层滤纸，如果是 固体或半固体培养基，则需在漏斗中放多层纱布，或两层纱布夹一层薄薄的脱脂 棉趁热进行过滤。过滤后立即进行分装。分装时注意不要使培养基沾染在管口或 瓶口，以免浸湿棉塞，引起污染。液体分装高度以试管高度的 1/4 左右为宜。固 体分装装量为管高的 1/5，半固体分装试管一般以试管高度的 1/3 为宜；分装三 角瓶，其装量以不超过三角瓶容积的一半为宜。 6）包扎标记 培养基分装后加好棉塞或试管帽，再包上一层防潮纸，用棉绳系好。在包装 纸上标明培养基名称，制备组别和姓名、日期等。 7）灭菌 上述培养基应按培养基配方中规定的条件及时进行灭菌。普通培养基为 121 ℃ 20min，以保证灭菌效果和不损伤培养基的有效成份。培养基经灭菌后，如需 要作斜面固体培养基，则灭菌后立即摆放成斜面，斜面长度一般以不超过试管长 度的 1/2 为宜；半固体培养基灭菌后，垂直冷凝成半固体深层琼脂。 8）倒平板 将需倒平板的培养基，于水浴锅中冷却到 45～50℃,立刻倒平板 2．高压灭菌操作步骤 1）首先将内层灭菌桶取出,再向外层锅内加入适量的水,使水面与三角搁架相平为 宜。 7
2)放回灭菌桶，并装入待灭菌物品。注意不要装得太挤，以免防碍蒸汽流通而影响 灭菌效果。三角烧瓶与试管口端均不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而 透入棉塞。 3)加盖，并将盖上的排气软管插入内层灭菌桶的排气槽内。再以两两对称的方式 同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致勿使漏气。 4)用电炉或煤气加热，并同时打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷空气。待冷空 气完全排尽后，关上排气阀，让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升。当锅内压 力升到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。本实验用1.05kgcm2,121.3 ℃，20分钟灭菌。 5)灭菌所需时间到后，切断电源或关闭煤气，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表 的压力降至0时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。如果压力未降到 0时，打开排气阀，就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平 衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染。 6)将取出的灭菌培养基放入37℃温箱培养24小时，经检查若无杂菌生长，即可待 用。 六、实验结果 检查培养基灭菌是否彻底， 七、注意事项 1.要严格按配方配制 2.调pH不要过头。 3.干热灭菌要注意物品不要堆放过紧，注意温度的时间控制，70°C以下放物、 取物。 4.高压灭菌要注意物品不要过多，加热后排除冷空气，到时降压回零取物。 5.过滤除菌要注意各部件灭菌，压滤时，压力要适当，不可太猛太快，滤膜要 注意清洗保存。 八、思考题 1.培养基配好后，为什么必须立即灭菌？如何检查灭菌后的培养基是无菌的？
2）放回灭菌桶,并装入待灭菌物品。注意不要装得太挤,以免防碍蒸汽流通而影响 灭菌效果。三角烧瓶与试管口端均不要与桶壁接触,以免冷凝水淋湿包口的纸而 透入棉塞。 3）加盖,并将盖上的排气软管插入内层灭菌桶的排气槽内。再以两两对称的方式 同时旋紧相对的两个螺栓,使螺栓松紧一致,勿使漏气。 4）用电炉或煤气加热,并同时打开排气阀,使水沸腾以排除锅内的冷空气。待冷空 气完全排尽后,关上排气阀,让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升。当锅内压 力升到所需压力时,控制热源,维持压力至所需时间。本实验用 1．05kg/cm2,121．3 ℃,20 分钟灭菌。 5）灭菌所需时间到后,切断电源或关闭煤气,让灭菌锅内温度自然下降,当压力表 的压力降至 0 时,打开排气阀,旋松螺栓,打开盖子,取出灭菌物品。如果压力未降到 0 时,打开排气阀,就会因锅内压力突然下降,使容器内的培养基由于内外压力不平 衡而冲出烧瓶口或试管口,造成棉塞沾染培养基而发生污染。 6）将取出的灭菌培养基放入 37℃温箱培养 24 小时,经检查若无杂菌生长,即可待 用。 六、实验结果 检查培养基灭菌是否彻底。 七、注意事项 1．要严格按配方配制。 2．调 pH 不要过头。 3．干热灭菌要注意物品不要堆放过紧，注意温度的时间控制，70ºC 以下放物、 取物。 4.高压灭菌要注意物品不要过多，加热后排除冷空气，到时降压回零取物。 5．过滤除菌要注意各部件灭菌，压滤时，压力要适当，不可太猛太快，滤膜要 注意清洗保存。 八、思考题 1．培养基配好后，为什么必须立即灭菌?如何检查灭菌后的培养基是无菌的? 8
2.在配制培养基的操作过程中应注意些什么问题？为什么？ 3.培养微生物的培养基应具备哪些条件？为什么？ 4.培养基的配制原则是什么？ 5.高压蒸汽灭菌开始之前，为什么要将锅内冷空气排尽？ 6.灭菌完毕后，为什么要待压力降到0时才能打开排气阀，开盖取物？ 7.在使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时，怎样杜绝一切不安全的因素？ 附件各种细菌培养基配方 1.细菌培养基 配方一牛肉青琼脂培养基 牛肉膏0.3克蛋白胨1.0克 氯化钠0.5克琼脂1.5克 水1000毫升 在烧杯内加水100毫升，放入牛肉膏、蛋白胨和氯化钠，用蜡笔在烧杯外作 上记号后，放在火上加热。待烧杯内各组分溶解后，加入琼脂，不断搅拌以免粘 底。等琼脂完全溶解后补足失水，用10%盐酸或10%的氢氧化钠调整pH值到 7.2~7.6,分装在各个试管里，加棉花塞，用高压蒸汽灭菌20分钟。 配方二马铃薯培养基 取新鲜牛心（除去脂肪和血管）250克，用刀细细剁成肉末后，加入500毫 升蒸馏水和5克蛋白胨。在烧杯上做好记号，煮沸，转用文火炖2小时。过滤， 滤出的肉末干燥处理，滤液p州值调到7.5左右。每支试管内加入10毫升肉汤和 少量碎末状的干牛心，灭菌，备用。 配方三根瘤菌培养基 葡萄糖10克磷酸氢二钾0.5克 碳酸钙3克硫酸镁 0.2克 酵母粉0.4克琼脂20克 水1000毫升1%结晶紫溶液1毫升 先把琼脂加水煮沸溶解，然后分别加入其他组分，搅拌使溶解后，分装，灭 菌，备用。 2.放线菌培养基
2．在配制培养基的操作过程中应注意些什么问题?为什么? 3．培养微生物的培养基应具备哪些条件?为什么? 4．培养基的配制原则是什么? 5．高压蒸汽灭菌开始之前,为什么要将锅内冷空气排尽？ 6．灭菌完毕后,为什么要待压力降到 0 时才能打开排气阀,开盖取物？ 7．在使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时,怎样杜绝一切不安全的因素？ 附件 各种细菌培养基配方 1．细菌培养基 配方一 牛肉膏琼脂培养基 牛肉膏 0.3 克 蛋白胨 1.0 克 氯化钠 0.5 克 琼脂 1.5 克 水 1000 毫升 在烧杯内加水 100 毫升，放入牛肉膏、蛋白胨和氯化钠，用蜡笔在烧杯外作 上记号后，放在火上加热。待烧杯内各组分溶解后，加入琼脂，不断搅拌以免粘 底。等琼脂完全溶解后补足失水，用 10%盐酸或 10%的氢氧化钠调整 pH 值到 7.2～7.6,分装在各个试管里，加棉花塞，用高压蒸汽灭菌 20 分钟。 配方二 马铃薯培养基 取新鲜牛心（除去脂肪和血管）250 克，用刀细细剁成肉末后，加入 500 毫 升蒸馏水和 5 克蛋白胨。在烧杯上做好记号，煮沸，转用文火炖 2 小时。过滤， 滤出的肉末干燥处理，滤液 pH 值调到 7.5 左右。每支试管内加入 10 毫升肉汤和 少量碎末状的干牛心，灭菌，备用。 配方三 根瘤菌培养基 葡萄糖 10 克 磷酸氢二钾 0.5 克 碳酸钙 3 克 硫酸镁 0.2 克 酵母粉 0.4 克 琼脂 20 克 水 1000 毫升 1%结晶紫溶液 1 毫升 先把琼脂加水煮沸溶解，然后分别加入其他组分，搅拌使溶解后，分装，灭 菌，备用。 2.放线菌培养基 9
配方一淀粉琼脂培养基（高氏培养基） 可溶性淀粉2克硝酸钾0.1克 磷酸氢二钾0.05克氯化钠0.05克 硫酸镁0.05克硫酸亚铁0.001克 琼脂2克水1000毫升 先把淀粉放在烧杯里，用5毫升水调成糊状后，倒入95毫升水，搅匀后加 入其他药品，使它溶解。在烧杯外做好记号，加热到煮沸时加入琼脂，不停搅拌 待琼脂完全溶解后，补足失水。调整pH值到7.2~7.4，分装后灭菌，备用。 配方二面粉琼脂培养基 面粉60克琼脂20克 水1000毫升 把面粉用水调成糊状，加水到500毫升，放在文火上煮30分钟。另取500 毫升水，放入琼脂，加热煮沸到溶解后，把两液调匀，补充水分，调整pH值到 7.4,分装，灭菌，备用。 3.真菌培养基 配方一萨市(Sabouraud's)培养基 蛋白胨10克琼脂20克 麦芽糖40克水1000毫升 先把蛋白胨、琼脂加水后，加热，不断搅拌，待琼脂溶解后，加入40克麦 芽糖（或葡萄糖），搅拌，使它溶解，然后分装，灭菌，备用。本培养菌是培 养许多种类真菌所常用的。 配方二马铃薯糖琼脂培养基 把马铃薯洗净去皮，取200克切成小块，加水1000毫升，煮沸半小时后， 补足水分。在滤液中加入10克琼脂，煮沸溶解后加糖20克（用于培养霉菌的加 入蔗糖，用于培养酵母菌的加入葡萄糖)，补足水分，分装，灭菌，备用。 把这培养基的pH值调到7,2~7.4，配方中的糖，如用葡萄糖还可用来培养放线 菌和芽孢杆菌。 配方三黄豆芽汁培养基 黄豆芽100克琼脂15克
配方一 淀粉琼脂培养基（高氏培养基） 可溶性淀粉 2 克 硝酸钾 0.1 克 磷酸氢二钾 0.05 克 氯化钠 0.05 克 硫酸镁 0.05 克 硫酸亚铁 0.001 克 琼脂 2 克 水 1000 毫升 先把淀粉放在烧杯里，用 5 毫升水调成糊状后，倒入 95 毫升水，搅匀后加 入其他药品，使它溶解。在烧杯外做好记号，加热到煮沸时加入琼脂，不停搅拌， 待琼脂完全溶解后，补足失水。调整 pH 值到 7.2～7.4，分装后灭菌，备用。 配方二 面粉琼脂培养基 面粉 60 克 琼脂 20 克 水 1000 毫升 把面粉用水调成糊状，加水到 500 毫升，放在文火上煮 30 分钟。另取 500 毫升水，放入琼脂，加热煮沸到溶解后，把两液调匀，补充水分，调整 pH 值到 7.4，分装，灭菌，备用。 3. 真菌培养基 配方一 萨市（Sabouraud's）培养基 蛋白胨 10 克 琼脂 20 克 麦芽糖 40 克 水 1000 毫升 先把蛋白胨、琼脂加水后，加热，不断搅拌，待琼脂溶解后，加入 40 克麦 芽糖（或葡萄糖），搅拌，使它溶解，然后分装，灭菌，备用。 本培养菌是培 养许多种类真菌所常用的。 配方二 马铃薯糖琼脂培养基 把马铃薯洗净去皮，取 200 克切成小块，加水 1000 毫升，煮沸半小时后， 补足水分。在滤液中加入 10 克琼脂，煮沸溶解后加糖 20 克（用于培养霉菌的加 入蔗糖，用于培养酵母菌的加入葡萄糖），补足水分，分装，灭菌，备用。 把这培养基的 pH 值调到 7.2～7.4，配方中的糖，如用葡萄糖还可用来培养放线 菌和芽孢杆菌。 配方三 黄豆芽汁培养基 黄豆芽 100 克 琼脂 15 克 10